基于核酸杂交的病毒基因组特异性纯化富集方法的初步研究重点
分子诊断学之核酸分子杂交技术-医学检验
» 核酸分子杂交（nucleic acid hybridization）
是指用标记的已知DNA或RNA片段检测样品中未 知核酸序列，通过碱基互补配对原则发生同源性结合 ，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置 或大小显示出来。
» 探针( probe )
带有可检测标记的已知序列的DNA或RNA片段。 Institute of Genetic Engineering
分子克隆基本过程：
切 转
分 切 接
筛
Institute of Genetic Engineering
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分子诊断学
核酸分子杂交技术
Nucleic Acid Hybridization Technology
Institute of Genetic Engineering
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影响复性速度的因素：
DNA浓度 DNA片段的大小 DNA片段复杂性 合适的复性温度 适当的离子强度
Institute of Genetic Engin1e7ering
二、核酸分子杂交的技术原理
在DNA复性过程中，如果把不同 DNA单链分子放在同一溶液中， 或把DNA与RNA放在一起，只要 在DNA或RNA的单链分子之间有 一定的碱基配对关系，就可以在 不同的分子之间形成杂化双链 (heteroduplex) 。
检测对象: 克隆化的基因组DNA，细胞总DNA、总RNA
。杂交方法不同，被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细 胞内杂交, 即细胞原位杂交。
核酸分子杂交特点：高度的灵敏性、特异性
应用：克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特
核酸的分子杂交技术及其应用
核酸的分子杂交技术及其应用核酸的分子杂交技术及其应用1概述核酸的分子杂交(molecular hybridization)技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列片段的有力工具。
它是利用核酸分子的碱基互补原则而发展起来的。
在碱性环境中加热或加入变性剂等条件下，双链DNA之间的氢键被破坏(变性)，双链解开成两条单链。
这时加入异源的DNA或RNA(单链)并在一定离子强度和温度下保温(复性)，若异源DNA或RNA之间的某些区域有互补的碱基序列，则在复性时可形成杂交的核酸分子。
在进行分子杂交技术时，要用一种预先分离纯化的已知RNA或DNA序列片段去检测未知的核酸样品。
作为检测工具用的已知RNA 或DNA序列片段称为杂交探针(probe)。
它常常用放射性同位素来标记。
虽然核酸分子杂交技术的应用仅有二十多年的历史，但它在核酸的结构和功能的研究中作出了重要贡献，在基因的表达调控和物种的亲缘关系研究中也发挥重要作用。
而且，随着核酸探针制备及标记技术的丰富和完善以及以不同材料为支持物的固相杂交技术的发展，使核酸分子杂交技术在分子生物学领域中的应用更加广泛。
这里我们将就分子杂交技术的几个主要过程及其应用进行介绍。
2核酸探针的制备核酸分子杂交的灵敏性主要依赖杂交探针的放射性比活度。
比活度高就可提高反应的灵敏性，减少待测样品的用量。
目前一般所用的是体外标记，这里介绍几种最常用的方法：2.1DNA的切口平移双链DNA分子的一条链有切口时，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ可把核苷酸残基加到切口处的3’端，同时由于此酶具有5’→3’外切核酸酶活性，它还可从5’端除去核苷酸。
这样5’端核苷酸的去除与3’端核苷酸的加入同时进行，导致切口沿着DNA链移动，称切口平移(nicktranslation)。
常用于在双链DNA 上打开切口的酶为胰DNA酶Ⅰ。
由于高放射性比活度的核苷酸置换了原有核苷酸，就有可能制备比活度大于108计数/(分.μg)的32P标记的DNA探针。
核酸分子杂交技术 ppt课件
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一、常见的核酸探针
（一）基因组DNA探针
基因组DNA探针的制备是将染色体DNA通过超声击断或限制性内 切酶不完全水解，获得许多染色体 DNA的随机片段，选择长度约 15-20kb的DNA片段重组到λ 噬菌体中，经体外包装感染大肠杆菌， 在固体培养基上形成许多噬菌斑。筛选出含目的基因的重组体后， 将目的基因 DNA片段再次亚克隆到大肠杆菌质粒中保存，以便需 要时扩增。 基因组DNA制备还可以通过 PCR扩增基因组DNA的特定片段，然 后将其克隆到大肠杆菌质粒中保存。由于真核基因组含有不编码的 内含子序列，因此，真核基因组 DNA 探针用于检测基因表达时杂 交效率要明显低于cDNA探针。
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(3) 酶
常用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶对核酸探针进行标记。
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(4) 荧光素
异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），最大吸收波 长为490nm～495nm，最大发射波长为520nm～530nm，呈黄绿色 荧光， 四乙基罗达明：最大吸收波长为570nm，最大发射波长为595～ 600nm，呈橙红色荧光。
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二、核酸分子杂交的基本原理
根据核酸变性和复性的原理，不同来 源的 DNA 变性后，若这些异源 DNA 之间存在某些相同序列的区域，在退 火条件下则可形成DNA-DNA异源双 链；或将变性的单链 DNA 与 RNA 经 复性处理可以形成DNA-RNA杂合双 链。这种不同来源的单链核酸分子在 合适的条件下，通过碱基互补形成双 链杂交体的过程称为核酸分子杂交 （molecular hybridization）。
分子生物学检验技术试题及答案
分子生物学检验技术试题及答案一、选择题（每题2分，共20分）1. 以下哪个不是分子生物学常用的检测技术？A. PCRB. 凝胶电泳C. 免疫组化D. 核酸杂交2. 基因克隆中，常用的载体是：A. 质粒B. 病毒C. 染色体D. 线粒体3. 在分子生物学中，用于扩增DNA片段的技术是：A. 逆转录B. 转录C. 翻译D. PCR4. 以下哪个是真核生物的基因表达调控元件？A. 启动子B. 内含子C. 外显子D. 终止子5. 以下哪个不是DNA测序技术？A. Sanger测序B. 焦磷酸测序C. 凝胶电泳D. 单分子测序二、填空题（每空1分，共10分）6. 核酸分子杂交技术中，常用的标记物有_________、_________等。
7. 基因工程中，用于将目的基因导入受体细胞的方法有_________、_________等。
8. 基因编辑技术CRISPR-Cas9中，Cas9是一种_________。
9. 真核生物的基因表达调控中，mRNA的加工包括5'端加帽、3'端加尾和_________。
10. 蛋白质的分离和纯化技术中，常用的方法有电泳、层析和_________。
三、简答题（每题10分，共20分）11. 简述PCR技术的原理及其在分子生物学中的应用。
12. 描述核酸分子杂交技术的基本原理及其在基因检测中的应用。
四、论述题（每题15分，共30分）13. 论述基因克隆的一般步骤及其在生物技术研究中的重要性。
14. 讨论基因编辑技术CRISPR-Cas9的优势和潜在的伦理问题。
五、实验设计题（每题20分）15. 设计一个实验方案，用于检测某种疾病相关基因的突变情况。
答案：1. C2. A3. D4. A5. C6. 放射性同位素、荧光标记7. 转化、转染8. 核酸酶9. 剪接10. 沉淀11. PCR技术的原理是利用DNA聚合酶在特定温度条件下对目标DNA序列进行循环扩增。
它在分子生物学中的应用包括基因克隆、基因表达分析、遗传病诊断等。
核酸杂交技术的原理和应用
核酸杂交技术的原理和应用介绍核酸杂交技术是一种利用互补配对原理来检测和分析核酸序列的重要技术。
它广泛应用于基因组学、遗传学、分子生物学和生物医学等领域。
本文将介绍核酸杂交技术的原理和应用，并通过列点方式详细解释。
核酸杂交技术的原理1.互补配对原理：核酸分子由碱基组成，DNA分子中的腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）以及鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）之间可以形成互补配对，RNA 分子中的腺嘌呤（A）和尿嘧啶（U）以及鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）之间也可以形成互补配对。
核酸杂交技术利用这种互补配对原理，根据核酸序列的互补性进行分析。
2.杂交反应：核酸杂交反应是指两条互补的核酸序列在合适的条件下发生结合。
在适当的盐浓度和温度下，核酸链会解开，使碱基的互补配对能够进行。
通过控制反应条件，可以选择性地使核酸链发生杂交反应，从而检测特定的核酸序列。
3.标记物的应用：核酸杂交技术通常需要使用标记物来检测杂交反应的结果。
常用的标记物包括放射性同位素、荧光染料和酶等。
这些标记物可以与杂交的核酸序列结合，通过测量标记物产生的放射性、荧光或酶活性变化来分析核酸杂交反应的结果。
核酸杂交技术的应用1.基因组学研究：核酸杂交技术在基因组学研究中发挥了重要作用。
通过杂交探针，可以检测到不同组织和生物体中的特定基因表达情况，从而深入研究基因调控网络和功能。
此外，核酸杂交技术还可以用于研究基因组的结构和变异。
2.遗传学分析：核酸杂交技术是遗传学分析的重要工具之一。
通过对不同个体的核酸序列进行杂交反应，可以检测到基因型差异和基因变异等关键信息。
这对于遗传性疾病的诊断和研究具有重要意义。
3.分子生物学研究：核酸杂交技术在分子生物学研究中也得到了广泛应用。
它可以用于检测、定位和分析特定核酸序列，从而揭示细胞和分子水平上的生物学过程。
例如，在研究基因表达调控、蛋白质合成和RNA修饰等方面，核酸杂交技术发挥了重要作用。
4.生物医学应用：核酸杂交技术在生物医学领域也有广泛的应用。
分子生物学知识重点
分子生物学一、名词解释1.ORF答:ORF是open reading frame的缩写，即开放阅读框架。
在DNA链上，由蛋白质合成的起始密码开始，到终止密码为止的一个连续编码列，叫做一个开放阅读框架。
2.结构基因答：结构基因（structural genes）可被转录形成mRNA,并翻译成多肽链，构成各种结构蛋白质或催化各种生化反应的酶和激素等。
3.断裂基因答：基因是核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位，一个基因不仅仅包括编码蛋白质或 RNA 的核酸序列，还包括保证转录所必需的调控序列、位于编码区 5 ' 端与 3 ' 端的非编码序列和内含子。
真核生物的结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因（split gene）。
4.选择性剪接答：选择性剪接（也叫可变剪接）是指从一个mRNA前体中通过不同的剪接方式（选择不同的剪接位点组合）产生不同的mRNA剪接异构体的过程，而最终的蛋白产物会表现出不同或者是相互拮抗的功能和结构特性，或者，在相同的细胞中由于表达水平的不同而导致不同的表型。
5.C值答：基因组的大小通常以其DNA的含量来表示，我们把一种生物体单倍体基因组DNA的总量成为C值（C value）。
6.生物大分子答：生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。
常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂类、糖类。
7.酚抽提法答：酚抽提法最初于1976年由Stafford及其同事提出，通过改良，以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获得所需的DNA样品。
8.凝胶过滤层析答：凝胶过滤层析也称分子排阻层析或分子筛层析，利用凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。
第六章核酸的分离与纯化
三、鉴定、保存与应用
（一）核酸的鉴定
1．浓度鉴定核酸浓度的定量鉴定可通过紫外分光光度法与荧光光度法进行。
（1）紫外分光光度法：紫外分光光度法是基于核酸分子成分中的碱基均具有一定的紫外线吸收特性，最大吸收波长在250nm～270nm之间。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收波长不变。由核苷酸组成核酸后，其最大吸收波长为260nm，该物理特性为测定溶液中核酸的浓度奠定了基础。在波长260nm的紫外线下，1个OD值的光密度大约相当于50µg/ml的双链DNA，38µg/ml的单链DNA或单链RNA，33µg/ml的单链寡聚核苷酸。如果要精确定量已知序列的单链寡核苷酸分子的浓度，就必须结合其实际分子量与摩尔吸光系数，根据朗伯-比尔定律进行计算。若DNA样品中含有盐，则会使A260的读数偏高，尚需测定A310以扣除背景，并以A260与A310的差值作为定量计算的依据。紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25µg/ml的核酸溶液。
2．纯度鉴定紫外分光光度法还是荧光光度法，均可用于核酸的纯度鉴定。
生化考试复习题汇总及答案整理
⽣化考试复习题汇总及答案整理核酸化学及研究⽅法⼀、名词解释1.正向遗传学：通过研究突变表型确定突变基因的经典遗传学⽅法。
2.核⼩体组蛋⽩修饰：组成核⼩体组蛋⽩，其多肽链的N末端游离于核⼩体之外，常被化学基团修饰，修饰类型包括：⼄酰化、甲基化、磷酸化和泛素化，修饰之后会改变染⾊质的结构和活性。
3.位点特异性重组：位点特异性重组是遗传重组的⼀类。
这类重组依赖于⼩范围同源序列的联会，重组只发⽣在同源短序列的范围之内，需要位点特异性的蛋⽩质分⼦参与催化。
4.转座机制：转座酶上两个不同亚基结合在转座⼦的特定序列上，两个亚基靠在⼀起形成有活性的⼆聚体，切下转座⼦，转座酶-转座⼦复合物结合到靶DNA上，通过转座酶的催化将转座⼦整合到新位点上。
5.基因敲除：利⽤DNA同源重组原理，⽤设计的外源同源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的靶基因发⽣重组，从⽽将外源DNA整合到受体细胞的基因组中，产⽣精确的基因突变，完成基因敲除。
6.Sanger双脱氧终⽌法：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在的条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按⽐例引⼊四种双脱氧碱基，若双脱氧碱基掺⼊链端，该链便停⽌延长，若单脱氧碱基掺⼊链端，该链便可继续延伸。
如此每管反应体系中便合成了以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的⼀系列长度不等的核酸⽚段。
反应终⽌后，分四个泳道进⾏电泳，以分离长短不⼀的核酸⽚段（长度相邻者仅差⼀个碱基），根据⽚段3’的双脱氧碱基，便可依次阅读合成⽚段的碱基排列顺序。
7.荧光实时PCR技术原理探针法：TaqMan探针是⼀⼩段可以与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA，它的5’和3’端分别带有⼀个荧光基团，这两个荧光基团由于距离过近，相互发⽣淬灭，不产⽣绿⾊荧光。
PCR反应开始后，靶DNA变性，产⽣单链DNA，TaqMan探针结合到与之配对的靶DNA序列上，之后被Taq DNA聚合酶切除降解，从⽽解除荧光淬灭，荧光基团在激发光下发出荧光，最后可根据荧光强度计算靶DNA的数量。
临床医学检验：分子生物学检验技术试题及答案预测题
临床医学检验：分子生物学检验技术试题及答案预测题1、单选用下列方法进行重组体的筛选，哪项说明外源基因进行了表达() A．Southern印迹杂交B．Northern印迹杂交C．原位菌落杂交D．Western（江南博哥）印迹E．基因芯片技术正确答案：D2、名词解释退火正确答案：指将温度降至引物的TM值左右或以下，引物与DNA摸板互补区域结合形成杂交链。
3、填空题核酸分子杂交可分为：________________、________________、_____________________。
正确答案：DNA与DNA杂交；DNA与RNA杂交；RNA与RNA杂交4、名词解释细胞癌基因正确答案：存在于正常的细胞基因组中，与病毒癌基因有同源序列，具有促进正常细胞生长、增殖、分化和发育等生理功能。
在正常细胞内未激活的细胞癌基因叫原癌基因，当其受到某些条件激活时，结构和表达发生异常，能使细胞发生恶性转化。
5、判断题原位杂交常用来直接检测细胞或组织中的DNA或RNA()正确答案：错6、单选基因异常表达检测的技术是()A．荧光定量PCR技术B．western印迹技术C．Southern电泳技术D．原位杂交技术E．cDNA表达芯片技术正确答案：E7、问答题描述HIV的复制过程。
正确答案：HIV病毒属于双正链RNA病毒。
其复制是一个特殊而复杂的过程。
首先，HIV病毒体的包膜糖蛋白刺突先与细胞上的特异性受体结合，然后病毒包膜与细胞膜发生融合。
其次，核衣壳进入细胞质内脱壳释放其核心RNA以进行复制。
病毒的逆转录酶以病毒RNA为模板，合成负链DNA，构成RNA：DNA中间体，RNA链由RNA酶H水解去除，然后再由负链DNA合成正链DNA，并形成双链DNA，此时基因组的两端形成LT序列，并由细胞质移行到细胞核内。
再次，在病毒整合酶的作用下，病毒基因组整合到宿主染色体中，这种整合了病毒双链DNA称为前病毒。
当病毒活化时在LTR作用下进行自身转录。
核酸的杂交名词解释生物化学
核酸的杂交名词解释生物化学
核酸杂交 (Hybridization) 是一种重要的生物化学技术，用于检测和分析目标序列或分子。
它基于核苷酸之间的互补配对原则，通过将目标序列或分子与已知序列进行杂交，形成稳定的双链分子，从而实现检测、分离和纯化目标序列或分子的目的。
核酸杂交的基本原理是，将目标序列或分子与一个核苷酸序列进行杂交，该核苷酸序列是已知的，且与目标序列或分子具有高度互补性。
在杂交过程中，通过 Watson-Crick 碱基配对形成非共价键，从而使两条核酸单链结合成双链分子。
杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹杂交。
根据检测样品的不同，杂交技术又被分为 DNA 印迹杂交和 RNA 印迹杂交。
核酸杂交技术在生物医学研究、基因诊断、生物制药等领域得到了广泛应用。
它可以帮助研究者识别新基因、分析基因结构、检测基因突变、筛选药物等。
此外，核酸杂交技术还可以用于核酸检测、细胞学检测等领域。
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全转录组扩增（ｗｈｏｌｅ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ。ＷＴＡ）使用
Ｃｅｌｌ
ＲＥＰＬＩ－ｇ＠ＷＴＡ Ｓｉｎｇｌｅ
Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）试剂盒对样本进行
扩增。取核酸ＲＮＡ ８斗ｌ，加入３斗ｌ变性缓冲液， ９５℃加热３ ｍｉｎ，后向反应体系中加入２汕ｌ去ｇＤＮＡ 缓冲液，４２。Ｃ加热１０ ｍｉｎ；向反应体系中加入４
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】
Ｆｕｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｖｉｒａｌ
ｇｅｎｏｍｅ；Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ；Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｎｅｘｔ—Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
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积ＡＭＰｕｒｅ
Ｂｅａｄｓ进行纯化；定量后分别取１００
对应的模板ＲＮＡ。再经Ｎａｎｏｄｒｏｐ定量后，根据模板
ｎｇ纯化的三种样本核酸酶切纯化产物；应用加接头
万方数据
１．６
ｖｉｒｕｓ（ＲＶＦＶ）、Ｈｅａｒｔｌａｎｄ ｖｉｒｕｓ（ＨＬＶ）基因组序列， 应用Ｍｅｇａ ６．０软件分别对ｓ、Ｍ、Ｌ三个片段进行序 列比对，在相对保守区域，设计针对三个片段的杂交 探针。根据三个片段长度不等，分别设计出１、２、３ 条不等的探针，并应用ｐｒｉｍｇｒｐｒｉｍｉｅｒ ５．０对特异性 探针进行评价比较，由上海生物工程生物公司合成， 对探针５ ７端进行生物素修饰。
ｗａｓ
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５．５７％，６．３９％，２．７１％，ａｎｄ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ
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取收集的ＨＢ２９毒株上清使用
ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ，ＳＦＴＳＶ）
Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）按照产品说明书
为模拟样本，通过设计特异性杂交探针，建立基于磁 性微球的特异性富集纯化病毒基因组的方法。并通 过不同处理间ＳＦＴＳＶ三个片段质量比例比值及二 代测序中有效数据比例的比较，以期在测序前建库 处理中，达到纯化富集核酸样本，有效降低二代测序 非目的数据目的。 １材料与方法 １．１模拟样本的制备
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［————Ｘ—（ｇ—／斗ｌ—）—丽］×６．０２×１
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一
２３
× ３４０ ｉｎ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｉ ｒｃｓｎ ａｒｔ０
换算为拷贝数／斗ｌ，将体外转录得到的模板 ＲＮＡ，经过定量、换算和ＤＥＰＣ处理水进行１０倍梯 稀释至浓度为１０３～１０１０拷贝／斗ｌ的ＲＮＡ标准品，以 此为模板，进行荧光定量ＲＴ・ＰＣＲ检测。每个稀释 度设置３个复孑Ｌ，以得到的ＣＴ值绘制标准曲线。 １．４核酸提取
ＳＦＴＳＶ荧光定量ＰＣＲ标准曲线
用于绝对
ｔｘｌ
定量标本中的ＳＦＴＳＶ Ｓ、Ｍ、Ｌ片段的引物探针序列 来自文献［４］。使用ＡｇＰａｔｈ．ＩＤＴＭ
Ｏｎｅ．Ｓｔｅｐ ＲＴ．ＰＣＲ
Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ
逆转录／聚合酶缓冲液，２斗ｌ随机引物，１¨ｌ逆转录 酶混合液，４２。Ｃ，６０ ｍｉｎ，９５０Ｃ热失活３ ｍｉｎ，向前述 反应产物中加入８斗１连接酶缓冲液，２ Ｉｘｌ连接酶混 合液，２４℃，３０ ｒａｉｎ，９５０Ｃ热失活５ ｍｉｎ，加入２９¨ｌ，
９５℃１５ ＳＦＴＳＶ Ｓ，６００Ｃ ４５
ｍｉｎ；
ＳＣ反应缓冲液，１斗ｌ
ＲＥｐＬｌ－ｇ
Ｓｅｎｓｉ
Ｐｈｉ
ＤＮＡ聚合酶，３０℃，，２ ｈ，６５℃，热失活５ ｍｉｎ，全转录 组扩增。
１．７
Ｉｏｎ
Ｓ，４０个循环。分别利用含有
Ｔｏｒｒｅｎｔ测序将样本分别加入１．８倍体
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Ｓ、Ｍ、Ｌ片段的质粒，经体外转录得到各片段
【
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＮＧＳ）在病原体筛
查鉴定以及基因组信息相关的研究方面应用Ｅｔ趋 广泛，具有高分辨率、高敏感性和高准确性等优 点…。病３１建库提高二代测序技术的病原体筛查检测 效率，需要在测序前的样本处理、测序过程以及序 列结果分析等方面进行优化完善。本研究以负链 ＲＮＡ病毒发热伴血小板减少综合征病毒（Ｓｅｖｅｒｅ
以ＳＦＴＳＶ ＨＢ２９毒株为模
分别进行ＳＦＴＳＶ及ｖｅｒｏ细胞ＲＮＡ提取，使用 Ｎａｎｏｄｒｏｐ进行ＲＮＡ定量。二者核酸以１：３比例混 合以模拟临床样本。 １．５核酸纯化取样本核酸３
０００
ｎｇ，混于５０斗ｌ
ｍｉｎ；
漂洗／结合缓冲液中６５℃加热１０ ｍｉｎ，冰浴３
取５０斗ｌ链霉亲和素磁珠于离心管中，加入１００斗１ 漂洗结合缓冲液，涡旋漂洗，置磁场，弃上清；分别取 １０斗ｌ（８ ｐｍｏｌ／ｔｄ）生物素标记的探针，置于磁珠，室 温孵育１０ ｍｉｎ，混匀，置磁场，弃上清；将上述总 ＲＮＡ样本置于结合探针的磁珠里，杂交温度（６０。Ｃ） 下孵育３０ ｍｉｎ，混匀，置磁场，弃上清，加入１００
ＲＥｐＬｌ－ｇ
Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）在ＣＦＸ９６
Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＵＳＡ）仪器上进行荧光定量ＰＣＲ 检测。反应体系的总体积为２５ ｐ．１，引物浓度为 ０．４ｉｚｍｏｌ／１，探针浓度为０．１２ｖｍｏｌ／１，模板为５¨ｌ，其 余成分参考试剂盒说明。反应条件为９５℃１０
ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｃｏｍｐａｒｅｄ
ｔＯ
ａｆｔｅｒ ｗｈｏｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ．Ｔｈｅ ｖａｌｉｄ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ
（ＷＴＡ）ｗｅｒｅ
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ Ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｂｅｆｏｒｅ
ｇｒｏｕｐ
ｗｉｔｈｏｕｔ
ｂｏｎｄｅｄ ｗｉｔｈ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｎ
ｐｕｒｉｆｙ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅ
ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ
ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｈｏｌｅ ｆｏｒ
ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ
ｏｆ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ
ａｃｉｄ
ｏｎ
ｎｕｃｌｅｉｃ
ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
Ｗａｎｇ
Ｌｉｊｉｎｇ，Ｌｉｕ
Ｌｉｎ，Ｌｉ
Ｊｉａｎｄｏｎｇ，Ｌｉ
Ｗｅｉｈｏｎｇ，Ｚｈａｎｇ Ｓｈｏｕ，Ｌｉａｎｇ
Ｍｉｆａｎｇ，
“Ｄｅｘｉｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒ Ｖｉｒａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｅｎｔｅｒｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，
ｄｉｓｅａｓｅ（２０１３ＺＸｌ０００４．１０１）
万方数据
史堡塞堕塑蝗鏖瘟壹堂苤查！！！！生！旦釜！！鲞箜！塑垦！ｉ！竺！！兰翌鱼！ｉ！！！翌！：垒Ｐ堕！垫！！：！堂：垫！塑！：！
基因组高通量测序即二代测序技术（Ｎｅｘｔ．
Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
的碱基长度，通过相应公式
Ｙ（ｃｏｐｉｅｓ／ｌｘｌ）＝
２１２・
技术方法．
基于核酸杂交的病毒基因组特异性纯化富
集方法的初步研究
王利静 刘林 李建东 李伟红
张硕
梁米芳
李德新
１０２２０６北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 通信作者：李德新，Ｅｍａｉｌ：ｌｉｄｘ＠ｃｈｉｎａｃｄｃ．ｃｎ
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００３・９２７９．２０１６．０２．０２５
５．５７％、６．３９％、２．７１％，差别具有显著性（，＝９ ７９９．８，Ｐ＜０．００１）。对全转录组扩增前或后进行特
异性富集纯化对测序结果进行比较分析时发现，扩增后进行纯化优于扩增前（Ｐ＜０．００１）。结论
基
于核酸杂交的病毒基因组特异性富集纯化方法可有效降低二代测序中背景值，提高测序效率，具有 高通量检测前特异性纯化富集样本的作用。 【主题词】
【摘要】
目的探索实验室高通量检测前临床样本中病毒核酸特异性纯化富集的方法。方法
以负链ＲＮＡ病毒发热伴血小板减少综合征病毒（ＳＦＴＳＶ）为模拟样本，针对病毒基因组Ｓ、Ｍ和Ｌ
三个片段设计杂交探针，并进行５’端生物素修饰，与链霉亲和素修饰磁珠共价结合，纯化样本中 ＳＦＴＳＶ核酸，比较研究特异性纯化富集纯化均较不开展富集纯化有显著改善，有效数据比例分别为
ｃａｎ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
ｉｎｃｒｅａｓｅ
Ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎｄ
ｏｆ
ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅ
ｂｅｆｏｒｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ
ｔｈｅ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ
ｏｒ
ｖａｌｉｄ ｄLeabharlann ｔａ ａｎｄｇｅｎｏｍｅｃｏｖｅｒａｇｅ．Ｔｈｅ