2种方法检测非小细胞肺癌EGFR基因突变的比较

基因突变的检测方法

基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。 异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。

非小细胞肺癌T790M基因突变研究进展

·314· 中国肺癌杂志2013年6月第16卷第6期Chin J Lung Cancer, June 2013, Vol.16, No.6 ·综 述· DOI: 10.3779/j.issn.1009-3419.2013.06.08 非小细胞肺癌T790M 基因突变研究进展 李慧 张爽 综述 程颖 审校 【摘要】 携带表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR ）基因活性突变的非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC ）晚期患者使用EGFR-受体酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor, TKI ）治疗后具有较好的临床获益，但大部分患者在使用该药治疗10个月后出现耐药现象。研究发现EGFR 基因20号外显子T790M 基因突变是导致EGFR-TKI 耐药的最主要因素，但其作用机制至今未明。目前的研究结果显示T790M 基因突变是一个独立的、好的预后因素，但其能否作为EGFR-TKI 的疗效预测因子仍存在争议。近年来，针对NSCLC 肿瘤中T790M 基因突变的检测技术不断更新，针对T790M 耐药的新的治疗策略也不断涌现。本文就NSCLC 中T790M 基因突变的耐药机制、临床意义、检测方法及应对策略等方面的最新研究进展进行综述。 【关键词】 肺肿瘤；表皮生长因子受体；T790M ；酪氨酸激酶抑制剂 Advanced Research on T790M Mutation in Non-small Cell Lung Cancer Hui LI, Shuang ZHANG, Ying CHENG Department of Thoracic Oncology, Jilin Provincial Cancer Hospital, Changchun 130012, China Corresponding author: Ying CHENG, E-mail: jl.cheng@https://www.360docs.net/doc/7817296557.html, 【Abstract 】 Patients with advanced non-small cell lung cancer (NSCLC) carrying epidermal growth factor receptor (EGFR ) activating mutations benefit from EGFR-tyrosine kinase inhibitor (TKI) treatment, however, most of TKI-treated pa-tients eventually suffer drug resistant after 10-month treatments. Previous studies demonstrated that T790M mutation in exon 20 of EGFR gene would be the essential factor leading to EGFR-TKI resistance, leaving the mechanisms of which elucidative. Current research identified that T790M is an independent, favorable prognostic factor for predicting survival, but whether it is also a predictive biomarker for EGFR-TKI efficacy is still controversial. Up to date, techniques to detect T790M mutation in lung cancer have been greatly improved and the new therapeutic strategies emerged as well. In this review, we summarized the newly updated data about T790M mutation in terms of its mechanisms involved in EGFR-TKI resistant, clinical value, ad-vanced detection assays and ongoing strategies against the mutation subtype. 【Key words 】 Lung neoplasms; EGFR; T790M; TKI This study was supported by the grant from Science Foundation of Jilin Province (to Ying CHENG)(No.20110452). 本课题受吉林省自然科学基金（No.20110452）资助 作者单位：130012 长春，吉林省肿瘤医院胸部肿瘤内一科（通讯作者：程颖，E-mail: jl.cheng@https://www.360docs.net/doc/7817296557.html, ） 近年来，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC ）治疗领域里程碑式的改变是针对表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR ）基因突变阳性的晚期患者采用EGFR-酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine ki-nase inhibitor, TKI ）进行治疗。治疗获益的患者表现为无疾病进展期（progression-free survival, PFS ）延长，客观反映率（objective response rate, ORR ）提高，生活质量得到极大改善。尽管对初始EGFR-TKI 治疗应答良好，但大部分患者在平均治疗10个月后会出现对此类药物的耐药。早期的研究 [1,2] 发现，使用EGFR-TKI 治疗后进展的肿瘤 中，50%存在EGFR 基因20号外显子第790位点的突变，即T790M 基因突变。转染携带T790M 基因突变的质粒的肿瘤 细胞对EGFR-TKI 的耐药性明显增加。随后更多的研究[3] 结 果也验证了肿瘤组织中T790M 基因突变是导致EGFR-TKI 耐药最主要的机制。随着临床研究的拓展和检测技术的更新，研究者发现使用EGFR-TKI 前的NSCLC 中也存在一定 比例的de novo T790M 基因突变[4,5]，由此引发了T790M 基因 突变是获得性模式还是选择性模式的争论。此外，T790M 基因突变是否与药物疗效预测和生存预后相关以及是否是EGFR-TKI 的禁忌症等问题都还没有定论。本文总结近年来有关T790M 和EGFR-TKI 耐药方面的重要研究结果，阐述对T790M 基因突变的共识和争议之处。1 T790M 基因突变的发现及耐药机制

(3)理解基因突变的检测方法

第十章基因突变 一、教学目的与要求： （1）了解基因突变的类型和性质、特征 （2）掌握基因突变分子机理和诱变因素的作用方式 （3）理解基因突变的检测方法 (4) 掌握基因突变的修复途径 二、教学重点、难点、疑点： 1.突变的概念、类型和性质 2.诱发突变的分子基础 3.诱发突变与人类癌症 4.生物体基因突变的修复机制 5.果蝇基因突变的检出 6.植物基因突变的检出 7.人类基因突变的检出 [解决方法] （1）通过出示基因结构变化的示意图，加深学生对基因突变内涵的理解。 （2）课堂教学中不断提出问题，让学生通过概念的运用达到巩固概念和知识迁移的目的。 2．教学难点及解决办法 基因突变的原因。 [解决办法] 对人类镰刀型细胞贫血症病因结合图解进行分析，使学生真正明白基因突变的原因——DNA复制过程也可能发生差错，基因中个别碱基的变化，就会造成性状改变。 3．教学疑点及解决办法 为什么说基因突变是变异的主要来源？ [解决办法]讲明基因突变与基因重组的区别，联系实际举例。 三、教学方法设计： 四、教具或教学手段：多媒体课件 五、教学过程与板书设计：

第一节基因突变的概念和特征 一、基因突变的概念及类别 1、基因突变：指在染色体上一定位点基因内部的化学变化引起的突变基因突变：指染色体上一定位点基因内部的化学变化引起的突变 2、类别 隐性突变：A a 显性突变：a A 自发突变—外界环境条件的自然作用或生物体内的生理生化变化而产生的突变 诱发突变—在专门诱变因素影响引起的突变，为“诱发突变” 形态突变型—可见突变：指造成外形改变的突变型 至死突变型—能造成个体死亡或生命力明显下降的突变型 条件突变型—在一定条件下有致死效应 3.一般特征 ①突变的频率：指生物体在每一世代中发生突变的机率，或者在一定时 间内突变可能发生的次数。 高等植物 10-5— 10-8 细菌和噬菌体 10-4—10-10范围大、突变频率比动植物高 例如：氨基酸过程中三种疾病是由三种基因突变导致酶发生变化引起的，有一定的突变频率 苯丙氨酸羟化酶缺乏导致苯丙酮尿症；尿黑尿酸氧化酶缺乏会产生尿黑酸尿症；酪氨酸酶缺乏导致白化病 苯丙氨酸羟化酶 苯丙酮酸苯丙氨酸酪氨酸 积累尿黑尿酸氧化酶 酪氨酸酶 苯丙酮尿症尿黑酸黑色素

晚期非小细胞肺癌的靶向治疗(综

晚期非小细胞肺癌的靶向治疗(综述)题库

晚期非小细胞肺癌的靶向治疗（综述） 2015-03-10 来源：丁香园作者：张波 曾几何时，晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者只能接受化疗。但是，其疗效已经到了一个瓶颈期，无法再进一步。可喜的是，随着人们对分子遗传学认识的不断增强，NSCLC 被细分为各种不同的分子亚型，并由此诞生了各类分子靶向治疗药物。靶向药的应用，明显改善 了 NSCLC 患者的预后。 带有表皮生长因子受体（EGFR）突变和间变性淋巴瘤激酶（ALK）重排的肿瘤患者的一线治疗中，化疗并没有一席之地，除非该患者的“可药化驱动基因（druggable driver oncogene）”缺失。2015 年 2 月17 日Kumarakulasinghe 等在respirology 上发布综述，全面讨论临床相关的驱动基因突变的情

况、肺腺癌和鳞癌的最新分子分型、分子靶向药物在治疗中的地位及其耐药机制。 肺癌是肿瘤世界的头号杀手。在 2014 年，预计将有 224210 名新确诊的肺癌患者，而且其中大部分为晚期NSCLC。在很长一段时间里，人类面对晚期 NSCLC 只能使用“含铂类药物 的化疗”这一招。这招与最佳支持治疗相比，虽然一定程度上增加了患者总生存期（OS），但它的上限也仅限于 20% 的反应率和 8-10 个月的中位生存期。 随着分子遗传学研究的不断进展，人们慢慢尝试识别导致 NSCLC 的关键基因突变。这些存在于癌基因上的遗传变异能编码调控细胞增殖 和存活的信号蛋白。癌基因依赖这个概念应运而生，而它存在的基础，是“肿瘤的生存非常依赖

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基因突变检测多少钱检测方法是什么

基因突变检测多少钱检测方法是什么 一代测序法（Sanger法）： 科学家Sanger，于1977年建立，他本人也因此而获得了诺贝尔奖。该技术至今已用 三十多年，现在已相当成熟完善。人类基因组计划的测序工作就是使用该项技术完成的， 现在***的仪器是美国ABI公司的***3730型全自动遗传分析仪，是经过国际和国家认证的仪器，可重复性达到100%，是亲子鉴定和法医鉴定的专用仪器。该方法是目前基因检测的国际金标准。缺点是通量小，适合少量样本，可进行个性化位点检测，成本极高，比芯片 或高通量检测高100倍。 Taqman法： 准确性好，适合于大量样本、少量位点，价格贵，缺点是不能读出序列，不太直观。 质谱法： 准确性较好，缺点只能读出质量数据，不能读出序列，对于缺失和插入突变无法读出，但这种突变更加可怕，适合于大量样本、多位点（最多能检测25个位点），所以可能会 出现少量假阳性和假阴性。 二代基因检测芯片法： 适合于超多位点，大量样品检测和科研参考，每个样本做几百个位点和做几千个位点 的检测成本，相差无几，最大优点是成本低廉，一个位点的价格只相当于一代测序价格的1%，缺点是出来的大量数据，可信度不高。 我们都知道“是药三分毒”，癌症患者的过度治疗会造成患者的器脏损伤，甚至化疗 整个过程费钱费力却“不讨好”，所以进行在进行治疗之前先进行基因测序检测，会让靶 向药物治疗事倍功半。 肺癌的靶向药基因检测，现在很多公司都可以做，医院基本上也是外送公司做，看你 检测几个几个基因，一般不会超过7200，一般检测就是EGFR,融合基因ALK,ROS1，C-MET，中源协和基因检测。 一般的，基因检测是通过血液、其他体液、或细胞对DNA进行检测的技术。 基因检测可以诊断疾病，也可以用于疾病风险的预测。疾病诊断是用基因检测技术检 测引起遗传性疾病的突变基因。目前应用最广泛的基因检测是新生儿遗传性疾病的检测、 遗传疾病的诊断和某些常见病的辅助诊断。目前有1000多种遗传性疾病可以通过基因检 测技术做出诊断。

P53基因突变检测方法

2、试剂和耗材） GIAGEN,德国QIAamp?DNA Blood Mini Kit （）Platiinim?Taq DNA Polymerase High Fidelity （Invitrogen, 11304-102 Nuclease-Free Water （Promega,P 1195） d NTP Mix （Promega,P 151B） PCR引物：北京博迈德科技有限公司合成 DL10000 DNA Marker（TAKARA,大连宝生物）DNA分子定量标准：技术Bioer 产物回收纯化试剂盒（BioSpiii Gel Extraction kit,日本PCR有限公司）公司） Axygen, 200-1000 ul 吸头（美国110.5?10 u、2?20 u k 20-200 □、管EP、 仪.器3 ；Taimon1600R凝胶成像系统分析仪（上海天龙公司）Eppendorf 5417R 高速冷冻离心机（Eppendorf公司，德国）公司，美国）Allegra 6R离心机（Beckman-Coulter应涡旋混合器（北京北德科学仪器厂）MVS-1公司，德国） 1000 u 150 口1、200 ul、（Eppendorf^ 口1 移液器、10 U 1、NEWAIR 公司，美国）1【级生物安全柜NU425-400E （拓速冷冻离心机（BECKMAN COULTER 公司，美国）X-15R 公司德国）仪（Eppendorf Eppendorf Masteicycter PCR 公司，美国）（Bio-Rad电泳仪：Universal 024BR电热恒温水浴器（北京来亨科贸有限责任公司）240全自动凝胶成像系统（中国）凝胶成像分析系统：Tocan 测序仪：GenomeLab CEQ/GeXP （BECKMAN COULTER 公司，美国）20 u k 200 ul和1000 ul加样器（吉尔森公司，法国）旋涡震荡器（Scientific Industries公司，美国） 二、实验方法 1、样品采集，送检和保存 乙二胺四乙酸（EDTA） -3K抗凝管采集HIV和HEV合并感染者外周静脉血，于24h内测定CD4+T淋巴细胞计?数，抗凝血经常规离心分离全血中间层，分装后-80°C冻存用于P53基因变异的测定。 2、血浆样本DNA的提取 取200 P1全血中间层于1.5ml无菌EP管中，加入20 口1蛋白酶K；再加入200 ul AL缓冲液，涡旋振荡15秒，56°C孵育10分钟；瞬时离心EP管，加入200 u 1 无

肺癌基因检测

肺癌基因檢測 由於門診時常有肺癌病人要求使用某些自費藥物，甚至提出化療也保證一定要有療効，但事實截至目前突破不多。有些病人更因病急自費使用高價抗癌藥物仍徒勞無功，耗時傷財，延誤治療。目前已有多篇醫學報告強調個人化的治療是可行的，經適當評估後，治療的成功率是較高的，病人的生活品質也會改善。甚至臺灣多醫學中心的研究，也發現當事先檢查病人的肺癌切片檢體執行基因檢測再予投藥更可以增加療效，本論文已發表於45屆美國癌病年會，本院亦為執行研究單位之一。故本篇報導乃基於個人專業知識及臨床上之經驗，主要做為病人衛生教育，強調病患不應不明究理，自我要求治療方式，以減少金錢與時間的浪費。並藉此呼籲醫界也應善用醫學新知，讓更多此類患者可以在醫院就醫過程中迅速得到適切的治療，減少不當的浪費與奔波，接受更好的醫療照護。其上所述內容為個人專業之建議，且均有國際及本土研究結果的數據可以支持，部份內容甚至只是常識，已非醫療專業知識，所以並無任何廣告或宣傳之目的。純粹基於醫學教育和社會責任，為正確傳遞醫療新知及衛生教育訊息予民眾，且該篇報導並未刊載醫院地址及電話等資料，並無醫療廣告之意涵。 附件為數篇正式發表之世界知名報告 1.強調肺癌細胞型不同應選用不同的化學治療藥物組合可以改善存活率及反應

率等。 本表報告摘自 Tumor Cell Histology: An important role in treatment selection Scagliotti G et al. J Clin Oncol. 2008;26:3543-3551. 和 Belani CP et al. J Clin Oncol. 2009; 27(suppl): 18s. Abstract CRA 8000. 及Pirker R et al. Lancet. 2009;373:1525-1531之結論，強調非上皮細胞癌(non-squamous cell)使用pemetrexed會比上皮細胞癌(squamous)患者在無病存活期(PFS)及整體存活期(OS)都得到延長。所以肺癌細胞型不同，建議應選用不同的化學治療藥物組合。本研究本院亦參與第三期臨床試驗，健保局日前亦已通過可以使用於第一線標準治療。

肿瘤基因突变检测

肿瘤基因突变检测 癌症是一类难以预防的疾病，中晚期癌症治愈的可能性又很小，而早期癌症的治愈率可达65%以上，有些肿瘤可达90%以上，因此，战胜癌症的关键是早期发现癌症。由于癌症早期常无特殊症状，甚至毫无症状，故癌症的早期发现、早期诊断主要是通过定期健康体检和人群筛查完成。目前筛查癌症的方法主要是通过化验血肿瘤指标及B超、CT、MRI、PET-CT 等检查，但这些方法的敏感性和特异性均不高，发现有异常时往往已是中晚期。 17种常见高发肿瘤，包括乳腺癌（breast cancer）、结肠癌（colorectalcancer）、子宫癌（endometrial cancer）、脑胶质瘤（glioma）、白血病（leukemia）、肺癌（lungcancer）、淋巴癌（lymphoma）、成神经管细胞瘤（medulloblastoma）、黑色素癌(melanoma)、间皮瘤(mesothelioma) 、多性骨髓瘤(multiple myeloma) 、卵巢癌(ovarian cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer) 、真性红细胞增多(polycythemia vera) 、前列腺癌(prostatecancer) 、肾细胞癌(renal cell cancer)和恶性内瘤(sarcoma)，其发病机制涉及与多种肿瘤发生共同相关的肿瘤易感基因群介导的分子改变，参与了肿瘤发生的早期分子事件。系统寻找和探讨它们在肿瘤发生发展过程中的遗传学变异，对阐明肿瘤早期发生机制及寻找肿瘤早期预警、早期诊断和早期治疗的分子靶标都具有重要的现实意义。利用高通量分子测序技术平台，可同时开展多个肿瘤基因突变检测项目，如EGFR、K-RAS 、N-RAS、B-RAF、PI3K 、p53、p16、BRCA1、

晚期肺癌egfralk的免疫组化基因检测

晚期肺癌EGFR、ALK的免疫组化基因检测 提示：本期访谈嘉宾林冬梅主任医师 北京大学肿瘤医院病理科 目录 ·1· 做任何治疗决定前，必须获得病理报告 ·2· 病理报告上的那些话，都代表什么 ·3· 不能手术的肺癌患者也能进行基因检测吗 ·4· 分子诊断不是困难和玄乎的事 ·1·做任何治疗决定前，必须获得病理报告 好大夫在线：很多疑似恶性肿瘤的患者，在治疗之前都要做很多检查，包括CT，MRI等影像学检查。为什么做了这么多检查之后，患者还需要做穿刺，支气管镜，甚至去外科做纵隔镜、胸腔镜，拿活检标本做病理诊断呢？为什么病理诊断这么重要？ 林冬梅主任：对于肿瘤患者而言，疾病诊断最终要依靠支气管镜或者手术切除以后，获取的标本进行病理检测来判断。病理诊断是诊断肿瘤的“金标准”，其它检查都只是有助于医

生发现、判断病情，或在治疗过程中跟踪治疗效果。也就是说，其他任何检查，如CT、MRI等，即使在影像上发现有肿块、病灶，都不能最终判断病变的性质、类型，确诊还要依靠病理诊断。这是肿瘤治疗过程中，十分关键的依据。 好大夫在线：病理诊断标本分为大标本，小标本，分别是什么意思？ 林冬梅主任：一般来说，病理诊断中的大标本是指手术切除后获取的标本，小标本则是指通过支气管镜、腔镜、胃镜或穿刺获取的活检标本。此外，在人体的体表进行活检取材获取的标本也称为小标本。 好大夫在线：一个完整的病理诊断包括哪些信息？ 林冬梅主任：一个完整的病理诊断包括四个方面的信息： 第一，病人的基本信息，如姓名、性别、年龄以及病理号。其中，病理号是每个病人在检查的医院里拥有的唯一号码，十分重要。此外，每家医院根据情况不同，基本信息中还有病人的病案号或者ID号等； 第二，报告的内容，即送检标本来源的方式和部位。也就是说，需要标明标本来源于哪个器官，通过哪种方式获取的，

Kras突变非小细胞肺癌介绍

Kras突变非小细胞肺癌介绍 Kras基因是什么 基因的概念最早出现于19世纪60年代，遗传学家孟德尔提出了生物的性状是由遗传因子控制的观点。20世纪初期，遗传学家摩尔根通过果蝇的遗传实验，认识到基因存在于染色体上，得出了染色体是基因载体的结论，此后人们对基因的研究从来没有间断过。 在细胞的讯息传递路径上，RAS主要为活化控制基因转录的激酶，从而调节细胞的增生与分化，其与肿瘤细胞的生存，增值，迁移，扩散，血管生成均有关系。研究表明约30%的人类恶性肿瘤与RAS基因突变有关。RAS基因的发现以及结构和功能的明确经过了几代人的努力。 1981年Nature杂志上发表了一篇关于新基因序列的研究成果。科学家们在Harvery鼠肉瘤病毒( Ha-MSV) 和Kirsten 鼠肉瘤病毒(Ki-MSV)的子代基因中发现含有来源于宿主细胞的基因组的新基因序列，此后人们将这种宿主细胞基因称为RAS基因。1982 年Weinberg 和Barbacid首先从人膀胱癌细胞系中分离出一种转化基因，可使NIH3T3 细胞发生恶性转化，而从正常人组织中提取的DNA 则无此种作用。随后，Santos 与Parada发现上述转化基因并非新型基因，而是Harvery鼠肉瘤病毒RAS基因的人类同源基因，命名为HRAS。同年，Krontiris在人肺癌细胞中发现Kirsten 鼠肉瘤病毒基因的同系物，称为KRAS。另一种相似的基因是在人神经母细胞瘤DNA 感染NIH3T3 细胞时发现的与RAS类似的基因，称为NRAS。 RAS基因家族的三个成员相继被发现后，针对其结构和功能的研究也随之进行。 KRAS基因与非小细胞肺癌 KRAS是肺癌中一种最常见的突变基因，发生在大约25%的肺腺癌中。肺癌KRAS突变主要定位在第12和13号密码子。肺癌中的KRAS突变似乎与EGFR

基因突变的检测方法

基因突变的检测方法

基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。 异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。 突变体富集PCR法（mutant-enriched PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，如K-ras基因第12密码子的BstNI位点，第13密古巴子有BgⅠⅡ位点。用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第12、13密码子的DNA片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。 变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE） DGGE法分析PCR 产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适围为100bp-500bp。基本原理基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳适移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程

肺癌基因检测

肺癌中遗传学改变及其相应的靶向药物 遗传学改变(驱动事件) 针对肺癌驱动事件的活性靶向药物 EGFR突变厄洛替尼、吉非替尼、阿法替尼 ALK重排克唑替尼 表皮生长因子受体2（HER2）突变曲妥珠单抗、阿法替尼（FDA） BRAF突变Vemurafenib（维罗非尼）、Dabrafenib（达拉非尼）MET扩增克唑替尼 ROS1基因融合克唑替尼 RET基因融合Cabozantinib（卡博替尼） OS 总生存期（Overall Survival）mOS 中位（数）总生存期PFS 无进展生存期 （Progression-Free Survival）mPFS 中位（数）无进展生存期ORR 客观缓解率（Objective Response Rate）指肿瘤缩小达到一定量并且保持一定时间的病人的比例，包括CR+PR的病 例。OR 总缓解率（Overall Response 或者Overall Remission）经过治疗CR+PR病人总 数占对于总的可评价病例数的比例。CR 完全缓解(Complete Response) PR 部分缓 解(Partial Response) SD 疾病稳定（Stable Disease）PD 疾病进展（Progression Disease）DCR 疾病控制率(Disease Control Rate)=CR+PR+SD DOR 疾病缓解时间(Duration of Response）=CR/PR到PD/死亡的时间TTP 肿瘤进展时间( Time To Progress) TTF 治

疗失败时间（Time To Treatment Failure）QoL 生命质量（Quality Of Life）MTD 最大耐受剂量(Maximum Tolerated Do

非小细胞肺癌突变基因分析软件 性能指标

非小细胞肺癌突变基因分析软件 2. 性能指标 2.1 通用要求 2.1.1 处理对象 Illumina平台基因测序仪产生的测序数据，格式为：.Fastq。 2.1.2 最大并发数 仅支持单一用户模式。 2.1.3 数据接口 前端服务器和后端服务器接口为：RJ45。 数据传输协议：HTTP。 2.1.4 特定硬件 Illumina平台基因测序仪。 2.1.5 临床功能 软件提供账户管理、样本信息管理、突变分析（重新分析）以及报告（导出报告、重新生成）。 账户管理：普通用户具有用户登录、登出、修改密码的功能；系统管理员用户除具有普通用户的功能外还有添加、编辑和删除用户的功能。 样本信息管理具有录入和修改样本信息、查询和展示样本信息的功能。 突变分析功能：监测分析测序仪产生的原始数据,自动化分析并且生成原始结果，主要分为三个阶段： 1）等待测序仪数据下机上传，此时用户界面的分析进度条为空白。 2）测序完成后样本的分析进度由空白变为橙色开始分析。数据分析共包含5个步骤，分别是原始数据比对、数据质控分析、单碱基突变插入缺失突变分析、基因融合分析、分析结果汇总形成原始结果。

3）在数据分析期间，用户界面具有相应的分析进度展示、分析开始和结束时间统计以及分析预警功能，系统管理员用户具有在分析异常情况下重新进行分析的功能。 报告功能：依据配套的产品的报告范围，对原始的突变结果进行判断筛选形成最终的PDF报告，普通用户可以导出和查看报告，系统管理员用户具有重新生成报告的功能。 2.1.6 使用限制 a) 软件仅适用于分析“人EGFR/ALK/BRAF/KRAS基因突变联合检测试剂盒（可逆末端终止测序法）”在Illumina平台基因测序仪上进行测序实验产生的二代测序原始数据，格式为：.Fastq。 b) 用户登录的密码长度不得少于7位，且需至少包含数字、字母、特殊字符中的任意两种 c) 软件每批运行分析的样本数量最小为1个，最大为36个。 d）每批样本必须包含1个阳性质控品，1个阴性质控品。 2.1.7 用户访问控制 2.1.7.1 用户身份鉴别 使用不同的用户名、密码来进行用户身份鉴别。 2.1.7.2 用户类型及权限 （1）系统管理员 系统管理员具有软件所有操作权限，除此之外具有创建用户、编辑用户、删除用户、重新分析和重新生成报告的权限。 （2）普通用户 由系统管理员进行创建和管理。普通用户具有提交修改样本信息、进行突变分析以及报告生成和下载的权限。 系统管理员和普通用户具体的权限见下：

KRAS基因突变是非小细胞肺癌患者不良预后因素

20%-30%的非小细胞肺癌（NSCLC）患者存在KRAS基因突变，其中腺癌患者突变比例较高。但由于在病情分期、治疗方案以及生物标记物状态方面都存在分歧，对于非小细胞肺癌患者KRAS基因突变的预后与预测价值存在一定争议。鉴此，众多专家学者进行了大量研究，其中近两年的主要研究如下。 广东省人民医院所属广东省肺癌研究所吴一龙教授的研究团队进行了一项针对KRAS基因突变对非小细胞肺癌患者的预后影响研究。该项研究共对1935例非小细胞肺癌连续患者的KRAS与EGFR基因情况进行了检测。所有患者被分为KRAS基因突变组(KRAS组)、EGFR基因突变组(EGFR组)以及野生型KRAS/EGFR组(WT 组)。吴一龙等人发现，KRAS组、WT组以及EGFR组患者的整体存活期分别为14.47个月、20.57个月以及 42.73个月(P < 0.001)。多变量分析则表明，KRAS基因突变状态为一项独立预后因素(风险比为2.69,95% CI为1.91–3.80, P < 0.001)。对于KRAS基因突变的患者与野生型KRAS/EGFR患者，研究人员未发现他们在化疗以及EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗相关的PFS和肿瘤反应方面存在差异。三组患者在化疗相关的PFS方面无显着差异(P = 0.270)。 芝加哥罗伯特H. Lurie综合癌症中心（The Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center）的科学家进行了一项纳入1036例患者的临床研究。对2002年和2009年之间的晚期肺腺癌患者的数据进行了分析。在多变量分析中，EGFR突变伴有较长的总生存期（风险比为0.6，P <0.001），KRAS基因突变的生存期较短（风险比为1.21，P = 0.048）。由此可预测KRAS突变的晚期肺腺癌患者的生存期短。 我国卫生部肺部疾病重点实验室，华中科技大学同济医学院附属协和医院呼吸与危重医学科的辛建宝及其同事进行了一项针对K-ras基因突变预后相关文献的系统回顾与荟萃分析研究。共有41个试验的6939例患者被纳入分析，其总的总生存期HR为1.45，95%CI为1.29-1.62。而在种族方面的亚组分析中，亚洲人总生存期合并后的HR为1.97，95%CI为1.58-2.44；然而非亚洲人的这一数值为1.37，95%CI为 1.25-1.5。在组织学亚组方面，腺癌患者总生存期合并后的HR为1.39，95%CI为 1.24-1.55，荟萃分析表明，KRAS基因突变与非小细胞肺癌较差的整体生存率及生存期缩短相关，这种相关性在腺癌患者和早期患者中尤其明显。 由此可见，近年来的研究越来越明确认定KRAS基因突变对NSCLC患者是一个不良预后因素。但针对KRAS基因突变的NSCLC患者仍没有较为明确的治疗方案。在研的各种治疗肿瘤的靶向药物中，只有少数是将KRAS作为靶点。在一项针对常规治疗失败的NSCLC患者的FDA I期临床研究中发现，服用Antroquinonol后，大部分患者疾病均得到控制，并且无严重不良反应的发生，具有良好的耐受性和安全性，是一种非常有前景的KRAS靶向小分子药物。安卓健主要通过与FPP( 法尼基焦磷酸) 竞争结合FTase （法尼基转移酶），因而抑制FTase 将FPP 键结至RAS蛋白质的羧基端CAAX motif 半胱氨酸上，亦即抑制蛋白质异戊二酰化的进行，抑制RAS 的活性，达到抑制癌细胞生长与分化的目的。关于安卓健进一步的Ⅱ期临床研究也已在顺利进行中，相信很快就能常规应用于临床，为KRAS基因突变的非小细胞肺癌患者带来新的希望。

基因突变的检测方法

基因突变的检测方法 基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。 异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。 突变体富集PCR法（mutant-enriched PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，如K-ras基因第12密码子的BstNI位点，第13密古巴子有BgⅠⅡ位点。用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第12、13密码子的DNA片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。 变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE） DGGE法分析PCR 产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适