PCR技术的应用ppt课件

● 利用差示PCR同样可以做mRNA的定量。与DNA模板含量测定基本相似，所不同的 是首先应提取总RNA，加入一个与mRNA 3 7区互补的引物，在逆转录酶的作用下， 合成cDNA，其余的操作与DNA定量相同。利用PCR可以对tuRNA(如进行性肌萎缩蛋 白mRNA)作比较准确的定量，甚至连Northern印迹杂交未能发现的1TIRNA都可以得 到检测。
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6、PCR技术在法医学鉴定中的应用
● PCR技术用于生物物证的分析，与RFLP技术相比 ，具有操作简单、省时、成本低廉的优点，还可 避免同位素分析所带来的一系列问题，如放射性 污染、操作时的人身防护以及材料来源困难等。 近年来，在PCR技术基础上，又发展了许多基因 位点分型系统，用于法医物证的DNA分析，其中 发展最为完善并得到公认的是HLA—DQa位点的 分型系统，此系统应用PCR技术扩增HLA—DQa 基因特异片段，结合等位基因特异性寡核苷酸探 针杂交技术检测HLA—DQa位点的4个等位基因 ，有特异性好、灵敏度高、结果稳定可靠等优点 ，成为国际上法医科学中应用PCR技术进行个人 识别和亲子鉴定最有效的方法。
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由于PCR技术具有高特异性、高灵敏度、
操作快速、简便、对样本要求低等特点，加之它
能与多种分子生物学技术配合使用，PCR技术日
益成为遗传病诊断、发病机理的研究等方面最有
效、最可靠的方法之一。PCR技术的出现为快速
、准确地检测人类遗传病开辟了新途径
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5、PCR在骨髓移植HLA-D位点配型中的应用
● HLA—DRp位点配型方法，即PCR指纹图，该技术是的 DNA经PCR扩增HLA—DR卢区基因的高度多态区域，在 分别扩增后将供、受者产物混合，混合后进行2个PCR循 环，扩增产物经12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，照相后分析 不同个体的指纹图型。当HLA-DRfl基因相合时，其基因 产物在聚丙烯酰胺凝胶中可产生一致的带型，这种多条带 型的产生是由于各种HLA单倍体中的HLA-DRfl基因的不 同亚型以及假基因上的多态性所致。当PCR最后两个匹配 循环退火时，这些基因的单链DNA复性，DRfl基因相同 的个体形成同型双链，而不同的DRfl基因之间的不同序列 形成异型双链，因此，混合匹配可进一步证实HLA—DRfl 是否相合。
PCR技术的应用
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1、PCR隆和分离是分子生物学和细胞生 物学研究中必不可少的手段。运用PCR技 术进行基因克隆和亚克隆比传统的方法具有 更大的优点。由于PCR可以对单拷贝的基 因放大上百万倍，产生微克(pg)级的特异 DNA片段，从而可省略从基因组DNA中克 隆某一特定基因片段所需要的DNA的酶切 步骤。
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2、PCR技术在传染病病原体检测中的应用
● PCR是一种具有高敏感性、且特异性好的靶DNA 快速检测方法，能对前病毒或潜伏期低复制的病 原体特异性靶DNA片段进行扩增检测，只要标本 中含有lfg靶DNA就可检出。可检出经核酸分子杂 交呈阴性的许多标本，而且对标本要求不高，经 简单处理后就能得到满意扩增。可做到早期及时 诊断，对防止传染病流行有重要意义。
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3、PCR在肿瘤相关基因检测中的应用
● 寡核苷酸探针杂交法 ● 限制性内切酶切片段长度多态性(RFLP)技术 ● PCR—RFLP技术 ● RNA酶A错配清除法 ● 核酸序列分析法
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4、PCR技术在遗传病早期诊断中的应用
● 基因诊断技术的发展是现代医学发展的一个重要 标志，它从基因水平开辟了诊断学新领域。聚合 酶链反应(PCR)技术是基因诊断主要技术之一，以 PCR为基础的各种分子生物学新技术在遗传病的 基因诊断等方面得到广泛的应用。
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7、PCR在进化分析中的应用
● rRNA基因有“化石”之称，PCR扩增并分析其 序列，可分析比较界或门分类水平上的生物。通 常，细胞核小亚基rDNA的序列进化相对较慢， 主要用于种系关系较远的生物比较研究；而线粒 体rRNA基因进化非常快，可在科目水平上进行不 同生物的比较；转录的间隔区序列和核rRNA的基 因间隔区重复单位序列进化最快，可用于同属异 种或不同群之间的分析比较。
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四：用于基因定量
● 应用PCR技术可以定量监测标本中靶基因的拷贝数，这在研究基因的扩增等方面具有 重要意义，这种方法称为差示PCR(differential PCR)。它是将目的基因和一个单拷贝 的参照基因置于同一个试管中进行PCR扩增。电泳分离后呈两条区带，比较两条区带 的丰度；或在引物5’端标记上放射性核素后，通过检测两条区带放射性强度即可测出 目的基因的拷贝数。利用差示PCR还可以对模板DNA(或RNA)的含量进行测定，在一 系列PCR反应中，分别加入待测模板DNA和参照DNA片段。参照DNA片段基本上按待 测DNA的方式进行构建，但增加了一小段内部连接顺序，这样使得两种DNA片段的 PCR产物可在凝胶电泳上分开。由于这两种不同的DNA片段可以在同一种寡核苷酸引 物作用下同步扩增，因此可以避免因使用不同的引物所引起的可能误差。这两种扩增 产物的相对量就反应了在起始反应混合物中的目的DNA和参照DNA的相对浓度。
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二：重组PCR
在分子生物学研究中常常需要将两个不同的 基因融合在一起。通过PCR反应可以比较容 易地实现这一目的。
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三：DNA序列的测定
目前广泛采用的DNA测序方法有化学法和双脱氧 法两种，它们对模板的需要量比较大。传统的模 板制备方法是将含目的基因的DNA片段进行酶切 ，建立基因库，筛选克，并亚克隆到M13噬菌体 载体上，经噬菌体产生单链DNA。这是一项比较 复杂的工作。利用PCR方法可以比较容易地测定 位于两个引物之间的序列。