多光子共聚焦扫描显微镜的原理以及应用

多光子共聚焦扫描显微镜的原理以及应用

多光子共聚焦显微镜是光学显微镜的重大改进，主要表现为可以观

察活细胞、固定细胞和组织的深层结构，并且可以得到清晰锐利的

多层Z平面结构，即光学切片，并以此可以构建标本的三维实体结构。共聚焦显微镜采用激光光源，经过扩充后充满整个物镜后焦平面，然后经过物镜的透镜系统，在标本的焦平面上会聚成非常小的点。根据物镜数值孔径不同，最亮照明点直径大小约0.25 ~ 0.8μm，深度约0.5 ~ 1.5μm。共聚焦点大小决定于显微镜设计、激光

波长、物镜特性、扫描单元状态设定和标本性质。场式显微镜的照

明范围和照明深度都很大，而共聚焦显微镜的照明则集中到焦平面

上的一个精确的焦点上。共聚焦显微镜最基本的优点是可以对厚荧

光标本（可以达到50 μm或以上）进行精细的光学切片，切片的厚度约为0.5到1.5μm。系列光学切片图像可以通过精确的显微镜Z

轴步进马达上下移动标本获得。图像信息的采集被控制在精确的平

面内，而不会被位于标本上其他位置发出的信号干扰。在去除背景

荧光影响和增加信噪比后，共聚焦图像的对比度和分辨率比传统场

式照明荧光图像有明显的提高。在很多标本中，许多错综的结构成

分相互交织构成复杂的系统，仅用几张光学切片很难还原标本本身

的结构特征，但是一旦能够采集到足够的光学切片，我们就能通过

软件对其进行三维重建。这种实验方法已经被广泛应用与生物学研

究中，用来阐明细胞或组织之间复杂的结构和功能关系。

与传统光学显微镜相比，多光子共聚焦显微镜具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点。所

以它问世以来在生物学的研究领域中得到了广泛应用。在对生物样

品的观察中，多光子显微镜有其优越性：对活细胞和组织或细胞切

片进行连续扫描，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞

膜系统的三维图像。可以得到比普通荧光显微镜更高对比度、高解

析度图象、同时具有高灵敏度、杰出样品保护。多维图象的获得，

如7 维图象(XYZaλIt): xyt、xzt和xt 扫描,时间序列扫描旋转

扫描、区域扫描、光谱扫描、同时方便进行图像处理。细胞内离子

荧光标记，单标记或多标记，检测细胞内如PH和钠、钙、镁等离子浓度的比率测定及动态变化。荧光标记探头标记的活细胞或切片标

本的活细胞生物物质，膜标记、免疫物质、免疫反应、受体或配体，核酸等观察；可以在同一张样品上进行同时多重物质标记，同时观察。对细胞检测无损伤、精确、准确、可靠和优良重复性；数据图

像可及时输出或长期储存。

当前，激光共聚焦显微镜较广泛应用的研究领域有：细胞生物学：

如：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结

构和分布变化、细胞凋亡机制；各种细胞器、结构性蛋白、DNA、RNA、酶和受体分子等细胞特异性结构的含量、组分及分布进行定量分析；DNA、RNA含量、利用特定的抗体对紫外线引起的DNA损伤进

行观察和定量；分析正常细胞和癌细胞骨架与核改变之间的关系；

细胞黏附行为等。生物化学：如酶、核酸、受体分析、荧光原位杂交、杂色体基因定位等，利用共聚焦技术可以取代传统的核酸印迹

染交等技术，进行基因的表达检测，使基因的转录、翻译等检测变

的更加简单、准确。药理学：如药物对细胞的作用及其动力学；药

物进入细胞的动态过程、定位分布及定量。生理学、发育生物学：

如膜受体、离子通道、离子含量、分布、动态；动物发育以及胚胎

的形成，骨髓干细胞的分化行为；细胞膜电位的测量，荧光漂白恢

复（FRAP）的测量等。遗传学和组胚学：如细胞生长、分化、成熟

变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断。神经

生物学：如神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递。微生物

学和寄生虫学：如细菌、寄生虫形态结构。病理学及病理学临床应用：如活检标本的快速诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病的诊断。

免疫学、环境医学和营养学：如免疫荧光标记（单标、双标或三标）的定位，细胞膜受体或抗原的分布,微丝、微管的分布、两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位；对活细胞中的蛋白

质进行准确定位及动态观察可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、

分裂、分化过程中的时空表达。