影响分光光度法检测藻类叶绿素a的因素_赵玉华
藻类叶绿素a的测定
藻类叶绿素a的测定一、实验名称藻类叶绿素a的测定二、实验目的——(水)环境化学中叶绿素a测定意义在地表水环境的富营养化的研究中，叶绿素a是表征浮游植物生物量的最常用的指标之一。
同时，叶绿素a也是用来衡量水体水质，评价水体富营养化水平的标准之一。
三、实验原理叶绿素介绍叶绿素是植物进行光合作用的主要脂溶性色素，它在光合作用的光吸收中起核心作用。
所有光合器官中都含有叶绿素。
叶绿素a和b都溶于乙醇、乙醚、丙酮等，难溶于石油醚，有旋光，主要吸收橙红光和蓝光。
因此，这两种光对光合作用最有效。
当植物细胞死亡后，叶绿素即游离出来，游离叶绿素不很稳定，光、热、酸、碱、氧、氧化剂等都会使其分解。
在酸性条件下，叶绿素中的镁原子很容易被其他酸代替，绿色消失而变黄，叶绿素生成绿褐色的脱镁叶绿素，加热时反应加速。
叶绿素的实验室测量方法有分光光度法、荧光法、色谱法，其中以传统的分光光度法应用最为广泛。
根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即：A =α•C•L式中：α为比例常数。
当溶液浓度以百分比浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。
各有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。
（1）单色法已知叶绿素a的80％丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm，已知在波长663nm下，叶绿素a在该溶液中的比吸收系数分别为82.04，因此C=A663/82，可以计算出叶绿素Aa的含量(mg/L)。
分光光度法测定湖泊水中叶绿素a含量的研究
分光光度法测定湖泊水中叶绿素a含量的研究
赵荣龙;梁欣欣;吴玉萍;崔丹;张玲
【期刊名称】《中国标准化》
【年(卷),期】2024()7
【摘要】叶绿素a含量是评价水体富营养化水平的重要依据,水体营养化程度过高会影响水生生物的生存和繁殖,导致水体生态系统紊乱,生物多样性受到破坏。
叶绿素a几乎是所有浮游植物类别都含有的叶绿素类型。
所以,叶绿素a含量既是水体富营养化的判断标准,又是浮游植物现存量的重要推断依据。
水体富营养化是我国当前水环境面临的主要问题。
为阐明分光光度法测定水体中叶绿素a含量结果的快速性和准确性,本研究用研磨机代替手工研磨进行样品制备,用标准物质进行加标测定。
结果显示叶绿素a检测值符合标准要求。
【总页数】4页(P247-250)
【作者】赵荣龙;梁欣欣;吴玉萍;崔丹;张玲
【作者单位】昆明滇池水务环境监测有限公司;贵州省环境监测中心站;昆明滇池物流有限责任公司
【正文语种】中文
【中图分类】X52
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东昌湖叶绿素a和藻密度监测及微囊藻毒素分析
东昌湖叶绿素a和藻密度监测及微囊藻毒素分析 赵 慧 马景刚 樊 华东昌湖叶绿素a和藻密度监测及微囊藻毒素分析赵 慧，马景刚，樊 华，李爱峰（海洋环境与生态（中国海洋大学）教育部重点实验室，山东 青岛 266100）摘 要：2009年4月、5月，2010年6月、8月、9月、10月及2011年3月，分别对东昌湖水体中的叶绿素浓度和藻细胞密度进行了调查，统计分析叶绿素a和藻密度的动态变化及二者之间的相关性，并进行蓝藻水华的风险评估；同时对部分样品中的微囊藻毒素进行了分析。
结果表明，东昌湖的叶绿素a浓度和藻密度均具有明显的季节变化，存在发生蓝藻水华的风险，但二者之间的相关性不显著，可能是由于浮游植物群落组成发生了明显的变化，且不同藻类细胞的叶绿素a含量差异较大，在所分析的藻细胞样品中未检测出微囊藻毒素。
关键词：东昌湖；叶绿素a；藻密度；蓝藻水华；微囊藻毒素中图分类号： X834 文献标识码：A蓝藻水华是指湖泊水体中的蓝藻快速大量繁殖形成肉眼可见的蓝藻群体或者导致水体颜色发生变化的一种现象，严重时可在水面漂浮积聚形成绿色的藻席甚至藻浆。
蓝藻水华的发生根源于湖泊富集了过多的氮、磷等营养物质，是湖泊富营养化的一种表现形式[1]。
近年来湖泊富营养化问题日益严重，蓝藻水华的发生极为频繁，而且危害严重。
蓝藻水华出现时，水面被厚厚的蓝绿色湖靛所覆盖，甚至在岸边大量堆积。
藻体大量死亡分解的过程中，散发恶臭，破坏景观，蓝藻大量生长改变了水体的理化环境，透明度降低，溶解氧减少，造成鱼虾等水生生物的死亡。
当水体中的营养元素被蓝藻耗尽时，蓝藻大量死亡，在被细菌分解过程中仍然可以释放蓝藻毒素，最终导致水生态系统的迅速崩溃[2]。
蓝藻水华也给水产养殖业、供水及旅游业甚至人类的饮用水安全带来极大的危害[3]。
伴随着蓝藻水华的发生，一些有害的藻类会向水体中释放毒素，在发生水华的蓝藻中有许多能产生毒素，其中以微囊藻毒素 (Microcystins，MCYSTs，MCs)的存在最普遍且与人体健康关系最密切 [4]。
探讨分光光度法测定水中叶绿素a的方法改进
探讨分光光度法测定水中叶绿素a的方法改进【摘要】针对水中叶绿素含量测定步骤繁琐，操作过程损失多，人为干扰因素大等特点，在不改变原有方法的基础上，对叶绿素处理方式进行改进：用丙酮超低温冷冻萃取；超声波充分震荡破碎混匀；微孔滤膜进一步过滤去除杂质干扰。
通过试验，发现新方法测定在很大程度降低了操作过程中人为因素的耗损，提高了检测效率和检测质量。
【关键词】叶绿素a；分光光度法；醋酸纤维膜；丙酮；微孔滤膜1 前言随着现代经济的高度发展和人口膨胀，湖泊、水库正接纳越来越多的氮、磷等营养负荷，也使得浮游生物及其他水生生物异常繁殖，造成水体富营养化，严重影响供水水质。
藻类计数和叶绿素含量的测定是用于评价水体富营养化水平的两大生物水质检测指标，利用显微镜对水中藻类计数耗时长、检测人员存在主观判断差异不同，测得的藻类计数结果往往相差较大。
叶绿素测定受人为主观判断影响相对较小，含量比较稳定，因此，成为评价水质富营养化水平的主要水质指标。
2 叶绿素测定新方法本文是根据《中国湖泊富营养调查规范》、《水与废水标准检验方法》第四版等资料提供的操作方法，在不改变原方法的基础上，对含藻水样经过过滤浓缩、冷冻萃取、超声波振动、再对离心后的水样进行再过滤，通过分光光度计测定萃取液中叶绿素的浓度。
通过反复试验，取得了较好的试验结果。
同原方法相比较，叶绿素测定含量提高了11.8%～23.3 %。
3 实验原理和材料3.1 实验原理分光光度法测定水中叶绿素含量的原理是以有机溶剂丙酮溶液直接提取浮游生物浓缩样中的叶绿素，测定其吸光度，根据叶绿素a在特定波长的吸收，用公式计算其含量。
3.2 试剂（1）90%的丙酮溶液（2）1%的碳酸镁悬浊溶液（3）仪器设备及器皿1）过滤装置：过滤器，醋酸纤维滤膜（直径50mm，孔径0.45um）、真空泵2）台式医用离心机（最大转速4000r/min）、超声波仪、微漩涡器3）器皿：研钵，微孔滤膜、镊子、剪子、塑料离心管、10mL标准容量瓶4 测试方法的比较（方法Ⅱ为改进方法，方法Ⅰ为原有方法）叶绿素测试步骤为：浓缩___萃取___离心___分光光度测定。
水质叶绿素a的测定分光光度法
HJ897-2017水质叶绿素a的测定分光光度法Water quality—Determination of chlorophyll a—Spectrophotometric method（发布稿）本电子版为发布稿。
请以中国环境出版社出版的正式标准文本为准。
2017-12-21发布2018-02-01实施环境保护部发布目次前言 (ii)1适用范围 (1)2规范性引用文件 (1)3方法原理 (1)4试剂和材料 (1)5仪器和设备 (2)6样品 (2)7分析步骤 (3)8结果计算与表示 (4)9精密度和准确度 (4)10质量保证和质量控制 (5)11废物处理 (5)i前言为贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国水污染防治法》，保护环境，保障人体健康，规范水中叶绿素a的测定方法，制定本标准。
本标准规定了测定地表水中叶绿素a的分光光度法。
本标准为首次发布。
本标准由环境保护部环境监测司和科技标准司组织制订。
本标准起草单位：辽宁省环境监测实验中心。
本标准验证单位：上海市环境监测中心、大连市环境监测中心、丹东市环境监测中心站、辽阳市环境监测站、朝阳市环境监测中心站和辽宁北方环境检测技术有限公司。
本标准环境保护部2017年12月21日批准。
本标准自2018年2月1日起实施。
本标准由环境保护部解释。
ii水质叶绿素a的测定分光光度法警告：丙酮对人体健康有一定危害，操作时应在通风橱中进行，佩戴防护器具，避免接触皮肤和衣物。
1适用范围本标准规定了测定水中叶绿素a的分光光度法。
本标准适用于地表水中叶绿素a的测定。
本标准测定丙酮提取液中叶绿素a的检出限为0.04mg/L。
当取样体积为200ml，丙酮提取液体积为10ml时，本方法的检出限为2μg/L，测定下限为8μg/L。
2规范性引用文件本标准引用了下列文件或其中的条款。
凡是不注日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。
GB/T14581水质湖泊和水库采样技术指导HJ494水质采样技术指导HJ/T91地表水和污水监测技术规范3方法原理将一定量样品用滤膜过滤截留藻类，研磨破碎藻类细胞，用丙酮溶液提取叶绿素，离心分离后分别于750nm、664nm、647nm和630nm波长处测定提取液吸光度，根据公式计算水中叶绿素a的浓度。
分光光度法测定叶绿素a方法比较
分光光度法测定叶绿素a方法比较王康1，凌彦群2（1.四川省乐山井研县环境监测站，四川乐山613100；2.四川省乐山市环境监测站，四川乐山616400）摘要：叶绿素a作为评价水体富营养化程度的重要指标之一，探讨其监测分析方法的实用性具有重要的现实意义。
本文通过实验分析比较了叶绿素a测定中的两种样品处理方法——研磨萃取法和反复冻融-浸提法的优缺点；采用分析实验数据统计处理方法评价叶绿素a的测定值。
结果表明：用反复冻融-浸提法处理水样具有安全、高效特性，750nm处吸光度值容易达到0.005；两种分析方法得到的结果无显著性差异；由此两法在室内所获得的分析结果具有可比性。
关键词：分光光度法；叶绿素a；研磨萃取法；反复冻融-浸提法Comparison of the Analysis Methods for Chlorophyll-a bySpectrophotometryWANG Kang1，LING Y anqun2（1.Environmental monitoring station of Jingyan, Leshan, 613100, China；2.Environmental monitoringstation of Leshan, Leshan, 614000, China）Abstract:Chlorophyll-a is one of index in eutrophication for water. Grinding extraction method and repeated freeze-thaw extraction method is the two methods for sample pretreatment in Determination of chlorophyll-a by spectrophotometry. The experiment showed that repeated freeze-thaw extraction method is increase efficiency and safer. The absorbance is less than 0.005 in 750nm. There was no difference of Two computing formulae results.Keywords:spectrophotometry, chlorophyll-a, grinding extraction method, repeated freeze-thaw extraction method叶绿素a是衡量湖泊、水库、河流等水体富营养化程度的重要指标之一。
分光光度法测定水体中叶绿素a含量的改进
置于 ４℃冰 箱中 ｌ 放
避 光 浸 泡 ４ １ 用 。 ￣ ２ｈ备
６ 离心 。 离心管放人离心机 中 ， ３５０ｒｒ ｎ的速 ） 将 以 ０ ｎ ／ｉ 度离心 １ ｎ ５ｍｉ。
７ 测定和 计算 。将离心 后的上清液 倒入 １ ｍ 比色皿 ） ｃ
水 生态 环境
【 文章编号 ］ｏ ２—０２ （０ ２０ —０ ３ １ｏ ６ ４ ２ １ ）６ ０２—０ ２
东 北水利水 电
２ １ 年 第 ６期 ０２
分光光度法测定水体中叶绿素 ａ 含量的改进
戴 欣 ，杨 航 ・石 岩 ， 雪 ， ， ， 鲁 王玲静 ｚ李 聪 ，
（． １ 松辽流域水资源保护局松辽流域水环境监测中心 ， 吉林 长春 １０２ ；． ３０ １２ 河海大学 ， 江苏 南京 ２０９ ） １０８
Ｓ ８ —１９ Ｌ ８ ９ ４标准 方法使用 的是一般 微孔 滤膜 ， 多为醋
酸 纤维材质 。叶绿素 ａ 定时要求 ７０ｎ 处吸光 度值低 测 ５ ｍ 于 ０ ０， ． ５ 因醋酸 纤维 滤膜在丙酮 溶液 中溶解 ， 一次离心 ０ 用
方 法有时很难达 到分 析要求 。在 实际 测试 中 ， 用醋酸 纤 使
附滤膜残渣， 不易洗脱 ， 易造成样品损失； 由于实验人员的差 ・
异， 对研磨的操作不尽相同 ， 引起实验 结果重现性差。 容易
本方 法中使用 的反 复冻融 法 【 即 使用 超低 温冰 箱对 ３ １ ，
于室温下 ５ｍｉ， ｎ 此过程反 复 ３次。向离心管 中加入 ９ ％ ０ 丙
游植物 的数 量 ， 而表征水 体富营养化 的程度 。 进
目前国 内 测定叶 绿素 ａ的方 法主 要是 使 用分 光光 度 法和 荧光 法 ， 其中 分光 光度法 较为 常用 。方法 上主要 采用 Ｓ ８ — ９ ４ 标准 规定 的方法 ， 该标准 方法在 实践工作 中 Ｌ８ １９ｍ 但 还存在 着实验 结果平行性 不好 、叶绿素 ａ 取效率不高 等 提
提取测定大型海藻叶绿素a的新方法研究1 (1)
20040601
提取测定大型海藻叶绿素ａ的新方法研究
捅姜
本文从提取手段、提取溶剂和检测方法等几个方面综述了大型海藻叶绿素ａ 提取测定方法进展，并在此基础上选择青岛近海有代表性的十余种大型海藻作为 研究对象，使用浸提和研磨等手段，对不同溶剂提取测定这些大型海藻叶绿素ａ 的能力进行了对比分析，以此为基础分析了有机溶帮分子结构对大型海藻叶绿素 ａ提取能力的影响，并提出了新的提取测定大型海藻叶绿素ａ的方法。同时以褐 藻裙带菜为代表使用高效液相色谱分析了其在不同溶剂和提取手段下的色素组 成和含量的差异，并将分光光度法和高效液相色谱法的结果进行了对比分析。
尖锐，洗脱时间接近的色素能够实现基线上的分离，易于定性和定量，是优秀的 提取溶剂。
所选的８种溶剂对裙带菜进行浸提和研磨所获得的ＨＰＬＣ色索分析结果表 明：在浸提方法中，以Ｅｔｈａｎｏｌ浸提所褥的Ｃｈｌ－ａ结果最高，其次是ＤＭＡＣ浸提。 但是Ｅｔｈａｎｏｌ浸提极性色素（Ｃｈｌ－ｃｌ和Ｃｈｌ—ｃ２）的结果琨显低于ＤＭＡＣ和其它溶 剂，同样，ＡＣＥ和９０％ＡＣＥ对Ｃｈｌ—ｃｌ和Ｃｈｌ．ｃ２的结果也比ＤＭＡＣ差。在所研 究的试剂范围内，ＤＭＡＣ是提取大型海藻色素能力最优秀的溶剂。
对绿藻：叶绿素ａＯ＿ｇ／ｍ］）＝１１．５８Ｅ６６４—１．８８风４７ 对褐藻：叶绿素ａ０Ⅲｇ／ｍ１）＝１１．１４Ｅ６６４—０．４０ Ｅ６３０ 对红藻：叶绿素ａ（肛ｇ／ｍ１）＝１１．５０Ｅ６６４·１．５０ Ｅ６４７—０．０８ Ｅ６３０ 选择了８种溶剂提取裙带菜中色素并用于高效液相色谱分析。在选定的溶 剂中，ⅡⅡ、ＩＳＰ和ＳＢＡ会造成色素峰的变形，对色素的定性定量分析带来困难， 不适用于高效液相色谱分析藻类色素。根据峰形对溶剂性能进行排序： ＤＭＡＣ＞９０％ＡＣＥ＞ＭＥＮ＞ＡＣＥ＞Ｅｔｈａｎｏｌ＞ＴＨＦ＞ＩＳＰ＞ＳＢＡ。ＤＭＡＣ中的色素峰峰形
分光光度法测定水中的叶绿素a
分光光度法测定水中的叶绿素a分光光度法测定水中的叶绿素a1 检出限水样体积300 mL、使用1 cm比色皿时，叶绿素a的检出限为0.11 μg/L，测定下限为0.5 μg/L；叶绿素b的检出限为0.25 μg/L，测定下限为1.0 μg/L；叶绿素c的检出限为0.25 μg/L，测定下限为1.0 μg/L。
2 方法原理将一定量水样用玻璃纤维膜过滤，收集藻类，使用反复冻融法对藻类细胞进行破碎，用90%丙酮溶液提取叶绿素，根据叶绿素光谱依次测定750 nm、664 nm、647 nm、630 nm波长下的吸光度，计算叶绿素含量。
3 试剂和材料3.1 碳酸镁悬浊液：ω（MgCO3）= 1%，1.0 gMgCO3 100 mL纯水3.2 丙酮溶液：ψ（C3H6O）= 90%，900 mL丙酮加100 mL纯水3.3 盐酸溶液：c（HCl）=0.1 mol/L。
8.5 mL浓盐酸加入500 mL纯水，冷却后稀释至1000 mL。
4 仪器和设备4.1 抽滤装置4.2 滤膜4.3 具塞玻璃离心管4.4 水浴锅4.5 离心机：转速3000 ~ 4000 r/min4.6 分光光度计4.7 比色杯：3 cm5 水样采集5.1 水样采集采集500 ~ 1000 mL 水样于棕色玻璃瓶或深色塑料瓶中。
5.2 保存避光保存，低温运输，在-20℃以下的冰箱内保存，在25 d 内分析测试。
6 分析步骤6.1 清洗玻璃仪器所有玻璃仪器应该清洗干净，尤其避免酸性条件下引起的叶绿素a 的分解。
6.2 滤膜过滤每种测定水样取300 mL ，加入0.6 mLMgCO 3悬浊液，用滤膜过滤。
6.3 提取将滤膜转移至具塞试管，加少量碳酸镁粉末和10 mL 已水浴加热至50℃的90%丙酮溶液。
塞紧塞子并在管子外部罩上遮光物，充分震荡，避光提取4 h 。
6.4 离心提取完毕后，离心管置于离心机上4000 r/min 离心20 min ，取出离心管，用移液管将上清液移入刻度离心管中，塞紧塞子，4000 r/min 再离心10 min 。
水中叶绿素a测定时间和浊度对测定结果的影响
水中叶绿素a测定时间和浊度对测定结果的影响黄倩;陈浓;赵琼洲;汪本武【摘要】叶绿素在存储中容易被分解,所以叶绿素a的测定应该尽快进行,但是日常工作中由于条件所限,不方便现场测定,本文研究了不同测定时间对于叶绿素a测定结果的影响.研究结果发现,使用荧光直读法设备测定叶绿素的应当在现场测定完成.因为泥沙等悬浮物也会吸收荧光,可能产生叶绿素a读数偏高,本文通过荧光法和萃取分光度法比对测定结果,发现浊度对于荧光直读法结果存在线性影响,可以通过公式修正.【期刊名称】《黑龙江科技信息》【年(卷),期】2017(000)030【总页数】2页(P108-109)【关键词】叶绿素;测定时间;浊度;测定结果;影响【作者】黄倩;陈浓;赵琼洲;汪本武【作者单位】湖北省水环境监测中心黄石分中心,湖北黄石 435000;湖北省水环境监测中心黄石分中心,湖北黄石 435000;湖北省水环境监测中心黄石分中心,湖北黄石 435000;湖北省水环境监测中心黄石分中心,湖北黄石 435000【正文语种】中文叶绿素是一类含脂的色素家族，位于类囊体膜，在光合作用的光吸收中起核心作用。
叶绿素吸收大部分的红光和紫光但反射绿光，所以叶绿素呈现绿色，包括叶绿素a、b、c、d、f，以及原叶绿素和细菌叶绿素等。
在活体浮游植物中，叶绿素既可发挥光合作用，又不会分解；但在储藏过程中，叶绿素会受到光、酸、碱、氧、氧气等作用，被分解为一系列小分子物质而褪色。
所以理论上，叶绿素a的应当在现场测定，但是日常工作中由于条件所限，不方便现场测定，本文研究了不同测定时间对于叶绿素a测定结果的影响。
在日常工作中，经常遇到比较浑浊的水样，我们无法确定浑浊是泥沙还是浮游植物造成的，而悬浮物会阻挡和散射荧光，造成荧光吸收效果，从而推高测定结果。
美国安诺实验室的便携式叶绿素测定仪，型号ChloroTech121A+；北京普析通用公司的紫外可见分光光度计，型号TU-180PC；上海安亭电子仪器厂的浊度计，型号WZS-20；离心机；低温冰箱；抽滤器；1%碳酸镁悬浊液。
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收稿日期:2006-08-10基金项目:辽宁省水利厅项目(05-08-37)作者简介:赵玉华(1959-),女,教授,主要从事水处理理论与技术研究.文章编号:1671-2021(2007)03-0482-03影响分光光度法检测藻类叶绿素a 的因素赵玉华,刘 畅,薛 飞,傅金祥(沈阳建筑大学市政与环境工程学院,辽宁沈阳110168)摘 要:目的为检测藻类叶绿素a 提供可借鉴的依据.方法采用玻璃离心管与塑料离心管,待测液样在分光光度计中稳定不同时间,在叶绿素a 提取过程中对液样加以冷藏的方法,进行对比试验.结果塑料离心管测得的水样叶绿素a 值,比用玻璃离心管测得的值平均高30.1%.液样在分光光度计中稳定时间0~5m in 内,叶绿素a 值随稳定时间延长而提高,5m in 以后提高速度减缓.冷藏时间在6h 以内,叶绿素a 值平均增加1.92L g #(L #h)-1,6h 以后,叶绿素a 值增加速度减缓.结论塑料材料对叶绿素a 值测定有干扰作用,采用塑料离心管测得的水样叶绿素a 值偏高,建议用玻璃离心管.待测液样在分光光度计中的稳定时间对藻类叶绿素a 值的测定有影响,如果稳定时间过短,会使测定结果偏低.适合的稳定时间为10~20min,在叶绿素a 提取过程中,将液样适当进行冷藏,可使叶绿素a 充分溶解于溶液中,适合的冷藏时间为6~8h,供分光光度法检测藻类叶绿素a 参考.关键词:藻类;叶绿素a;分光光度法检测;离心管材料中图分类号:X832 文献标识码:A 水中藻类过量繁殖会使水透光性差,影响水生物生长繁殖[1].产生藻毒素,危害生物及人类健康[2-4].水中藻类的检测通常采用叶绿素a 法和显微计数法[5-8].国家环境保护局公布的5水和废水监测分析方法6中规定,叶绿素a 的检测采用分光光度法[9].在试验过程中发现,规定的操作过程与步骤不尽详细,使得试验结果会产生一定的误差.比如,水样离心所用的离心管材料、测定吸光度时待测液样在分光光度计中的稳定时间等,都未做说明.因而,笔者进行了离心管材料、待测液样稳定时间和叶绿素a 提取过程中加以冷藏的对比试验,为藻类叶绿素a 的检测提供可借鉴的依据.1 试验方法111 试验仪器设备抽滤装置(2XZ-0.5型旋片真空泵,过滤器,直径35mm 、0.45L m 微孔滤膜(混合纤维),小研钵(配套研杵),台式离心机,冰箱,9100可见光分光光度计.112 试验用水试验用原水取自沈阳建筑大学人工湖.该湖于2003年注入地下水,其作用除用做校园景观外,还兼养鱼类.由于湖水流动性较差,光照充足,以及投放鱼食等营养物质,造成藻类繁殖,主要以蓝藻为主,湖面水呈绿色,处于富营养化状态.夏季最高水温在26e 左右,浊度4.0~ 6.0NTU,高锰酸盐指数的质量浓度8.22~9.45m g #L -1,pH 值6.55左右.113 水样采集因为藻类基本接近水面的浅层水中生长繁殖[1],而且受光照条件和水温影响,因而,每天在同一时间,同一地点,同一液面深度下采集原水水样.114 叶绿素a 测定过程水样用滤膜过滤后,将滤膜放在匀浆器或小2007年05月第23卷第3期 沈阳建筑大学学报(自然科学版)Journal of Shenyang Jianzhu U niversity (N atural Science)M ay 2007V ol 123,No 13研钵内,加90%的丙酮溶液2~3m L,充分研磨,提取叶绿素a,并将浆液移入离心管中,放入冰箱冷藏一定时间,以使叶绿素a充分提取出来,温度保持在4e.提取完毕后,以3500r/m in转速离心分离10min.重复提取过程(不需再冷藏)和离心过程1次.将浆液移入比色皿内,放入分光光度计稳定一定时间,分别在750nm、663nm、645 nm、630nm波长下测提取液的吸光度.用下式计算叶绿素a值.Q(叶绿素a)=11.64(OD663-OD750)-2.16 (OD645-OD750)+0.1(OD630-OD750)式中,OD为吸光度.在叶绿素a测定过程中,还需要注意以下几点.(1)在将离心管放入离心器中进行离心时,要注意离心管对称放置,譬如:1-3-5,2-4- 6.否则,会引起离心不均匀,同时会对离心器产生一定的破坏.(2)在进行水样抽滤时,需注意抽滤压力不高于相当150mm汞柱的压力,否则,过大的压力会破坏藻细胞,从而带来叶绿素a测值的失真[10].并且抽滤要在一个避光性好的室内操做,并尽快完成,避免将叶绿素暴露在不必要的光中.2试验结果讨论211离心管材料的影响分别采用塑料离心管和玻璃离心管,对水样提取液进行离心分离,以探讨离心管材料对测定结果的影响.测得的叶绿素a值如图1所示.从图中可以看出,采用塑料离心管测得的水样叶绿素a值,始终高于同样条件下采用玻璃离心管测得的叶绿素a值,误差在21.0%~43.6%之间,平均误差30.1%.说明塑料离心管与提取液中的成分发生了某种化学反应,严重干扰了叶绿素a值的测定结果.因为丙酮对塑料具有腐蚀性,因此,在离心分离过程中,含有丙酮的提取液溶入了离心管材料成分,使测定结果偏高.212稳定时间的影响将盛有待测溶液的比色皿放入分光光度计中,在不同的稳定时间下读取吸光度,以确定适合的稳定时间.测得的水样叶绿素a值见图1.从图1中可以看出,叶绿素a随着稳定时间的延长而增大.在0~5m in时段,叶绿素a值变化幅度较大,相差49.4%;5~25min时段,叶绿素a值变化幅度减小,差值在5%以下,逐渐趋于稳定.但由于丙酮具有挥发性,如果稳定时间过长,一旦被检测液的液面高度低于比色皿高度的2/3,也会使测定结果准确度下降.图1叶绿纱a值与离心管材料和稳定时间关系213冷藏时间的影响在叶绿素a提取过程中,采用不同冷藏时间进行对比,以使叶绿素a能完全从藻细胞中分离出来,进入溶液中.将过滤后的滤膜加丙酮溶解,然后将水样转移到离心管中,外部罩上避光物放入冰箱内,开始计时,到将离心管从冰箱中取出的时刻结束,这段时间定义为冷藏时间.温度保持在4e.不同冷藏时间条件下测得的叶绿素a值见图2.在冷藏时间为0~6h时段,随着冷藏时间的延长,叶绿素a值提高很快,从15.27L g#L-1增至24.85L g#L-1,增加67.7%,平均增加1.92L g#(L#h)-1;在6~24h时段,增长趋势变缓,增加7.44%,平均增加0.10L g#(L#h)-1,叶绿素a值基本趋于稳定.图2叶绿素a值与冷藏时间的关系3结论(1)由于塑料材料对叶绿素a值测定有干扰作用,采用塑料离心管测得的水样叶绿素a值偏高,建议采用玻璃离心管进行含水藻类叶绿素a 值测定的离心操作.第23卷赵玉华等:影响分光光度法检测藻类叶绿素a的因素483(2)待测液样在分光光度计中的稳定时间对藻类叶绿素a值的测定有影响,如果稳定时间过短,会使测定结果偏低.建议稳定时间至少5 min,适合的稳定时间为10~20min.(3)在叶绿素a提取过程中,将液样适当进行冷藏,可使叶绿素a充分溶解于溶液中,随着冷藏时间的延长,测定的藻类叶绿素a值增加.适合的冷藏时间为6~8h.参考文献:[1]黄萌.富营养化对水生生态系统的污染生态效应[J].科技情报开发与经济,2006,16(20):137-138.[2]Paer l H W,Fulton RS3rd,M oisander P H,et al.Harmful freshw ater algal blooms,with an emphasison cyanobacteria[J].Scientific Wor ld Journal,2001,4(1):76-113.[3]Duy T N,Lam P K S,Shaw G R,et al.T ox icologyand risk assessment of fresh-water cyanobacterial(blue-g reen algae)tox ins in w ater[J].Rev Env ironContam T ox icol,2000(163):113-186.[4]Zhang M M,Pan U,Yan H,et al.A met hod to ex-tract algae tox in of microcystin-LR[J].Env ironSci.(China),2004,16(4):694-696.[5]Gregor J,M arsalek B.F reshw ater phytoplanktonquantification by chlo rophyll-a:a comparative studyof in v itro,in viv o and in situ methods[J].Water Re-search,2004,38(3):517-522.[6]P into A,V on Sper ling E,Mor eor a R.Chlorophy ll-adetermination via continuous measurement of plank-ton fluor escence:methodology development[J].WaterResearch,2001,35(16):3977-3981.[7]贺小芮,周俊杰.倒置显微镜计数法检测浮游藻类[J].中国给水排水,2004,20(11):98-100.[8]韩桂春,谷丰,张忠臣.淡水中叶绿素a测定方法的探讨[J].中国环境检测,2005,21(1):55-57. [9]国家环境保护局,5水和废水监测分析方法6编委会.水和废水监测分析方法[M].北京:中国环境科学出版社,2002.[10]张新,刘洪林,王素芬.分光光度法测定叶绿素a含量的方法探讨[J].山东水利,2002(3):39-40.Test of Factors Influencing Chlorophyl-l a in Water Algal bySpectrophotometryZH A O Yuhua,L I U Chang,X UE Fei,F U Jinx iang(School of M unicipal and Environmental Engineering,Sheny ang Jianzhu U niv ersity,Shenyang110168,China)Abstract:In the paper chlorophyl-l a in water algal is measured by spectrophotometry.Glass centrifuge tube and plastic centrifuge tube are used for separateing algal from w ater.The fluid sam ple is deepfrozen in re-frigeratory under4e for different time during separating chlorophyl-l a from algal.After the fluid sample is put in spectrophotometer for different time,w hich is called stabilization time,the absorbency of the sample is taken.The test result indicates that chlorophyl-l a of fluid sample measured through plastic centrifuge tube is averagely hig her by30.1%than glass tube because of plastic disturbance.If stabilizing for less than5 minutes chlorophyl-l a of fluid sample increases rapidly along w ith stabilization time increasing.If stabilizing for more than5minute chlorophyl-l a increases very slow ly,so the suitable stabilization time is5minutes to 10minutes.If deepfreezing for less than6hours chlorophyl-l a of fluid sample increases averagely by1.92L g per litre per hour along w ith the increase of the teepfreezing tim e.If stabilizing for over6hours chlorophyl-l a increases very slow ly,so the suitable teepfreeze time is6hours to8hours.Key words:algal;chlorophyl-l a;spectrophotometry;centrifuge tube material484沈阳建筑大学学报(自然科学版)第23卷。