大豆菌核病菌不同菌丝亲和群的遗传差异性研究
大豆抗病基因定位与功能解析
大豆抗病基因定位与功能解析近年来，农作物病虫害的防治一直是农业生产中亟待解决的一个问题。
而遗传改良则是一种常用的病虫害防治手段。
大豆是我们国家的主要农作物之一，在大豆的遗传改良中，抗病是一个重要的方向之一。
本文将介绍大豆抗病基因的定位与功能解析的相关研究进展。
一、大豆抗病基因的分类与定位大豆目前已知的病害主要包括枯萎病、霜霉病、疫霉病、紫斑病、叶斑病等几种。
这些病害的抗性是由多个基因共同控制的，因此，研究大豆抗病基因的分类，可以为基因的定位与功能解析提供依据。
据研究，大豆抗病基因可以分为两大类，一类是与植物内源性免疫相关的基因，存在于不同的信号通路中，如PR基因、NBS-LRR基因等。
其次是细菌或病毒感染时产生的基因，称为病菌感官基因，通常是一类反应病原物质的基因。
基因定位是研究大豆抗病基因的关键环节之一，其核心是建立分子标记图谱并与物种基因组进行匹配。
通常采用两种方法进行大豆基因的定位：基于物种群体的基因定位方法和基于整个基因组的定位方法。
二、大豆抗病基因的功能解析基因定位只是研究大豆抗病基因的第一步，与之紧密相连的是对基因功能的解析。
当前，大豆基因功能解析的主要方法包括全基因组的RNA测序、转录组分析和基因沉默等技术手段。
这些技术不仅可以有效地鉴定出大豆基因功能上的差异，还可以解析其与其他基因的相互作用。
通过以上研究手段，人们发现大豆抗病基因的功能非常丰富多样。
比如，人们在研究PR基因时发现，大豆PR基因的活性与其遗传多样性密切相关，并且这种遗传多样性是由大豆叶片表面微生物群落的形成决定的。
同时，一项最新研究指出，大豆中的基因IFNL4参与了大豆发育和抗病的作用。
三、大豆抗病基因研究的意义与前景大豆作为国民经济支柱产业之一，对我国的经济发展和农村社会的建设都具有十分重要的地位。
而在大豆生产中，病虫害的防治是农民面临的首要问题。
因此，研究大豆抗病基因的定位与功能解析，对于提高大豆品种的抗病能力以及减少经济损失具有深远的意义。
大豆高效自生固氮菌分离鉴定与特性研究
大豆高效自生固氮菌分离鉴定与特性研究一、研究背景随着全球人口的增长和经济的发展，粮食需求不断上升，大豆作为重要的粮食作物之一，其产量和质量对保障国家粮食安全具有重要意义。
然而当前大豆生产面临着土壤肥力下降、病虫害严重、抗逆性差等问题，这些问题严重影响了大豆的产量和品质。
为了解决这些问题，研究大豆高效自生固氮菌的分离鉴定与特性具有重要的理论和实践价值。
大豆生长过程中需要大量的氮素营养，而土壤中的氮素资源有限，因此大豆根系对氮素的需求量较大。
传统农业生产中，常采用施用化肥的方法补充氮素，但这种方法不仅成本较高，而且容易导致土壤板结、酸化等问题。
因此寻找一种能够提高大豆抗逆性、增加产量、减少化肥使用的方法显得尤为重要。
自生固氮菌是一种能够在无外部氮源条件下实现固氮的微生物，具有较高的固氮活性和广泛的适应性。
研究表明自生固氮菌能够改善土壤结构、提高土壤肥力、促进植物生长等，对于提高大豆产量和品质具有潜在的应用价值。
目前关于大豆高效自生固氮菌的研究主要集中在菌种筛选、生理特性分析等方面，尚未形成系统的理论体系和技术路线。
因此本研究旨在通过对大豆高效自生固氮菌的分离鉴定与特性研究，揭示其在大豆生产中的应用潜力，为大豆高产、优质、抗逆性的实现提供理论依据和技术支持。
A. 大豆作为重要的粮食和经济作物，对氮肥的需求量较大大豆作为重要的粮食和经济作物，对氮肥的需求量较大。
由于大豆根系发达，能够吸收土壤中的大量氮元素，因此在农业生产中，氮肥的施用对于大豆的生长具有重要意义。
然而传统的氮肥施用方式往往会导致土壤中氮素的积累和流失，从而影响大豆的产量和品质。
因此研究大豆高效自生固氮菌的分离鉴定与特性，对于提高大豆抗逆性、减少氮肥施用量、保障粮食安全具有重要意义。
通过筛选和鉴定大豆高效自生固氮菌，可以为大豆生产提供一种新的氮肥替代方案。
这些菌株能够在大豆根际土壤中产生固氮酶，将空气中的氮气转化为植物可吸收的形式，从而降低对传统化肥的依赖。
木蝴蝶内生真菌分离鉴定及促生功能初步研究
引文格式：许娟娟, 房佳茹, 周士家, 等. 木蝴蝶内生真菌分离鉴定及促生功能初步研究[J]. 云南农业大学学报(自然科学),2023, 38(5): 878−885. DOI: 10.12101/j.issn.1004-390X(n).202206072木蝴蝶内生真菌分离鉴定及促生功能初步研究*许娟娟1， 房佳茹1， 周士家1， 李 伟2，孙正海1 **(1. 西南林业大学 园林园艺学院，云南省面向南亚东南亚经济林全产业链联合研发中心，云南省观赏草集成利用国际联合研发中心，云南省高效经济林培育示范型国际科技合作基地，云南 昆明 650224；2. 云南吉成园林科技股份有限公司，云南 弥勒 652339)摘要: 【目的】解析木蝴蝶[Oroxylum indicum (L.) Vent.]内生真菌的种类及其促生功能。
【方法】以木蝴蝶树皮、种子、果皮和叶片为材料分离鉴定内生真菌，依据生理指标对分离的内生真菌促生活性进行分析；选取部分代表性内生真菌转接到黄豆植株进行培养，以黄豆产量指标验证其实际促生效果。
【结果】从木蝴蝶树皮、种子、果皮和叶片中分离得到50株内生真菌，隶属于13属23种，其中果皮部位分离菌株最多，炭疽属(Colletotrichum )为优势菌属；9株代表性真菌均具有产吲哚乙酸和固氮的能力，其中6株真菌还具有溶磷和解钾特性。
转接栽培试验结果表明：9株菌处理后黄豆果荚数增加5%~75%，产量提高37%~231%；其中壳青霉(Penicillium crustosum )促生效果最好。
【结论】本研究首次开展了木蝴蝶内生真菌的分离研究，并对其功能进行了验证，其中壳青霉促生效果最好，转接黄豆后可提高其果荚数和产量，具有开发为微生物菌肥的潜力。
关键词: 木蝴蝶；内生真菌；纯培养分离；促生功能中图分类号: S718.81 文献标志码: A 文章编号: 1004–390X (2023) 05−0878−08Isolation and Identification of Endophytic Fungi from Oroxylumindicum (L.) Vent. and Preliminary Study onIts Growth Promoting FunctionXU Juanjuan 1，FANG Jiaru 1，ZHOU Shijia 1，LI Wei 2，SUN Zhenghai 1(1. College of Landscape and Horticulture of Southwest Forestry University, Yunnan Province Joint R & D Center for the Whole Industry Chain of Economic Forests in South Asia and Southeast Asia, Yunnan Ornamental Grass Integ-rated Utilization International Joint R & D Center, International Science and Technology Cooperation Base of HighEffective Economic Forestry Cultivation Demonstration of Yunnan Province, Kunming 650224, China;2. Yunnan Jicheng Landscape Technology Co., Ltd., Mile 652339, China)Abstract: ［Purpose ］To analyze the species and growth promoting functions of endophytic fungi in Oroxylum indicum (L.) Vent. ［Methods ］Endophytic fungi were isolated from the bark, seeds,pericarps and leaves of O. indicum , and the growth promoting activity of the isolated endophytic fungi was analyzed according to physiological indexes. Some representative endophytic fungi were selec-云南农业大学学报（自然科学），2023，38(5)：878−885Journal of Yunnan Agricultural University (Natural Science)E-mail: ********************收稿日期：2022-06-29 修回日期：2023-08-20 网络首发日期：2023-10-09*基金项目：云南省重点研发计划 (2019IB011)。
甘蓝型油菜抗菌核病研究进展_吴健.
中国油料作物学报Chinese Journal of Oil Crop Sciences 2013，35（5）：608－615doi ：10．7505/j．issn．1007－9084．2013．05．022甘蓝型油菜抗菌核病研究进展吴健，涂江颖，周永明（华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室；国家油菜工程技术研究中心；农业部油菜遗传育种重点实验室，湖北武汉，430070）摘要：由真菌核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum ）引起的油菜菌核病是世界范围内最严重的病害之一，也是影响油菜高产稳产的主要生物逆境。
选育抗菌核病油菜品种并在生产上大面积种植是防控菌核病最经济有效和环保的途径。
本文从核盘菌的致病机理、油菜抗菌核病的遗传控制、抗病基因表达谱和抗性相关基因的应用等方面综述了油菜抗菌核病研究有关的最新进展。
关键词：甘蓝型油菜；菌核病；致病机理；遗传规律；QTL ；基因表达谱；抗病基因中图分类号：S435．654文献标识码：A文章编号：1007－9084（2013）05－0608－08Advances in studies on the resistance to Sclerotinia stem rot in Brassica napusWU Jian ，TU Jiang －ying ，ZHOU Yong －ming *（National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement ，National Ｒesearch Center of Ｒapeseed Engineering and Technology ，MOA Key Laboratory of Ｒapeseed Genetics and Breeding ，Huazhong Agricultural University ，Wuhan 430070，China ）Abstract ：Sclerotinia stem rot of oilseed rape （Brassica napus ）caused by fungal pathogen Sclerotinia scleroti-orum is one of the most devastating diseases worldwide．It is one of the most important biotic stressorses affecting oilseed rape production．Breeding and cultivation of resistant varieties is the most efficient ，economic and environ-mental friendly approach to control the disease．In this paper ，research progresses wasere reviewed in aspects of S．sclerotiorum pathogenesis ，rapeseed resistance heredity ，gene expression profiles responding to the disease infection and application of resistance genes in oilseed rape．Key words ：Brassica napus ；Sclerotinia stem rot ；Pathogenesis ；Heredity ；QTL ；Gene expression profile ；Disease resistance －related genes收稿日期：2013-06-24基金项目：国家油菜现代农业产业体系（nycytx －00503作者简介：吴健（1986－），男，江苏宜兴人，博士研究生，主要从事油菜抗菌核病QTL 定位及分子机制研究*通讯作者：周永明，男，博士生导师，教授，主要从事油菜遗传育种和生物技术研究，E －mail ：ymzhou@mail．hzau．edu．cn 核盘菌是一种非寄主特异性真菌病原菌，可以侵染包括很多重要经济作物在内的400多个植物物种，如油菜、大豆、苜蓿和向日葵等［1，2］。
江苏省油菜菌核病菌群体遗传结构分析的开题报告
江苏省油菜菌核病菌群体遗传结构分析的开题报告一、研究背景及意义油菜菌核病是一种由真菌菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的病害，能够感染多种作物，如油菜、豌豆、大豆、马铃薯等，严重破坏作物生产。
目前，油菜菌核病已成为油菜生产中的主要病害之一，对油菜的产量和品质造成了严重的影响。
为了有效控制油菜菌核病，需要深入了解该病害的遗传结构和群体结构。
江苏省作为中国重要的油菜种植区之一，油菜菌核病的研究对于提高江苏省油菜生产的质量和数量具有重要意义。
因此，本研究旨在通过分析江苏省油菜菌核病菌群体的遗传结构，为控制和预防该病害提供科学依据。
二、研究内容和方法1.搜集不同地理分布区域的油菜菌核病样品并进行分离纯化。
2.利用ISSR分子标记技术对油菜菌核病样品进行遗传多样性分析。
3.根据ISSR遗传多样性分析结果，利用POPGENE软件计算样本间的遗传距离，并构建遗传距离矩阵。
4.根据遗传距离矩阵，利用UPGMA聚类分析法对不同样品进行聚类分析，并绘制聚类树。
5.对聚类树进行Bootstrap分析，评估聚类结果的可靠性和稳定性。
6.基于聚类分析结果，分析不同地理分布区域的油菜菌核病菌群体的遗传结构和演化规律。
三、预期结果及其意义通过对江苏省油菜菌核病菌群体的遗传结构分析，预计可以得到以下结果：1.江苏省不同地理分布区域的油菜菌核病菌群体存在较高的遗传多样性，但是由于地理隔离等原因，不同区域之间的遗传分化程度存在差异。
2.基于聚类分析的结果，不同地理分布区域的油菜菌核病菌群体可以被分为若干个亚群。
3.针对不同亚群之间的遗传距离和演化规律的分析，可以为油菜菌核病的控制和预防提供科学依据。
本研究的预期结果将为油菜菌核病的防治提供科学依据，并对油菜菌核病菌群体的遗传演化规律进行深入研究，为油菜菌核病的防治和相关作物的遗传改良提供重要参考。
大豆根瘤菌与促生菌复合系筛选及机理研究_薛晓昀
4℃ 下保存。 化后， 1． 2． 2 产生长素 （ IAA ） 能力定性测定 将分离得 到菌株与试验室提供菌株接种于盛有 50 mL 刚果红 －1 培养基的三角瓶中， 置于转速 125 r · min ， 温度 ［8 ］ 28℃ 的摇床培养 ， 每菌株 3 次重复， 培养 12 d 后， 取菌悬浮液 100 μL 此置于白色塑料比色板上， 加 100 μL 的比色液， 15 min 后观察颜色变化。粉红色 为阳性， 表示菌株能够分泌 IAA， 粉红色颜色越深表 示分泌 IAA 能力越大； 无色为阴性， 表示菌株不能分 －1 IAA 。 10 、 30 在比色液中分别加入 和 50 mg · L 泌 IAA 作对照进行粉红色颜色深度的比较［9］。 1． 2． 3 将分离得到菌株与试 28℃ 培养 4 验室提供菌株接种于到溶磷培养基上， 溶磷能力定性测定
Table 1
菌株 Strains 胶冻样类芽孢杆菌（ Paenibacillus mucilaginosus） DB 多粘类芽孢杆菌 （ Paenibacillus polymyxa） CGMCC1． 0224 多粘类芽孢杆菌 （ Paenibacillus polymyxa） SC2 1． 108 枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis） CGMCC1． 15 ， 10040 荧光假单胞菌（ Psendomonas fluorescens） ACCC10645 ， 巨大芽孢杆菌（ Bacillus megaterium） CCTCCA 92075 T 日本慢生大豆根瘤菌 （ Bradyrhizobium japonicum） 4219 弗氏中华大豆根瘤菌 （ Sinorhizobium fredii） 4644 促生菌 P4 ， 促生菌 P7 ， 促生菌 P13 ， 促生菌 P14 3， 13 促生菌 1促生菌 2-
大豆生物学与基础遗传学研究
大豆生物学与基础遗传学研究大豆，是一种极为重要的作物，是我们日常饮食中的重要来源之一。
然而，对于许多人来说，大豆只是一个食材，一个常见的食品原材料。
实际上，大豆在农业、生物学甚至人类历史上都有着极为重要的地位，尤其是在基础遗传学研究中，大豆也是一个极为重要的模式生物。
从生物学层面来说，大豆是一种十分特别的植物，作为固氮植物，大豆拥有着许多独特的生理特征。
固氮植物能够通过根瘤中的根瘤菌将空气中的氮转化为植物可用的氮素，从而为自身提供重要的养分。
这对于农业来说具有巨大的意义，在农业生产中，种植水稻与小麦等传统农作物的同时，通过种植大豆来提高土地的养分，一直是农业生产中的主要策略之一。
另外，大豆还是一种极为复杂的植物系统，其基因组大小为950Mb，是除了烟草外已知的与基因组大小最近似的植物。
大豆的基因组拥有40,000-50,000个基因，其中富含优良的农艺性状基因，有着广泛的应用前景。
这也是为什么大豆成为了基础遗传学研究的理想模式生物的原因之一。
基础遗传学研究是现代遗传学的基础研究，是研究生命的基本结构和功能等遗传基础的学科。
在基础遗传学的研究中，大豆是一种非常重要的模式生物。
首先，大豆是一种极为复杂的群体，其基因组表现出了显著的基因组重塑现象。
研究大豆的基因组重塑在深入理解物种进化、遗传演化和基因组进化等方面均具有重要意义。
另外，由于大豆拥有着丰富的遗传变异，这使得研究人员可以从大豆中挑选出具有特定性状的个体进行深入研究。
这对于遗传学研究来说具有重要的意义，使得研究人员可以深入理解不同基因对物种形成和进化过程的影响。
在大豆的基因研究中，许多经典遗传学实验方法都能够被很好地应用。
例如孟德尔守则的适用已经被多次证实。
此外，大豆还被广泛应用在等位基因分析、基因定位和基因克隆方面的研究中，并在这些方面都取得了重要的研究成果。
在国内，大豆研究得到了广泛的关注和支持。
例如，华南农业大学成立了“国家基础研究重点发展计划大豆分子育种创新团队”，有力地促进了大豆基因研究和育种工作的开展。
溴氰虫酰胺对小菜蛾幼虫肠道真菌群落的影响
㊀山东农业科学㊀２０２３ꎬ５５(７):７３~７９ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２３.０７.０１０收稿日期:２０２２－０９－１４基金项目:国家自然科学基金项目 肠道微生物对小菜蛾耐受溴氰虫酰胺胁迫的作用与机制 (３１８６０５０９)作者简介:陈华璋(１９７５ )ꎬ男ꎬ贵州仁怀人ꎬ硕士ꎬ副研究员ꎬ主要从事农业栽培及推广应用工作ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｃｈｚ６８０８１＠ｓｉｎａ.ｃｏｍ通信作者:李文红(１９８３ )ꎬ女ꎬ江西吉安人ꎬ博士ꎬ副研究员ꎬ主要从事农业昆虫与害虫防治研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｌｉｗｈ２０１５＠１２６.ｃｏｍ溴氰虫酰胺对小菜蛾幼虫肠道真菌群落的影响陈华璋１ꎬ郑苹２ꎬ田旭３ꎬ汪汉成２ꎬ向立刚３ꎬ李文红４(１.贵州省农业科学院旱粮研究所ꎬ贵州贵阳㊀５５０００６ꎻ２.贵州省烟草科学研究院ꎬ贵州贵阳㊀５５００８１ꎻ３.长江大学农学院ꎬ湖北荆州㊀４３４０００ꎻ４.贵州省农业科学院植物保护研究所ꎬ贵州贵阳㊀５５０００６)㊀㊀摘要:昆虫肠道共生真菌对宿主的生长发育㊁食物吸收与消化以及防御等多种生命活动有重要意义ꎮ为了解第二代鱼尼丁受体抑制剂溴氰虫酰胺作用小菜蛾后对其肠道真菌群落的影响ꎬ本研究采用传统分离培养法和高通量测序技术研究了１ｍｇ/Ｌ溴氰虫酰胺浸叶饲喂与未经处理的小菜蛾幼虫肠道真菌群落组成ꎮ结果表明ꎬ小菜蛾肠道可培养优势真菌主要为青霉菌(Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｓｐ.)和盾壳霉菌(Ｃｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍｓｐ.)ꎬ经溴氰虫酰胺处理后的小菜蛾肠道可培养真菌还包括曲霉菌(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｐ.)和黄瓜织球壳菌(Ｐｌｅｃｔｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａｃｕｃｕｍｅ￣ｒｉｎａ)ꎮ高通量测序表明ꎬ小菜蛾幼虫肠道优势真菌门为子囊菌门(Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ)㊁担子菌门(Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ)㊁毛霉门(Ｍｕｃｏｒｏｍｙｃｏｔａ)等ꎬ优势菌属为平脐蠕孢属(Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ)㊁镰刀菌属(Ｆｕｓａｒｉｕｍ)㊁散尾鬼笔属(Ｌｙｓｕｒｕｓ)㊁枝孢属(Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ)和赤霉菌属(Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ)等ꎮ１ｍｇ/Ｌ溴氰虫酰胺浸叶饲喂后ꎬ小菜蛾肠道中担子菌门㊁镰刀菌属和散尾鬼笔属等相对丰度显著降低ꎬ而平脐蠕孢属相对丰度显著增加ꎻ小菜蛾肠道真菌群落丰富度和多样性也有增加但不显著ꎮ功能预测表明小菜蛾幼虫肠道真菌群落主要功能为植物病原菌㊁土壤木材腐生菌以及植物内生菌等类群ꎮ可见ꎬ溴氰虫酰胺处理后小菜蛾幼虫肠道中真菌种类及其功能无显著变化ꎬ仅对其相对丰度和数量有较大影响ꎮ关键词:小菜蛾ꎻ溴氰虫酰胺ꎻ肠道真菌菌群ꎻ高通量测序中图分类号:Ｓ４３３.４㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２３)０７－００７３－０７ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＣｙａｎｔｒａｎｉｌｉｐｒｏｌｅｏｎＧｕｔＦｕｎｇａｌＣｏｍｍｕｎｉｔｙｉｎＰｌｕｔｅｌｌａｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ(Ｌ.)ＬａｒｖａｅＣｈｅｎＨｕａｚｈａｎｇ１ꎬＺｈｅｎｇＰｉｎｇ２ꎬＴｉａｎＸｕ３ꎬＷａｎｇＨａｎｃｈｅｎｇ２ꎬＸｉａｎｇＬｉｇａｎｇ３ꎬＬｉＷｅｎｈｏｎｇ４(１.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＵｐｌａｎｄＣｒｏｐｓꎬＧｕｉｚｈｏｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＧｕｉｙａｎｇ５５０００６ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＧｕｉｚｈｏｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＴｏｂａｃｃｏＳｃｉｅｎｃｅꎬＧｕｉｙａｎｇ５５００８１ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬＹａｎｇｔｚｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＪｉｎｇｚｈｏｕ４３４０００ꎬＣｈｉｎａꎻ４.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬＧｕｉｚｈｏｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＧｕｉｙａｎｇ５５０００６ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｉｎｓｅｃｔｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｓｙｍｂｉｏｔｉｃｆｕｎｇｉａｒｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｏｒｈｏｓｔｌｉｆｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｓｕｃｈａｓｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌ￣ｏｐｍｅｎｔꎬｆｏｏｄａｂｓｏｒｐｔｉｏｎａｎｄｄｉｇｅｓｔｉｏｎꎬａｎｄｄｅｆｅｎｓｅ.Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅｓｅｃｏｎｄ￣ｇｅｎｅｒａ￣ｔｉｏｎｒｙａｎｏｄｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｙａｎｔｒａｎｉｌｉｐｒｏｌｅｏｎｔｈｅｇｕｔｆｕｎｇａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｏｆＰｌｕｔｅｌｌａｘｙｌｏｓｔｅｌｌａꎬｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｃｕｌｔｕｒｅ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍｅｔｈｏｄａｎｄｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｇｕｔｆｕｎｇａｌｃｏｍｍｕ￣ｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＰ.ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａｆｅｄｗｉｔｈ１ｍｇ/Ｌｃｙａｎｔｒａｎｉｌｉｐｒｏｌｅａｎｄｎｏ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｄｏｍｉｎａｎｔｃｕｌｔｕｒａｂｌｅｇｕｔｆｕｎｇｉｏｆＰ.ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａｗｅｒｅｍａｉｎｌｙＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｓｐ.ａｎｄＣｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍｓｐ.ꎬａｎｄｔｈｅｒｅｗｅｒｅａｌｓｏＡｓ￣ｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｐ.ａｎｄＰｌｅｃｔｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａｃｕｃｕｍｅｒｉｎａａｆｔｅｒｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｃｙａｎｔｒａｎｉｌｉｐｒｏｌｅ.Ｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｄｏｍｉｎａｎｔｇｕｔｆｕｎｇａｌｐｈｙｌｕｍｗｅｒｅＡｓｃｏｍｙｃｏｔａꎬＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａａｎｄＭｕｃｏｒｏｍｙｃｏｔａꎬａｎｄｔｈｅｄｏｍｉｎａｎｔｇｅｎｅｒａｗｅｒｅＢｉｐｏｌａｒｉｓꎬＦｕｓａｒｉｕｍꎬＬｙｓｕｒｕｓꎬＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍａｎｄＧｉｂｂｅｒｅｌｌａꎬｅｔｃ.Ａｆｔｅｒｆｅｅｄｉｎｇｗｉｔｈ１ｍｇ/ＬｃｙａｎｔｒａｎｉｌｉｐｒｏｌｅꎬｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅａｂｕｎｄａｎｃｅｏｆＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａꎬＦｕｓａｒｉｕｍａｎｄＬｙｓｕｒｕｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅ￣ｃｒｅａｓｅｄꎬｗｈｉｌｅｔｈａｔｏｆＢｉｐｏｌａｒｉｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄꎻｔｈｅｒｉｃｈｎｅｓｓａｎｄｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｆｕｎｇａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙａｌｓｏｉｎ￣ｃｒｅａｓｅｄｂｕｔｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ.Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｍａｉｎｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｆｕｎｇａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｗｅｒｅｄｏｍｉｎａｔｅｄｂｙｐｌａｎｔｐａｔｈｏｇｅｎｓꎬｓｏｉｌａｎｄｗｏｏｄｓａｐｒｏｔｒｏｐｈａꎬａｎｄｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ.Ｉｎｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎꎬｔｈｅｒｅｗｅｒｅｎｏｓｉｇ￣ｎｉｆｉｃａｎｔｃｈａｎｇｅｓｉｎｔｈｅｇｕｔｆｕｎｇａｌｓｐｅｃｉｅｓａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆＰ.ｘｙｌｏｓｔｅｌａｆｔｅｒｆｅｄｗｉｔｈ１ｍｇ/Ｌｃｙａｎｔｒａｎｉｌｉｐｒｏｌｅꎬｂｕｔｔｈｅｒｅｗｅｒｅｇｒｅａｔｅｆｆｅｃｔｓｏｎｔｈｅｆｕｎｇａｌｒｅｌａｔｉｖｅａｂｕｎｄａｎｃｅａｎｄａｍｏｕｎｔ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＰｌｕｔｅｌｌａｘｙｌｏｓｔｅｌｌａꎻＣｙａｎｔｒａｎｉｌｉｐｒｏｌｅꎻＧｕｔｆｕｎｇａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙꎻＨｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ㊀㊀昆虫体内微生物与其生命活动密切相关ꎬ影响昆虫的交配[１]㊁对寄主植物的选择[２]㊁昆虫寿命[３]以及对病原菌的抵抗力[４]等ꎮ小菜蛾[Ｐｌｕ￣ｔｅｌｌａｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ(Ｌ.)]是危害十字花科作物最为严重的害虫之一ꎬ常导致甘蓝㊁西兰花㊁芥菜㊁油菜㊁萝卜和花菜等多种重要蔬菜严重的经济损失[５]ꎮ肠道是其重要的生命器官ꎬ栖息着大量的微生物ꎬ其中细菌的丰富度和多样性较高ꎮ目前ꎬ已报道的小菜蛾肠道细菌有蒙氏肠球菌(Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｍｕｎｄｔｉｉ)㊁粘质沙雷菌(Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ)㊁肉杆菌(Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍａｌｔａｒｏｍａｔｉｃｕｍ)等[６－８]ꎮ这些肠道细菌对食物的消化㊁宿主的生长发育与环境适应性均起着积极作用[６ꎬ８]ꎮ相较而言ꎬ有关小菜蛾肠道真菌群落的研究较少ꎮ当前ꎬ化学方法是防控小菜蛾最为经济有效的手段ꎮ溴氰虫酰胺为双酰胺类杀虫剂ꎬ以昆虫鱼尼丁受体为靶标ꎬ导致昆虫细胞无限制释放钙离子ꎬ使其肌肉麻痹㊁瘫痪㊁停止取食ꎬ最终死亡[９ꎬ１０]ꎮ该药剂自２０１２年上市以来便被广泛应用于小菜蛾的防治ꎬ且效果良好[１１]ꎮ杀虫剂在发挥其作用的同时也影响着昆虫肠道微生物的组成和生理代谢活动[１２ꎬ１３]ꎻ同时部分肠道微生物也影响着宿主对包括农药在内的有害物质的降解[１４]㊁抗药性的产生[１５]以及抵御病原微生物的入侵[１６]等ꎮ前期研究发现溴氰虫酰胺浸叶饲喂小菜蛾ꎬ其肠道厚壁菌门和肠球菌属相对丰度均显著降低ꎬ而蓝细菌门和血杆菌属相对丰度均显著增加ꎬ同时小菜蛾肠道细菌群落多样性㊁均匀度和丰富度整体呈增加趋势ꎬ且多样性和丰富度增幅显著(待发表)ꎮ但该药剂是否对小菜蛾肠道真菌群落结构存在影响尚不清楚ꎮ微生物纯培养方法为传统研究技术ꎬ能顺利获得后续研究的微生物菌株材料[１７]ꎬ高通量测序技术虽不能获得活的菌株材料ꎬ但能够较为全面了解肠道微生物菌群组成与多样性特征[１８]ꎮ将两种技术相结合用于小菜蛾肠道真菌的研究可以更全面地了解小菜蛾肠道真菌菌群结构与多样性特征ꎬ从而深入探寻溴氰虫酰胺浸叶饲喂处理对其肠道真菌群落的影响规律ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料供试小菜蛾为溴氰虫酰胺敏感品系ꎬ由贵州省农业科学研究院植物保护研究所昆虫研究室长期室内饲养ꎮ９７％溴氰虫酰胺(ｃｙａｎｔｒａｎｉｌｉｐｒｏｌｅ)原药由美国杜邦公司生产ꎮＰＤＡ培养基(ＨＢ０２３３－１２ꎬ青岛海博生物技术有限公司)ꎬＤＮＡ提取试剂盒(ＤＰ３０７ꎬＴＩＡＮＧＥＮ)ꎮ１.２㊀试验方法１.２.１㊀基于传统分离培养法的小菜蛾肠道真菌群落研究㊀前期研究发现溴氰虫酰胺对小菜蛾的半致死浓度(ＬＣ５０)为０.１４３ｍｇ/Ｌꎮ本研究用含０.１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００(Ｔ８２００ꎬＳｏｌａｒｂｉｏ)的无菌水配制１ｍｇ/Ｌ溴氰虫酰胺药液ꎬ浸泡新鲜甘蓝叶片３０ｓ后取出晾干至表面无水痕ꎬ放入小菜蛾饲养盒中ꎬ并接入生长一致的３龄小菜蛾幼虫ꎬ以相同体积的含０.１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００无菌水处理甘蓝叶片饲喂的小菜蛾幼虫作为对照ꎮ１２ｈ后ꎬ从对照组和溴氰虫酰胺处理组中分别随机挑选健康且大小一致的小菜蛾幼虫１００头ꎬ饥饿４ｈ后置于７５％乙醇中体表消毒９０ｓꎬ再用０.８％生理盐水冲洗３次ꎬ最后在超净工作台上解剖挑取肠道ꎮ肠道组织放入２ｍＬ无菌离心管中４ħ保存备用ꎮ向离心管中加入１ｍＬＰＢＳ缓冲液(Ｐ１０２２ꎬＳｏｌａｒｂｉｏ)后使用组织研磨器进行充分研磨ꎬ随后用ＰＢＳ缓冲液将研磨液分别稀释成１０－１㊁１０－２㊁１０－３ꎮ分别取５０μＬ上述不同浓度稀释液均匀涂４７㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀布于含１％硫酸链霉素(Ｓ８２９０ꎬＳｏｌａｒｂｉｏ)和氨苄青霉素钠(Ａ８１８０ꎬＳｏｌａｒｂｉｏ)的ＰＤＡ培养基上ꎬ每个浓度３次重复ꎬ置于２８ħ恒温培养箱黑暗培养７ｄꎮ期间每天观察培养基上菌落的生长情况ꎬ一旦有新菌落出现ꎬ便从菌落边缘挑取菌丝转接至新的ＰＤＡ培养基上进行纯化ꎮ对纯化后的菌株进行编号ꎬ并接种于ＰＤＡ斜面培养基上ꎬ４ħ冰箱保存备用ꎮ使用真菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒提取纯化菌株的ＤＮＡꎬ基因组经稀释后ꎬ以ＩＴＳ１/ＩＴＳ４为引物扩增其转录间隔区ＩＴＳ区ꎬＰＣＲ反应条件及体系参考吴燕燕等[１７]的方法ꎮ扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序ꎬ测序结果在ＧｅｎＢａｎｋ数据库中进行ＢＬＡＳＴｎ比对分析ꎮ１.２.２㊀基于高通量测序技术的小菜蛾肠道真菌群落研究㊀按１.２.１方法处理小菜蛾ꎬ对照组和溴氰虫酰胺处理组分别随机挑选小菜蛾幼虫２００头ꎬ收集肠道组织ꎮ采用土壤基因组ＤＮＡ提取试剂盒(ＤＰ３３６ꎬＴＩＡＮＧＥＮ)提取小菜蛾幼虫肠道微生物总ＤＮＡꎬ每样品取１００头幼虫肠道ꎬ每组重复２次(对照组:ＳＣＫ１㊁ＳＣＫ２ꎻ溴氰虫酰胺处理组:ＳＪＹ１㊁ＳＪＹ２)ꎮ随后采用超微量分光光度计检测其质量与浓度ꎮ以检测合格的ＤＮＡ为模板ꎬ采用ＩＴＳ１Ｆ和ＩＴＳ２通用引物进行ＰＣＲ扩增ꎬ扩增体系与程序参考苏日娜等[１９]的方法ꎮ扩增产物经纯化后送至北京诺禾致源生物科技有限公司ꎬ采用ＰａｃＢｉｏＳｅｑｕｅｌ平台进行三代扩增子测序ꎮ首先通过ＱＩＩＭＥ２(２０１９.４)软件ｑｉｉｍｅｃｕｔａｄａ￣ｐｔｔｒｉｍ－ｐａｉｒｅｄ程序切除序列的引物片段ꎬ弃去未匹配引物的序列ꎻＤＡＤＡ２进行质控㊁去噪㊁拼接㊁去嵌合体ꎻ采用ｃｌａｓｓｉｆｙ－ｓｋｌｅａｒｎ算法[２０]将过滤后的序列与ＵＮＩＴＥ数据库进行物种分类学注释ꎻ使用ｑｉｉｍｅｆｅａｔｕｒｅ－ｔａｂｌｅｒａｒｅｆｙ功能ꎬ对样品中的序列进行抽平ꎬ用于后续Ａｌｐｈａ㊁Ｂｅｔａ多样性分析等ꎻ运用Ｒ语言和ｇｇｐｌｏｔ２包计算样品微生物群落香农(Ｓｈａｎｎｏｎ)[２１]㊁辛普森(Ｓｉｍｐｓｏｎ)[２２]㊁Ｃｈａｏ１[２３]㊁测序深度指数(Ｏｂｓｅｒｖｅｄｓｐｅｃｉｅｓ)㊁皮诺(Ｐｉｅｌｏｕ)[２４]和覆盖度(Ｇｏｏｄ ｓｃｏｖｅｒａｇｅ)[２５]等Ａｌ￣ｐｈａ多样性指数ꎻ通过Ｒ语言㊁ａｐｅ包等基于Ｂｒａｙ－Ｃｕｒｔｉｓ距离[２６]进行Ｂｅｔａ多样性分析及主坐标分析(ＰＣｏＡ)ꎻ使用ＦｕｎＧｕｉｌｄ对真菌群落进行功能预测分析ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀溴氰虫酰胺对小菜蛾幼虫肠道可培养真菌的影响由表１可知ꎬ溴氰虫酰胺处理显著增加了小菜蛾肠道可培养真菌种类ꎬ但明显降低了真菌总数ꎮ对照组共获得５７株真菌ꎬ溴氰虫酰胺处理组共获得２２株真菌ꎮ根据真菌的形态及分子鉴定ꎬ对照组的５７株真菌分别为青霉菌(Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｓｐ.ꎬ４２株)和盾壳霉菌(Ｃｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍｓｐ.ꎬ１５株)ꎻ溴氰虫酰胺处理组的２２株真菌分别属于曲霉菌(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｐ.ꎬ４株)㊁青霉菌(Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｓｐ.ꎬ８株)㊁盾壳霉菌(Ｃｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍｓｐ.ꎬ６株)和黄瓜织球壳菌(Ｐｌｅｃｔｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａｃｕｃｕｍｅｒｉｎａꎬ４株)ꎮ㊀㊀表１㊀小菜蛾肠道可培养真菌分类及统计物种菌落形态对照组溴氰虫酰胺处理组Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｐ.菌落白色ꎬ中央有黄色孢子０４Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｓｐ.菌落青色ꎬ边缘白色ꎬ背面黄色４２８Ｃｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍｓｐ.菌落纯白色１５６Ｐｌｅｃｔｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａｃｕｃｕｍｅｒｉｎａ菌落白色０４２.２㊀溴氰虫酰胺对小菜蛾肠道真菌群落的影响２.２.１㊀数据质控及ＯＴＵ聚类㊀ＩｌｌｕｍｉｎａＮｏｖａＳｅｑ测序得到原始数据经过拼接和质控处理之后ꎬ溴氰虫酰胺处理组２个样本共得到９３６１６条高质量序列ꎬ２５５９５４６７个碱基ꎬ序列平均长度分别为２６６㊁２８０ｂｐꎬ序列中ＧＣ含量分别为５０.４８％㊁５０.６８％ꎬ测序错误率小于０.０１(Ｑ２０)和０.００１(Ｑ３０)的碱基数分别占总碱基数的９２.３２％㊁８６.１３％和９１.７３％㊁８５.２３％ꎮ对照组中２个样本共得到１３１２０８条高质量序列ꎬ３５０７４５９５个碱基ꎬ序列平均长度分别为２７７㊁２５９ｂｐꎬ序列中ＧＣ含量分别为５１.７９％㊁５１.８１％ꎬ测序错误率小于０.０１(Ｑ２０)和０.００１(Ｑ３０)的碱基数分别占总碱基数的９３.５５％㊁８７.８７％和９５.１７％㊁９０.５１％(表２)ꎮ在９７％的相似度水平下对样品序列进行ＯＴＵ聚类ꎬ如表３所示ꎬ溴氰虫酰胺处理组中２个样本共鉴定得出真菌１０门ꎬ３３纲ꎬ８０目ꎬ１５９科ꎬ２７１属ꎬ３８０种ꎻ对照组中２个样本共鉴定得出真菌１０门ꎬ３５纲ꎬ８２目ꎬ１６３科ꎬ２７９属ꎬ３９７种ꎮ５７㊀第７期㊀㊀㊀㊀㊀㊀陈华璋ꎬ等:溴氰虫酰胺对小菜蛾幼虫肠道真菌群落的影响㊀㊀表２㊀样本测序数据统计及质控样品原始序列高质量序列序列碱基数(ｎｔ)序列平均长度(ｂｐ)Ｑ２０(％)Ｑ３０(％)ＧＣ含量(％)高质量序列百分比(％)ＳＣＫ１７７２０３６１４７４１７０４４４０４２７７９３.５５８７.８７５１.７９７９.５０ＳＣＫ２８９４２８６９７３４１８０３０１９１２５９９５.１７９０.５１５１.８１７７.０１ＳＪＹ１６２８２５４６２５５１２３２３３５８２６６９２.３２８６.１３５０.４８７３.０７ＳＪＹ２６１７９１４７３６１１３２７２１０９２８０９１.７３８５.２３５０.６８７６.４２㊀㊀表３㊀各样本真菌群落不同分类水平下数目样品门纲目科属种ＳＣＫ１９２９６５１３５２１４２９３ＳＣＫ２１０３３７１１３２２０１２６５总数１０３５８２１６３２７９３９７ＳＪＹ１１０２７６２１２３１９０２４３ＳＪＹ２８２４６０１１７１６５２１２总数１０３３８０１５９２７１３８０２.２.２㊀ＩＴＳ序列测序深度分析㊀稀释曲线(ｒａｒｅ￣ｆａｃｔｉｏｎｃｕｒｖｅ)是描述组内样本多样性的重要工具ꎬ可以直接反映测序数据量的合理性ꎬ并间接反映样本的物种丰富程度ꎮ本试验中两组共４个样品在测序数据为３３０００时曲线趋于平缓(图１)ꎬ说明此次测序数据深度已经足够ꎬ能够反映样品中大多数的真菌多样性信息ꎬ进一步测序对新ＯＴＵ的产生贡献不大ꎮ因此ꎬ本研究测序量能反映小菜蛾肠道真菌群落的组成情况ꎮ图１㊀ＯＴＵ水平稀释曲线２.２.３㊀小菜蛾肠道真菌群落组成㊀在门水平上溴氰虫酰胺处理组和对照组的优势菌门均为子囊菌门(Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ)ꎬ其次是担子菌门(Ｂａｓｉｄｉｏｍｙ￣ｃｏｔａ)ꎻ经溴氰虫酰胺处理后的小菜蛾肠道上担子菌门丰度显著低于未处理组ꎬ其他真菌种类无显著性差异(图２)ꎮ溴氰虫酰胺处理组和对照组中相对丰度前１０的菌门分别是子囊菌门(８０％/７７％)㊁担子菌门(４％/１８％)㊁毛霉门(Ｍｕｃｏｒｏｍｙ￣ｃｏｔａꎬ０.０４％/０.２７％)㊁被孢霉门(Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌｏｍｙｃｏ￣ｔａꎬ０.２５％/０.１７％)㊁罗兹菌门(Ｒｏｚｅｌｌｏｍｙｃｏｔａꎬ０.１０％/０.０６％)㊁油壶菌门(Ｏｌｐｉｄｉｏｍｙｃｏｔａꎬ０.０５％/０.０８％)㊁壶菌门(Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａꎬ０.０５％/０.０４％)㊁球囊菌门(Ｇｌｏｍｅｒｏｍｙｃｏｔａꎬ０.０３％/０.０２％)㊁捕虫霉门(Ｚｏｏｐａｇｏｍｙｃｏｔａꎬ<０.０１％)和Ａｐｈｅｌｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ(<０.０１％)ꎮ图２㊀小菜蛾肠道真菌门水平群落组成㊀㊀在属水平上ꎬ平脐蠕孢属(Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ)为绝对优势菌ꎬ其次为镰刀菌属(Ｆｕｓａｒｉｕｍ)和散尾鬼笔属(Ｌｙｓｕｒｕｓ)ꎮ溴氰虫酰胺处理组和对照组相对丰度前１０的真菌属中平脐蠕孢属(６６％/４１％)㊁镰刀菌属(３.９％/１８％)㊁散尾鬼笔属(２.９％/１６％)㊁枝孢属(Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍꎬ０.６％/３.５％)㊁赤霉菌属(Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａꎬ０.５％/２.３％)㊁链格孢属(Ａｌｔｅｒｎａｒ￣ｉａꎬ０.８％/１.７％)㊁曲霉属(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓꎬ０.３％/０.９％)和Ｐｓｅｕｄｏｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ(０.１％/０.９％)为二者共有菌属ꎻＡｒｃｈａｅｏｒｈｉｚｏｍｙｃｅｓ和伊萨酵母属(Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ)仅存在于溴氰虫酰胺处理组中ꎬ相对丰度分别为２.９％和０.５％ꎬ帚枝霉属(Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ)和毕赤酵母属(Ｐｉｃｈｉａ)仅存在于对照组中ꎬ相对丰度分别为１.１％和０.７％(图３)ꎮ２.２.４㊀小菜蛾肠道真菌群落Ａｌｐｈａ多样性㊀由表４可知ꎬ溴氰虫酰胺处理后小菜蛾肠道真菌群落的丰富度(Ｃｈａｏ１㊁ＡＣＥ指数)㊁测序深度指数(Ｏｂ￣ｓｅｒｖｅｄｓｐｅｃｉｅｓ)㊁系统发育多样性指数(ＰＤｗｈｏｌｅ６７㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀ｔｒｅｅ)均增加ꎬ除ＰＤｗｈｏｌｅｔｒｅｅ指数外ꎬ与对照组无显著性差异ꎬＳｉｍｐｓｏｎ指数和Ｇｏｏｄ ｓｃｏｖｅｒａｇｅ指数均有所下降ꎮ对照组中小菜蛾肠道真菌群落Ｓｈａｎｎｏｎ㊁Ｓｉｍｐｓｏｎ指数分别为３.９ʃ０.２㊁０.８２ʃ０.０４ꎬＣｈａｏ１㊁ＡＣＥ指数分为９８０ʃ８８㊁９９３ʃ４６ꎬＯｂｓｅｒｖｅｄｓｐｅｃｉｅｓ指数为８３０ʃ１３ꎬＰＤｗｈｏｌｅｔｒｅｅ指数为４７３ʃ１４ꎬＧｏｏｄ ｓｃｏｖｅｒａｇｅ指数为０.９９５ʃ０.００１ꎻ溴氰虫酰胺处理组中小菜蛾肠道真菌群落Ｓｈａｎｎｏｎ㊁Ｓｉｍｐｓｏｎ指数分别为３.９ʃ０.７㊁０.６７ʃ０.０９ꎬＣｈａｏ１㊁ＡＣＥ指数分别为１５０５ʃ５６１㊁１３２４ʃ２８７ꎬＯｂｓｅｒｖｅｄｓｐｅｃｉｅｓ指数为１０９６ʃ１２９ꎬＰＤｗｈｏｌｅｔｒｅｅ指数为７４５ʃ６４ꎬＧｏｏｄ ｓｃｏｖｅｒａｇｅ指数为０.９９３ʃ０.００３ꎮ图３㊀小菜蛾肠道属水平真菌群落组成㊀㊀表４㊀真菌群落Ａｌｐｈａ多样性指数样品测序深度指数Ｏｂｓｅｒｖｅｄｓｐｅｃｉｅｓ多样性指数ＳｈａｎｎｏｎＳｉｍｐｓｏｎ丰富度指数Ｃｈａｏ１ＡＣＥ覆盖度指数Ｇｏｏｄ ｓｃｏｖｅｒａｇｅ系统发育多样性指数ＰＤｗｈｏｌｅｔｒｅｅＳＣＫ１８３９３.７０.７８９１７９６００.９９６４８３ＳＣＫ２８２０４.１０.８５１０４２１０２５０.９９４４６３平均８３０ʃ１３ａ３.９ʃ０.２ａ０.８２ʃ０.０４ａ９８０ʃ８８ａ９９３ʃ４６ａ０.９９５ʃ０.００１ａ４７３ʃ１４ｂＳＪＹ１１１８７４.４０.７３１９０２１５２７０.９９１７９０ＳＪＹ２１００５３.４０.６０１１０８１１２１０.９９５７００平均１０９６ʃ１２９ａ３.９ʃ０.７ａ０.６７ʃ０.０９ａ１５０５ʃ５６１ａ１３２４ʃ２８７ａ０.９９３ʃ０.００３ａ７４５ʃ６４ａ㊀㊀注:同列不同小写字母表示处理和对照差异显著(Ｐ<０.０５)ꎮ２.２.５㊀小菜蛾肠道真菌群落Ｂｅｔａ多样性㊀ＰＣｏＡ主坐标分析表明ꎬ对照组２个样品与溴氰虫酰胺处理组２个样品距离较远ꎬ真菌群落组成差异较大ꎻ对照两样品间距离较小ꎬ真菌组成差异较小ꎬ而溴氰虫酰胺处理组的ＳＪＹ１和ＳＪＹ２样品之间距离较远ꎬ表明其真菌群落组成差异较大(图４)ꎮ图４㊀基于ＷｅｉｇｈｔｅｄＵｎｉｆｒａｃ距离ＰＣｏＡ分析２.２.６㊀小菜蛾肠道真菌ＦｕｎＧｕｉｌｄ功能预测㊀真菌ＦｕｎＧｕｉｌｄ功能预测(图５)表明:溴氰虫酰胺处理组和对照组小菜蛾肠道真菌群落的主要功能包括植物病原菌(ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｇｅｎꎬ６７％/４５％)㊁未指定的(Ｕｎａｓｓｉｇｎｅｄꎬ１７％/７％)㊁植物病原－土壤腐生微生物－木材腐生微生物(ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｇｅｎ－ＳｏｉｌＳａ￣ｐｒｏｔｒｏｐｈ－ＷｏｏｄＳａｐｒｏｔｒｏｐｈꎬ４％/１８％)㊁粪便腐生微生物－土壤腐生微生物(ＤｕｎｇＳａｐｒｏｔｒｏｐｈ－ＳｏｉｌＳａ￣ｐｒｏｔｒｏｐｈꎬ３％/１６％)㊁未定义的腐生微生物(Ｕｎｄｅ￣ｆｉｎｅｄＳａｐｒｏｔｒｏｐｈꎬ３％/５％)㊁内生植物病原(Ｅｎｄｏ￣ｐｈｙｔｅ－ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｇｅｎꎬ０.６％/３.６％)㊁动物病原－内生菌－植物病原－木材腐生菌(ＡｎｉｍａｌＰａｔｈｏｇｅｎ－Ｅｎｄｏｐｈｙｔｅ－ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｇｅｎ－ＷｏｏｄＳａｐｒｏｔｒｏｐｈꎬ０.８％/１.７％)ꎮ３㊀讨论与结论肠道中真菌群落相比细菌群落所占比例较小ꎬ但其对于肠道菌群稳态至关重要[２７]ꎮ本研究通过传统分离培养技术从未经溴氰虫酰胺处理的小菜蛾肠道中分离出了青霉属和盾壳霉属真菌ꎬ而从溴氰虫酰胺处理的小菜蛾肠道中还分离出了曲霉属真菌和黄瓜织球壳菌ꎮ江宇航等[２８]从云南松毛虫肠道中也分离出了曲霉菌属和青霉菌属ꎬ但其分离到的根霉菌㊁镰刀菌和念珠菌等本试验未获得ꎬ而高通量测序结果表明小菜蛾肠道中存在相关菌属ꎬ可能由于分离培养基和培养条件７７㊀第７期㊀㊀㊀㊀㊀㊀陈华璋ꎬ等:溴氰虫酰胺对小菜蛾幼虫肠道真菌群落的影响图５㊀ＦｕｎＧｕｉｌｄ功能注释相对丰度柱形图的差异未能分离出纯菌株ꎮ青霉菌作为常见的产纤维素酶菌株[２９]ꎬ可帮助宿主更好地消化植物组织ꎮ研究表明青霉属㊁曲霉属和镰刀菌属均可作为昆虫肠道共生真菌ꎬ为宿主的生长发育和繁殖提供营养物质[３０]ꎮ黄瓜织球壳菌可导致甘蓝[３１]㊁土豆[３２]㊁番茄[３３]等作物发生萎蔫ꎮ此次在小菜蛾肠道中检测到黄瓜织球壳菌可能是因为其作为病原菌附着在甘蓝叶上ꎬ最后因取食进入肠道ꎮ高通量测序结果表明ꎬ平脐蠕孢属㊁镰刀菌属㊁散尾鬼笔属㊁枝孢属㊁赤霉菌属㊁链格孢属㊁曲霉属和Ｐｓｅｕｄｏｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ为肠道中优势真菌属ꎮ其中平脐蠕孢属可引起玉米[３４]㊁水稻[３５]和狗尾草[３６]等禾本科植物的叶斑病ꎬ但尚未有其导致甘蓝感病的报道ꎻ镰刀菌属作为一种常见菌属ꎬ可以是有益菌㊁病原菌以及中性菌ꎻ散尾鬼笔属是可形成大型子实体的真菌ꎻ枝孢属㊁赤霉菌属和链格孢属中均包含大量植物病原菌ꎮ食物是肠道微生物的重要来源ꎬ因此小菜蛾肠道中包含了大量植物病原菌菌属ꎬ虽然多数并非甘蓝病原菌ꎬ但由于降雨和风力等自然因素也会导致其它植物的病原菌散播到甘蓝叶上ꎬ最终进入到小菜蛾肠道中ꎮ功能预测结果表明小菜蛾肠道中真菌群落主要为植物病原菌ꎬ其次为土壤木材腐生微生物以及植物内生菌ꎬ这也印证了小菜蛾肠道中的真菌多来自食物和土壤等ꎮ溴氰虫酰胺处理后小菜蛾肠道平脐蠕孢属的相对丰度显著增加ꎬ镰刀菌属㊁散尾鬼笔属相对丰度显著降低ꎮ物种群落方面ꎬ溴氰虫酰胺处理后小菜蛾肠道真菌群落丰富度指数㊁系统发育多样性指数等均有不同程度的上升ꎮＰＣｏＡ的结果也证明了这一点ꎬ经溴氰虫酰胺处理后不同小菜蛾肠道真菌群落样本距离较远ꎬ物种组成差异较大ꎮ这可能是由于溴氰虫酰胺作用使得小菜蛾的防御机能降低ꎬ环境中的大量微生物群落进入到了小菜蛾肠道中ꎬ相关假设将在后续试验进一步验证ꎮ本研究检测了溴氰虫酰胺处理后小菜蛾肠道真菌群落结构的变化ꎬ结果显示溴氰虫酰胺处理后小菜蛾肠道真菌群落数量和多样性均有不同程度的增加ꎮ研究结果为小菜蛾肠道微生物功能的研究提供了借鉴ꎬ同时也为溴氰虫酰胺与小菜蛾的互作研究提供了参考ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀ＳｈａｒｏｎＧꎬＳｅｇａｌＤꎬＲｉｎｇｏＪＭꎬｅｔａｌ.ＣｏｍｍｅｎｓａｌｂａｃｔｅｒｉａｐｌａｙａｒｏｌｅｉｎｍａｔｉｎｇｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｏｆＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ[Ｊ].Ｐｒｏ￣ｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａꎬ２０１０ꎬ１０７(４６):２００５１－２００５６. [２]㊀ＴｓｕｃｈｉｄａＴꎬＫｏｇａＲꎬＦｕｋａｔｓｕＴ.Ｈｏｓｔｐｌａｎｔｓｐｅｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎｇｏｖ￣ｅｒｎｅｄｂｙｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅｓｙｍｂｉｏｎｔ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２００４ꎬ３０３(５６６６):１９８９.[３]㊀ＢｅｈａｒＡꎬＹｕｖａｌＢꎬＪｕｒｋｅｖｉｔｃｈＥ.ＧｕｔｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｉｎｔｈｅＭｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎｆｒｕｉｔｆｌｙ(Ｃｅｒａｔｉｔｉｓｃａｐｉｔａｔａ)ａｎｄｔｈｅｉｒｉｍｐａｃｔｏｎｈｏｓｔｌｏｎｇｅｖｉｔｙ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｓｅｃｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２００８ꎬ５４(９):１３７７－１３８３.[４]㊀ＤｉｌｌｏｎＲＪꎬＶｅｎｎａｒｄＣＴꎬＢｕｃｋｌｉｎｇＡꎬｅｔａｌ.Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｌｏｃｕｓｔｇｕｔｂａｃｔｅｒｉａｐｒｏｔｅｃｔｓａｇａｉｎｓｔｐａｔｈｏｇｅｎｉｎｖａｓｉｏｎ[Ｊ].ＥｃｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓꎬ２００５ꎬ８(１２):１２９１－１２９８.[５]㊀ＴａｌｅｋａｒＮＳꎬＳｈｅｌｔｏｎＡＭ.Ｂｉｏｌｏｇｙꎬｅｃｏｌｏｇｙꎬａｎｄｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆｔｈｅｄｉａｍｏｎｄｂａｃｋｍｏｔｈ[Ｊ].ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＥｎｔｏｍｏｌｏｇｙꎬ１９９３ꎬ３８:２７５－３０１.[６]㊀ＬｉＷＨꎬＪｉｎＤＣꎬＳｈｉＣＨꎬｅｔａｌ.Ｍｉｄｇｕｔｂａｃｔｅｒｉａｉｎｄｅｌｔａ￣ｍｅｔｈｒｉｎ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔꎬｄｅｌｔａｍｅｔｈｒｉｎ￣ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅꎬａｎｄｆｉｅｌｄ￣ｃａｕｇｈｔｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｏｆＰｌｕｔｅｌｌａｘｙｌｏｓｔｅｌｌａꎬａｎｄｐｈｅｎｏｍｉｃｓｏｆｔｈｅｐｒｅ￣ｄｏｍｉｎａｎｔｍｉｄｇｕｔｂａｃｔｅｒｉｕｍＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｍｕｎｄｔｉｉ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１７ꎬ７:１９４７.８７㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀[７]㊀ＩｎｄｉｒａｇａｎｄｈｉＰꎬＡｎａｎｄｈａｍＲꎬＭａｄｈａｉｙａｎＭꎬｅｔａｌ.Ｃｕｌｔｉｖａｂｌｅｂａｃｔｅｒｉａａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｌａｒｖａｌｇｕｔｏｆｐｒｏｔｈｉｏｆｏｓ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔꎬｐｒｏ￣ｔｈｉｏｆｏｓ￣ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅａｎｄｆｉｅｌｄ￣ｃａｕｇｈｔｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｏｆｄｉａｍｏｎｄｂａｃｋｍｏｔｈꎬＰｌｕｔｅｌｌａｘｙｌｏｓｔｅｌｌａａｎｄｔｈｅｉｒｐｏｔｅｎｔｉａｌｆｏｒꎬａｎｔａｇｏｎｉｓｍｔｏ￣ｗａｒｄｓｅｎｔｏｍｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｆｕｎｇｉａｎｄｈｏｓｔｉｎｓｅｃｔｎｕｔｒｉｔｉｏｎ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２００７ꎬ１０３(６):２６６４－２６７５. [８]㊀夏晓峰ꎬ郑丹丹ꎬ林海兰ꎬ等.小菜蛾幼虫中肠细菌的分离鉴定[Ｊ].应用昆虫学报ꎬ２０１３ꎬ５０(３):７７０－７７６. [９]㊀ＲｉｂｅｉｒｏＬＭＳꎬＷａｎｄｅｒｌｅｙ￣ＴｅｉｘｅｉｒａＶꎬＦｅｒｒｅｉｒａＨＮꎬｅｔａｌ.Ｆｉｔｎｅｓｓｃｏｓｔｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｆｉｅｌｄ￣ｅｖｏｌｖｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｃｈｌｏｒａｎ￣ｔｒａｎｉｌｉｐｒｏｌｅｉｎＰｌｕｔｅｌｌａｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ(Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ:Ｐｌｕｔｅｌｌｉｄａｅ)[Ｊ].ＢｕｌｌｅｔｉｎｏｆＥｎｔｏｍｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０１４ꎬ１０４(１):８８－９６.[１０]ＳａｔｔｅｌｌｅＤＢꎬＣｏｒｄｏｖａＤꎬＣｈｅｅｋＴＲ.Ｉｎｓｅｃｔｒｙａｎｏｄｉｎｅｒｅｃｅｐ￣ｔｏｒｓ:ｍｏｌｅｃｕｌａｒｔａｒｇｅｔｓｆｏｒｎｏｖｅｌｐｅｓｔｃｏｎｔｒｏｌｃｈｅｍｉｃａｌｓ[Ｊ].Ｉｎ￣ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅꎬ２００８ꎬ８(３):１０７－１１９.[１１]金晶ꎬ罗宁ꎬ李金鸿ꎬ等.１３种农药对甘肃定西和武威地区小菜蛾的毒力及药效[Ｊ].西北农业学报ꎬ２０２１ꎬ３０(１０):１５７３－１５８０.[１２]ＫｒｙｕｋｏｖＶＹꎬＲｏｔｓｋａｙａＵꎬＹａｒｏｓｌａｖｔｓｅｖａＯꎬｅｔａｌ.ＦｕｎｇｕｓＭｅｔａｒｈｉｚｉｕｍｒｏｂｅｒｔｓｉｉａｎｄｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅａｆｆｅｃｔｇｕｔｉｍ￣ｍｕｎｉｔｙａｎｄｍｉｃｒｏｂｉｏｔａｉｎＣｏｌｏｒａｄｏｐｏｔａｔｏｂｅｅｔｌｅｓ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０２１ꎬ１１(１):１２９９.[１３]ＨｅｎｄｒｉｋｓｍａＨＰꎬＫüｔｉｎｇＭꎬＨäｒｔｅｌＳꎬｅｔａｌ.Ｅｆｆｅｃｔｏｆｓｔａｃｋｅｄｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌｃｒｙｐｒｏｔｅｉｎｓｆｒｏｍｍａｉｚｅｐｏｌｌｅｎｏｎｎｕｒｓｅｂｅｅｓ(Ａｐｉｓｍｅｌｌｉｆｅｒａｃａｒｎｉｃａ)ａｎｄｔｈｅｉｒｇｕｔｂａｃｔｅｒｉａ[Ｊ].ＰＬｏＳＯＮＥꎬ２０１３ꎬ８(３):ｅ５９５８９.[１４]ＫａｌｔｅｎｐｏｔｈＭꎬＥｎｇｌＴ.ＤｅｆｅｎｓｉｖｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｙｍｂｉｏｎｔｓｉｎＨｙｍｅ￣ｎｏｐｔｅｒａ[Ｊ].ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＥｃｏｌｏｇｙꎬ２０１４ꎬ２８(２):３１５－３２７. 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具ACC脱氨酶活性大豆根瘤内生菌的筛选、抗性及促生作用
ADF培养基：把ACC溶于超纯水，用细菌过 滤器过滤灭菌，加入到不含有(NH4)2SO4且预先灭 菌的DF盐培养基中，pH 7.2。ACC添加的终浓度 为3.0 mmol/L。
1.2 ACC 脱氨酶活性菌株的筛选
将冰箱中保藏的菌株活化后，参照文献[15–16]
ac16, 56(6)
关键词：ACC脱氨酶, 根瘤内生菌, 抗性, 系统发育, 促生作用
工业化肥大量施用和盐碱化面积不断扩增， 造成我国农田大面积土壤板结、环境污染以及投 资成本增大等系列问题，严重影响土壤微环境生 态平衡和农作物健康生长[1]。植物根际蕴藏丰富 的微生物资源，对这些资源进行开发和利用为解
决上述问题提供了新的思路。一些根际微生物代 谢产物如ACC脱氨酶，可增强宿主植物吸收养 分、提高抗逆性和促进植物生长，还兼有抗病原 微生物效应及联合修复功能，达到农业增产、生 物防治和环境治理效果[2]。因此，筛选和研究
1.3 ACC 脱氨酶活力测定
1.3.1 绘制α-丁酮酸标准曲线：利用0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.5)缓冲液，配制100 mmol/L的α-丁 酮酸母液。将该浓度的母液稀释为10 mmol/L的α丁酮酸溶液，将其加入试管中，用0.1 mol/L TrisHCl缓冲液(pH 8.5)补加至1 mL, α-丁酮酸浓度范围 为0.024–0.293 µmol/mL。以吸光度值(OD540)为纵 坐标，以α-丁酮酸的浓度(mmol/L)为横坐标绘制 标准曲线。 1.3.2 ACC脱氨酶比活力计算：参照Bradford 法[17]比色测定细胞提取液中总蛋白质含量，以牛 血清白蛋白作为标准物，绘制牛血清白蛋白标准 曲线。参考Saleh等[18]的方法，以反应体系中每毫 克菌体蛋白酶每小时催化ACC脱氨生成 α-丁酮酸
大豆主要病、虫、草害合防治技
大豆主要病、虫、草害综合防治技术孙运亮宋文茜大豆是我国的主要农作物，近年来随着农业产业结构不断调整，大豆种植面积越来越大，逐渐成为农民群众的增收渠道。
在大豆种植过程中，病虫草害对大豆的品质和产量有较大影响，本文对大豆的主要病虫草害的综合防治技术进行分析，旨在提高大豆种植面积。
随着我国开始实行“减玉米、增大豆”的新型农业种植结构，山东省米豆轮作制度补贴等政策也不断实施，本地的大豆种植面积越来越大，而且政府对大豆种植者的补贴越来越高，充分调动了农民种植大豆的积极性。
大豆种植面积不断扩大，虽然给农民带来了增收的渠道，但是大豆病虫草害现象也越来越严重，影响大豆的产量和质量，导致大豆种植收益降低。
为了更好地发展本地的大豆产业，必须要积极加强大豆病虫草害研究，对大豆病虫草害进行综合防治，以预防为主，从源头上减少大豆病虫害以及草害的威胁。
一、大豆病虫害的发生规律及综合防治技术1、大豆根腐病的发生与防治方法大豆根腐病是很常见的大豆病害之一，在大豆的整个生长过程中都可能产生危害。
苗前发病会导致种子腐烂，出苗之后发病会导致幼苗死亡，植株不能正常生长，最终枯死。
患病初期病株的叶子结节处会形成水渍状的软腐病斑，然后病变部位变成棕褐色。
随着大豆生长，其病变也会逐渐向上扩展，将患病部位剖开可以发现内部的髓组织已经变成褐色。
病株的叶子会枯黄、逐渐下垂，渐渐脱落，严重的会导致整个植株死亡。
如果在结荚期感染该病，会影响大豆结荚，形成空荚、瘪荚，豆荚的籽粒不饱满。
对于大豆根腐病而言，最主要的防治方法是从预防为主，首先要对大豆种子进行筛选，尽量选择抗病性强、优质无病害的种子；其次，要采取合理的轮作制度，长期连作会导致病害加重，所以在同一个地块上不能连续两年都种植大豆，一般采取四年以上的轮作制度，间作其他农作物，提高土壤抗病性。
第三，在播种之前要对种子进行处理，一般在播种之前5~7天，使用浓度比例为1∶1的50%福美双WP 和50%多菌灵WP 混剂，按照种子重量的0.5%拌种，也可以使用浓度为2.5%的咯菌腈FS 拌种，用量为种子重量的0.15%。
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BA008
北安市格球山农场
BQ025
齐齐哈尔市拜泉县丰产乡
BQI023
双鸭山市宝清县八五三农场二分场二队
BQI031
双鸭山市宝清县八五三农场二分场二队
DQ001
大庆市让胡路区
FJ025
富锦市长安镇大安村
1． 2 不同菌丝亲和组群菌株形态多样性的研究 将分离纯化的菌株转移到 PDA 培养基活化，用
直径 5 mm 打孔器，沿 PDA 培养基最外圈打孔，菌碟 转接在 PDA 平板正中间，25℃ 恒温培养，每个菌株 3 次重复。 1． 2． 1 菌株生长速率 菌株置于 PDA 平板 25℃ 恒 温培养，每 24 h 观察菌丝生长情况，测量菌落直径， 直到菌丝长满培养皿。 1． 2． 2 菌株菌落特性 25℃ 培养 PDA 平板，待菌 株长满培养皿，记录菌落形态。 1． 2． 3 菌核形成位置 菌株 PDA 平板 25℃ 培养 10 d，记录不同菌株产菌核情况和分布位置。 1． 2． 4 不同菌株产生菌核的数量、大小和重量 PDA 平板 25℃ 培养 10 d，记录每皿产菌核数，计算 单菌株产菌核量的平均值。收集每个样品的所有 菌核测总湿 重，阴 凉 处 干 燥 后 称 总 干 重，根 据 不 同 菌株菌核的个数计算菌核的粒重。在同一菌株的 3 组重复中，每皿随机测量 15 个菌核的直径，计算每 种菌核的平均直径。 1． 2． 5 数据分析 采用 DPS v7． 05 处理不同菌丝 亲和群菌株形成菌核的各项数据。 1． 3 SSＲ 分析 1． 3． 1 菌株 DNA 的提取 参照李佳等［9］提出的 SDS 法提取供试菌株 DNA。 1． 3． 2 多态性分析 选取国际通用真菌 SSＲ 引物 6 对，参照王玉杰［10］SSＲ 分析方法，分析 12 个供试 菌株的 DNA。PCＲ 反 应 体 系 （ 25． 0 μL） ：2． 0 μL 20 × 稀 释 后 扩 增 产 物，每 条 引 物 （ 10 μmol·L － 1 ）
5期
李易初等：大豆菌核病菌不同菌丝亲和群的遗传差异性研究
719
1 材料与方法
的菌株 进 行 MCG 试 验，根 据 亲 和 结 果 分 为 34 个 MCGs，从中选取具有代表性的 12 个 MCGs 进行试
1． 1 试验材料 1． 1． 1 供试材料 2011 年从黑龙江各地采集大豆 菌核病样本，共分离纯化出 67 个菌株，根据采集地 点编号，4℃ 保存于 PDA 平板培养基上备用。纯化
态 性 （ restriction fragment length polymorphism， ＲFLP） 、随机扩增 DNA 片段多态性（ random amplified polymorphic DNA，ＲAPD） 等分析手段［8］。
本研究采用菌丝亲和组群法将采集的菌株分 群，挑选具 有 代 表 性 的 单 独 成 群 菌 株 作 为 试 验 材 料，经实验 室 常 规 方 法 培 养，分 析 不 同 菌 丝 亲 和 群 菌株间菌落形态、菌落生长速度以及菌核形成过程 中所表现的形态学特性，并用 SSＲ 分子标记技术分 析不同菌丝亲和群菌株的遗传多样性，旨在明确不 同菌丝亲和群菌株形态学差异性和多元性，验证不 同菌丝亲和群菌株的遗传多样性，证实黑龙江地区 核盘菌遗传类型复杂性。
关键词：大豆菌核病；菌丝亲和组群；形态学；遗传差异
中图分类号：S565． 1
文献标识码：A
DOI：10． 11861 / j． issn． 1000-9841． 2014． 05． 0718
Genetic Diversity of Sclerotinia Sclerotiorum in Soybean in Different Mycelia Compatibility Groups
菌核重量和大小等差异性显著，直径变化范围 0． 13 ～ 0． 53 cm，菌核粒重变幅 0． 007 ～ 0． 340 g；SSＲ 分子标记技术与
MCG 方法分析核盘菌遗传差异性结果一致，且相似系数越高，一致性越高。可见，黑龙江地区大豆菌核病菌丝亲和群
数量多，菌株之间存在多元性和差异性，核盘菌种群内存在较大的异质性，遗传类型复杂。
Abstract： To identify genetic diversity of isolates of Sclerotinia sclerotiorum from different mycelia compatibility groups，12 alone representative straelected by the Mycelia compatibility groups（ MCG） screening methods． The strains were cultivated by PDA medium，and the colony characteristics，growth rate of mycelium and morphological features of sclerotia were compared． Genetic polymorphism was studied by SSＲ molecular marker． The results showed that the differences were significant in colony characteristics，mycelium growth rate，Sclerotia location on medium，the total number of Sclerotia and Sclerotia weight among the strains from different MCGs． The colony shape，colony color and hyphal fullness degree of strains were divided into two categories． Sclerotium diameter changed from 0． 13 to 0． 53 cm，Sclerotium grain weight ranged from 0． 007 to 0． 340 g． The average growth rate of strain was 2． 206 cm·d －1 ，the capability sclerotial formation was not affected by mycelium growth rate． The result of SSＲ molecular marker technology was similar with MCG’s，and the higher of the similarity coefficient，the higher consistence． Therefore，there are scores of mycelia compatibility groups of S． sclerotiorum in soybean in Heilongjiang province，the strains of S． sclerotiorum had polyphyly and diversity． It indicated the presence of heterogeneity and heredity types diversity of S． Sclerotiorum infecting soybean in Heilongjiang province． Key words： Soybean Sclerotinia sclerotiorum；Mycelia compatibility group；Morphology；Genetic diversity
第 33 卷 第 5 期 2014 年 10 月
大豆科学 SOYBEAN SCIENCE
Vol． 33 No． 5 Oct． 2014
大豆菌核病菌不同菌丝亲和群的遗传差异性研究
李易初1，2 ，张俊华1
（1． 东北农业大学 农学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2． 黑龙江省农业科学院 植物保护研究所，黑龙江 哈尔滨 150086）
验。这 12 个 MCGs 是由来自黑龙江省 10 个市、11 个县，在 MCG 试 验 中 独 立 成 群 的 12 个 菌 株 构 成 （表 1）。 1． 1． 2 培养基 PDA 培养基，按照常规方法配制。
表 1 供试菌株
Table 1 Tested isolates
菌种 Strains
采集地点 Acquisition places
大 豆 菌 核 病 是 核 盘 菌［Sclerotinia sclerotiorum （ Lib） ． de Bary］侵染大豆引起的一种真菌病害［1-2］， 我国大豆主产区均有发生，尤以黑龙江和内蒙古北 部地区危害较重，流行年份一般减产 20% ～ 30% ，严 重发病 地 块 减 产 可 达 50% 以 上［3-5］。由 于 近 年 大 豆、油菜和 向 日 葵 的 大 面 积 种 植，菌 核 病 的 发 生 及 为害呈加重趋势［6-7］。
LI Yi-chu1，2 ，ZHANG Jun-hua1
（1． Agronomy College，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2． Plant Protection Institute，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150086，China）
菌种 Strains
采集地点 Acquisition places
HG002
鹤岗市蔬园乡
HH017
黑河市逊克农场
ML003
穆棱市河西镇
MS003
绥化市明水县宏伟村
QA001
绥化市庆安县东郊
SL008
海伦市于绥棱县交界
0． 6 μL，2． 0 μL dNTP（2． 5 mmol·L － 1 ） ，2． 0 μL 10 × PCＲ 缓冲液，3． 0 μL Mg2 + （25 mmol·L － 1 ） ，0． 3 μL Taq 酶 （5 U·μL － 1 ） ，14． 5 μL 重蒸水。扩增程序： 94℃ 5 min，94℃ 1 min，35℃ 1 min，72℃ 1 min，5 个 循环；94℃ 1 min，52℃ 1 min，72℃ 1 min，35 个循 环；最后 72℃ 延伸 10 min。每次 PCＲ 反应均设不含 DNA 模板的空白对照，反应结束后 4℃ 保存 PCＲ 产 物。扩增 产 物 加 等 量 上 样 缓 冲 液 94℃ 变 性 处 理 5 min，用 4% 的变性聚丙烯酰胺 80 W 恒功率电泳 1． 5 h，再 进 行 银 染 显 色。 银 染 程 序 参 考 Sebastian［11］的方法。 1． 3． 3 数据分析 统计每对引物扩增总带数（根 据带的有无，有带记为“1”，无带记为“0”） ，数据转 化为一个二元 1 /0 数据矩阵。利用 NTSYS version 2． 10t 计算 Dice 遗 传 相 似 性 系 数，用 UPGMA （ unweighted pair grouping method with arithmetic mean） 法进行聚类分析，得到反映菌株亲缘关系的遗传相 似性树状图［12］。