鱼类细胞原代培养及其Giemsa形态、MTT增殖分析、细胞计数
鱼类细胞培养技术研究进展
Ａ Ｂ Ｓ Ｔ Ｒ Ａ Ｃ Ｔ Ｆ ｉ ｓ ｈ ｃ ｅ ｌ ｌ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｉ ｕ ｅ ｓ ａ ｒ ｅ ｉ ｍ ｏ ｒ ｔ ａ ｎ ｔ ａ ｎ ｄ ｔ ｏ ｏ ｌ ｓ ｆ ｏ ｒ ｂ ｉ ｏ ｌ ｏ ｓ ｔ ｕ ｄ ｒ ｏ ｍ ｉ ｓ ｉ ｎ － ｑ ｐ ｇ ｙ ｐ ｇ ， ｉ ｅ ｓ ．Ｗ ｉ ｔ ｈ ｔ ｈ ｅ ｄ ｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｍ ｅ ｎ ｔ ｏ ｆ ｂ ｉ ｏ ｌ ｏ ｉ ｃ ａ ｌ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ａ ｎ ｉ ｎ ｃ ｒ ｅ ａ ｓ ｉ ｎ ｎ ｕ ｍ ｂ ｅ ｒ ｏ ｆ ｆ ｉ ｓ ｈ ｃ ｅ ｌ ｌ ｌ ｉ ｎ ｅ ｓ ｈ ａ ｖ ｅ ｐ ｇ ｇ ｙ ｇ ， ｅ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈ ｅ ｄ ． Ａ ｌ ｔ ｈ ｏ ｕ ｈ ｔ ｈ ｅ ｆ ｏ ｒ ｄ ｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｉ ｎ ｆ ｉ ｓ ｈ ｃ ｅ ｌ ｌ ｌ ｉ ｎ ｅ ｓ ｖ ａ ｒ ｉ ｅ ｄ ｗ ｉ ｔ ｈ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｏ ｕ ｒ ｃ ｅ ｓ ｂ ｅ ｅ ｎ ｒ ｏ ｃ ｅ ｄ ｕ ｒ ｅ ｓ ｇ ｐ ｇ ｐ ， ， ｂ ａ ｓ ｉ ｃ ｒ ｉ ｎ ｃ ｉ ｌ ｅ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅ ｓ ｉ ｍ ｉ ｌ ａ ｒ ． Ｉ ｎ ｔ ｈ ｉ ｓ ａ ｅ ｒ ｔ ｈ ｅ ｓ ｔ ａ ｔ ｕ ｓ ｏ ｆ ｆ ｉ ｓ ｈ ｃ ｅ ｌ ｌ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｄ ｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｍ ｅ ｎ ｔ ａ ｌ ｉ ｃ ａ － ｐ ｐ ｐ ｐ ｐ ｐ ｐ ， ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ｓ ａ ｓ ｗ ｅ ｌ ｌ ａ ｓ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｉ ｕ ｅ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅ ｒ ｅ ｖ ｉ ｅ ｗ ｅ ｄ ｗ ｉ ｔ ｈ ｅ ｍ ｈ ａ ｓ ｉ ｓ ｏ ｎ ｔ ｈ ｅ ｅ ｒ － ｑ ｐ ｐ ｓ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ｓ ｆ ｏ ｒ ｆ ｉ ｓ ｈ ｃ ｅ ｌ ｌ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｄ ｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｍ ｅ ｎ ｔ ． ｐ ｐ Ｋ Ｅ Ｙ ＷＯ Ｒ Ｄ Ｓ ｉ ｓ ｈ Ｃ ｅ ｌ ｌ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｒ ｉ ｍ ａ ｒ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｉ ｕ ｅ ｓ Ｆ Ｐ Ｃ ｙ ｑ
细胞增殖检测方法
细胞增殖检测方法
细胞增殖是细胞数量的增加和分裂的过程，对于检测细胞增殖的方法有很多种。
以下是一些常见的细胞增殖检测方法：
1. 细胞计数：通过显微镜观察和手工计数细胞数量，或使用自动化细胞计数仪进行细胞计数。
2. 细胞增殖染料：使用细胞增殖染料，如溴化乙锭（BrdU）或五溴乙酰胺（EdU），将其添加到培养基中，然后检测细胞摄取或转化这些染料的程度，以评估细胞增殖。
3. MTT试验：MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基-2H-四唑酮）试验通过测量细胞的代谢活力来评估细胞增殖。
MTT试剂会被活细胞还原为紫色的甲基噻唑咪唑离子，可以使用分光光度计测量产生的紫色产物的吸光度来确定细胞的增殖能力。
4. 细胞周期分析：通过流式细胞术检测细胞的DNA含量，可以确定细胞处于哪个细胞周期阶段，并评估细胞的增殖能力。
5. 细胞增殖标记：通过使用荧光标记物或融合蛋白来标记增殖细胞。
例如，使用荧光标记的抗体来检测细胞核内的增殖相关标记物，如Ki-67。
6. 实时细胞分析：使用实时细胞分析系统，如X-Celligence系统，可以通过记录电极传感器阻抗的变化来监测细胞的生长和扩张情况，从而评估细胞增殖。
这些方法可以单独或结合使用，以获得更全面和准确的细胞增殖信息。
鱼类原始生殖细胞的研究进展
鱼类原始生殖细胞的研究进展
宋卉;王树迎
【期刊名称】《动物医学进展》
【年(卷),期】2004(25)5
【摘要】鱼类原始生殖细胞参与生殖腺的形成,可影响性别的分化.通过对原始生殖细胞的研究可以人为地控制鱼类的性别,在畜牧业生产中有重要的实践意义.本文综述了几十年来国内外学者对鱼类原始生殖细胞的特征、起源、迁移和分化等方面的研究,旨在为鱼类生产和研究提供参考.
【总页数】2页(P22-23)
【作者】宋卉;王树迎
【作者单位】山东农业大学动物科技学院,山东,泰安,271018;山东农业大学动物科技学院,山东,泰安,271018
【正文语种】中文
【中图分类】S858.39
【相关文献】
1.鱼类原始生殖细胞与鱼类性别分化的关系 [J], 詹冰津;池丽影;张军玲;张会会
2.原始生殖细胞增殖调控的研究进展 [J], 林胜男;张育辉
3.鱼类原始生殖细胞的研究进展 [J], 宋卉;王树迎
4.禽类原始生殖细胞的研究进展 [J], 丁海雷;刘莉;丁志丽;张易祥;王杏龙;采克俊
5.鱼类原始生殖细胞标记基因研究进展 [J], 程琳;黄天晴;刘晨斌;谷伟;徐革锋;史秀兰;姚作春;王丽薇;王炳谦
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
细胞增殖 检测方法
细胞增殖检测方法细胞增殖是指细胞在生物体内不断分裂和繁殖的过程，是生物体生长和发育的基础。
检测细胞增殖的方法有很多种，以下将详细介绍几种常见的细胞增殖检测方法。
首先，细胞计数法是最常用的细胞增殖检测方法之一。
细胞计数法主要通过显微镜观察和数数的方式，计算细胞的数量来反映细胞增殖的情况。
可以通过细胞染色或细胞标记技术使细胞在显微镜下更易于观察和区分。
细胞计数法通常需要使用专业的细胞计数仪或显微相机来帮助实施，具有操作简单、结果准确等特点。
其次，MTT法是一种在体外细胞培养中常用的细胞增殖检测方法。
MTT法基于细胞中还原剂细胞线粒体呼吸将黄色硫代唑盐（MTT）还原为紫色的可溶性产物，最后通过比色法测定细胞数目和细胞活力。
MTT法操作简单、结果稳定可靠，广泛应用于药物筛选和细胞增殖研究中。
另外，细胞增殖标记法是通过标记DNA合成阶段的细胞来检测细胞增殖的方法。
常见的细胞增殖标记法有Brdu法和EDU法。
这两种方法都是通过标记新合成的DNA分子来反映细胞增殖情况，Brdu法利用抗体检测Brdu标记的DNA，而EDU法则利用稳定的EDU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）分子和荧光染料的结合来检测标记的DNA。
由于这两种方法都需要使用荧光染料或抗体检测，因此需要显微镜或流式细胞仪等设备来进行检测。
此外，细胞增殖检测还可以通过测定细胞凋亡（细胞死亡）来间接反映细胞增殖情况。
细胞凋亡是细胞自身程序性死亡的一种形式，常使用TUNEL（DNA末端标记术）法或Annexin V/PI双染法来检测细胞凋亡。
这些方法通过标记DNA 断裂或细胞膜破损来区分凋亡细胞和正常细胞，并通过荧光染料或抗体检测来反映细胞凋亡的程度。
细胞凋亡的明显增加往往意味着细胞增殖的受抑制。
总的来说，细胞增殖检测方法的选择应根据具体实验的目的、条件和资源来决定。
不同的方法各有优势和局限性，需要结合实际情况进行选择。
在细胞增殖检测中，细胞计数法是最常用的方法，MTT法和细胞增殖标记法是常见的体外检测方法，而通过检测细胞凋亡来间接反映细胞增殖情况也是一种有效的方法。
课程论文_草鱼中肠粘膜上皮原代细胞的制备与培养
草鱼中肠粘膜上皮原代细胞的制备与培养程辉辉摘要：鱼类细胞培养技术是一项重要且潜力巨大的生物学研究技术手段和方法。
随着生物技术的发展，越来越多的鱼类细胞系（株）被建立。
本试验以草鱼中肠肠道粘膜为试验材料，采用不同消化法和离心转速梯度分离肠道粘膜细胞团，分别试验不同培养液与不同CO2浓度组合、胎牛血清浓度及细胞接种浓度时细胞生长效果，并且观察草鱼原代肠道粘膜细胞生长过程，同时采用3种细胞形态观察法、MTT检测法及相关酶活力系统评价细胞培养效果，以期尝试建立一个规范的、可批量复制的草鱼原代肠道粘膜上皮细胞的操作方法。
关键词：草鱼、中肠、粘膜上皮细胞、原代培养细胞培养作为细胞生物学乃至生物学研究的重要技术,在生物领域中占有重要地位。
动物组织(细胞) 培养开始于20世纪初,发展至今已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法。
肠道粘膜上皮细胞（intestinal epithelial cells，IECs）是肠道的主要功能细胞，其参与肠道食物的消化、吸收、免疫屏障等功能，且与肠道内、外分泌功能关系十分密切。
目前，由于饲料物质、药物、病原生物等对肠道粘膜结构与功能影响的研究日益受到重视，所以建立离体的肠道粘膜上皮细胞试验平台在营养学、生理学、病理学等研究中具有重要的意义。
1.材料与方法1.1 材料实验鱼：草鱼体重量为（22.0±5.0）g，来源于湖北省洪湖市红仙喜水产养殖专业合作社池塘养殖区，暂养于华中农业大学水产学院教学实习基地循环水养殖试验系统养殖缸内，在整个试验过程中使用草鱼配合颗粒饲料（粗蛋白含量35.0%、粗脂肪含量3.0%）饲养，每天投喂2次。
水温为（24±1.0）℃、溶解氧＞6mg/L。
材料：原代培养瓶，无菌培养皿，移液管（5 mL），无菌离心管（15 ml），解剖探针，手术剪，眼科剪，眼科镊，手术刀，医用酒精，烧杯（250 mL），废液缸，普镊，酒精灯，打火机，消毒纱布，酒精喷壶，记号笔，橡胶手套，封口膜。
鱼类细胞原代培养及其Giemsa形态、MTT增殖分析、细胞计数
血细胞原代培养及其形态、增殖分析1材料1.1试剂、药品培养基配制：血清使用时临时添加，培养基为DMEM培养基添加双抗。
双抗(青霉素、链霉素)终浓度均为100μg/ml。
血清为临时添加，终浓度为20%。
巯基乙醇：根据换算0.1mM的1L溶液须0.7ul巯基乙醇。
换言之，以巯基乙醇与双蒸水按70ul：930ul比例配置为母液，每100ml培养基仅需1ul双抗：先各取0.5g溶于50ml无菌双蒸水中，此时其浓度为0.1mg/ml= 10,000μg/ml,分装入250ulEP管中，此部切记EP管架。
使用时每1ml加10μL即100μg/mL。
剩余-4°冻存。
鉴于各组分均为使用时添加，故不进行单独过滤除菌。
培养基分装于250mL试剂瓶，血清分装于50mL试剂瓶。
PBS：NaCl:8g；KCl:2g; Na2HPO4·7H2O:1.15g（如果是12水合则为1.44g）; KH2PO4:0.2g 加水定容至1L，高压灭菌。
操作中使用一次性10ml滴定管，移液器1mL，100μL。
胰酶：以PBS添加0.25%胰酶配制。
过滤除菌，此步须注射一次性过滤器0.2微米。
肝素钠：取肝素钠100mg溶于10mL生理盐水中（0.9%NaCl），以10ml离心管盛装，过滤除菌。
麻醉剂：5ml丁香酚与5ml无水乙醇混溶，冻存液：无色甘油或DMSO加入含20%FBS培养基中，终浓度为10%MTT：取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS），用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可Wright-Giemsa：取两样各0.5g，甲醇500ml，配成染液台盼蓝染色液：4%台盼蓝母液，取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml滤纸过滤，4°保存。
使用时用PBS稀释至0.4%。
1.2器材离心机1、15、50ml离心管1.5、15、50ml脱脂棉、纱布、锡箔纸血细胞计数板、细胞计数器培养容器：96孔、24孔板，一次性细胞培养瓶、一次性培养皿30、60mm、载玻片、盖玻片倒置显微镜（可拍照）细胞培养箱酒精喷壶5ml、15ml一次性注射器1000、500、250ml、100、50ml试剂瓶一次性针头过滤灭菌器0.22um2方法2.1细胞培养：此步需要1ml、100ul移液枪，无菌蓝枪头1ml，无菌黄枪头100ul，2ml灭菌EP管，EP管架，5ml注射器，封口膜，无菌纱布，酒精棉球，酒精灯，打火机，酒精喷壶，一次性培养瓶，塑料餐盒。
鱼类细胞培养研究进展及应用展望
鱼类细胞培养研究进展及应用展望摘要：鱼类细胞培养技术是一种重要且有潜力的生物学研究技术手段和方法,随着生物技术的发展,越来越多的鱼类细胞系被建立,鱼类细胞培养的具体方法因细胞种类而异,但是总体上有共同之处。
作者针对鱼类细胞培养的发展现状、应用与特点、方法技术进行综述，并为鱼类细胞培养的发展前景作出展望。
关键词：鱼类细胞培养原代培养培养技术鱼类细胞培养作为一种重要的研究手段, 广泛应用于病毒学、环境毒理学、细胞生物学、肿瘤学、基因组学、遗传学以及资源保护等方面的研究。
鱼类细胞作为实验对象, 有着活体鱼无法比拟的优点:(1) 成本低, 细胞系的维护不需要大型的养殖设备和大量的换水与充气; (2)重复性好, 实验条件可以精确控制。
因此, 对鱼类细胞系进行深入研究, 无论在理论研究方面, 还是在实际应用方面, 都具有深远意义。
作者对鱼类细胞培养方法与技术、鱼类细胞培养研究进展、鱼类细胞系应用和前景展望进行全面系统的综述。
1、鱼类细胞培养方法鱼类细胞的培养方法包括原代培养和传代培养。
鱼类细胞原代培养的方法包括组织块培养法、机械分离法、络合剂分散法、消化分散法、悬浮细胞培养法、微载体细胞培养法等等。
以上几种方法常常可以配合使用, 如机械分散法可以同时和酶消化法、络合剂分散法使用, 既使用机械分离又使用化学分离, 摸索一个既能有效地分离细胞又对细胞损伤最小的契合点。
络合剂可以络合对消化酶有抑制作用的金属离子, 从而更好发挥酶的作用。
悬浮培养主要用于培养如淋巴细胞、部分肿瘤细胞, 同时需要辅以摇床振荡或者搅拌, 以保持细胞均匀的分散在培养基中。
微载体培养法需要借助微载体来提高细胞产量, 该技术需要生物反应设备, 适合自动化规模化生产[1]。
鱼类细胞培养具有得天独厚的条件: 鱼类细胞培养对传代培养时间、培养温度范围、培养基的选择范围等条件都较哺乳类灵活, 取材更加广泛: 如胚胎组织和幼鱼的各种组织分化程度低, 分裂潜能大, 是原代培养的主要组织来源, 更有优势的是成体鱼的性腺、头肾、后肾、心脏、鳃、鳔、脾脏、鳍条、眼、尾干等组织以及成鱼的肿瘤组织也是常用材料, 并且并不会因为鱼类成年而降低细胞的分裂能力, 鱼类细胞平均传代 100 代仍可以继续分裂, 比起哺乳类, 鱼类的有丝分裂极限要大得多, 并且鱼类细胞系每一代细胞的存活期均较长;人和哺乳动物离体培养的正常二倍体细胞株寿命均有限, 一般不超过 50 代。
草鱼前体脂肪细胞原代`传代培养及鉴定
’
重庆师范大学学报 （ 自然科学版） 1 .JJK： 4 4 LLL0 5M:FN0 5:1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 第 ’% 卷
剪至 ! ""# ， 弯头吸管以 !$ 块左右接种于 %$ "& 培养 瓶中， 置 ’( ) 、 $* +,’ 培养箱内培养， - . 后加入 $ "&培养液。’ / 后观察细胞从组织块中迁出与生长 情况并显微照相， 第 # / 更换新鲜培养液。此后每’ / 换液一次， 并在倒置显微镜下进行观察、 照相。 !0 ’0 ’ 传代培养 1 单层培养细胞达瓶底的 %2* 3 (2* 且汇合时对细胞进行传代培养。吸出旧培养 液， 沿培养瓶细胞面对侧按 20 ’ "& 4 5"’ 加入 678 清洗细胞。去除清洗液， 加消化液到培养瓶细胞面 对侧， 翻转培养瓶， 在倒置显微镜下观察到胞质回 缩、 细胞间隙增大时终止消化， 消化时间约 $ "9:。 倾斜培养瓶， 吸出消化液， 加入培养液轻轻转动培养 瓶把残留消化液冲掉， 再加入 ’ "& 培养液， 弯头吸 管轻柔吹打成细胞悬液， 计数， 接种到新的培养瓶 中， 放入 +,’ 培养箱培养。- . 后观察细胞贴壁情 并在倒置显微镜下进行观 况， 此后每 ’ / 换液 ! 次， 察、 照相。 !0 ’0 # 油红 , 染色鉴定1 细胞生长至第 ( /， 678 洗 # 次， !2* 甲醛的等渗盐缓冲液固定 #2 "9: 后， 678 漂洗 ’ 次， 吸取油红 , 工作液 $ "&， 油红 , 染色 ( "9:， ;2* 异丙醇分色 ’2 <， 蒸馏水冲洗， 在倒置显 微镜下观察、 照相。
! ! 前体脂肪细胞是一类具有增殖和向脂肪细胞分 化能力的特异化细胞， 它持续存在和作用于人类和动
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
血细胞原代培养及其形态、增殖分析1材料1.1试剂、药品培养基配制：血清使用时临时添加，培养基为DMEM培养基添加双抗。
双抗(青霉素、链霉素)终浓度均为100μg/ml。
血清为临时添加，终浓度为20%。
巯基乙醇：根据换算0.1mM的1L溶液须0.7ul巯基乙醇。
换言之，以巯基乙醇与双蒸水按70ul：930ul比例配置为母液，每100ml培养基仅需1ul双抗：先各取0.5g溶于50ml无菌双蒸水中，此时其浓度为0.1mg/ml= 10,000μg/ml,分装入250ulEP管中，此部切记EP管架。
使用时每1ml加10μL即100μg/mL。
剩余-4°冻存。
鉴于各组分均为使用时添加，故不进行单独过滤除菌。
培养基分装于250mL试剂瓶，血清分装于50mL试剂瓶。
PBS：NaCl:8g；KCl:2g; Na2HPO4·7H2O:1.15g（如果是12水合则为1.44g）; KH2PO4:0.2g 加水定容至1L，高压灭菌。
操作中使用一次性10ml滴定管，移液器1mL，100μL。
胰酶：以PBS添加0.25%胰酶配制。
过滤除菌，此步须注射一次性过滤器0.2微米。
肝素钠：取肝素钠100mg溶于10mL生理盐水中（0.9%NaCl），以10ml离心管盛装，过滤除菌。
麻醉剂：5ml丁香酚与5ml无水乙醇混溶，冻存液：无色甘油或DMSO加入含20%FBS培养基中，终浓度为10%MTT：取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS），用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可Wright-Giemsa：取两样各0.5g，甲醇500ml，配成染液台盼蓝染色液：4%台盼蓝母液，取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml滤纸过滤，4°保存。
使用时用PBS稀释至0.4%。
1.2器材离心机1、15、50ml离心管1.5、15、50ml脱脂棉、纱布、锡箔纸血细胞计数板、细胞计数器培养容器：96孔、24孔板，一次性细胞培养瓶、一次性培养皿30、60mm、载玻片、盖玻片倒置显微镜（可拍照）细胞培养箱酒精喷壶5ml、15ml一次性注射器1000、500、250ml、100、50ml试剂瓶一次性针头过滤灭菌器0.22um2方法2.1细胞培养：此步需要1ml、100ul移液枪，无菌蓝枪头1ml，无菌黄枪头100ul，2ml灭菌EP管，EP管架，5ml注射器，封口膜，无菌纱布，酒精棉球，酒精灯，打火机，酒精喷壶，一次性培养瓶，塑料餐盒。
试剂为肝素钠抗凝剂、DMEM培养基、血清、双抗（自配10,000ug/ml）、0.01%高锰酸钾、丁香酚（丁香酚：无水乙醇=1：1）2.1.1麻醉取血鱼体用0. 01%高锰酸钾溶液浸泡消毒0. 5 h，滴入适量麻醉剂使其麻醉，取出喷75%酒精以无菌纱布擦拭体表，移至超净台内，以5mL注射器吸取0.1mL肝素钠抗凝剂，而后垂直由腹端插入臀鳍腋下直至血管进行取血。
每尾取血2ml左右，装于无菌2ml EP管中。
加入20ul甘油或DMSO，血液冻存于-4°冰箱。
2.1.2 细胞培养采用0.01mM 2-巯基乙醇作为培养基添加因子，另外加入20%FBS。
染色须用30mm培养皿+入盖玻片，每个1.5ml培养基+60ul血液，共设置4组，每组3个进行Wright- Giemsa染色，观察细胞形态进行细胞分类的鉴定。
剩余2组进行台盼蓝染色，测定细胞存活率。
（此步盖玻片须用强酸泡洗）MTT采用2个96孔板，每孔100ul，细胞浓度理论上为104-105/ml.设置：置0组，对照组，LPS组，ConA组，PHA组终浓度均为0.3mg/ml。
另外采用培养瓶培养每组3个共12个，以备实验用。
0.4ml血液+10ml培养基。
每瓶加入3ml培养基，随后加入35ul双抗，0.75ml血清。
培养瓶装入餐盒后置于烘箱内室温培养。
0.3mg/ml的PHA和0.3mg/ml的ConA做刺激源，0.1mM 的2-巯基乙醇接种时另取一EP管，加入2ml PBS，80ul血液，细胞计数。
2.1.3细胞检测：染色检测（Wright与Giemsa染色）可检测细胞类型；MTT检测、细胞计数检测可检测细胞增殖2.1.3.1Wright- Giemsa混合染色取两样各0.5g，甲醇500ml，配成混合染液，将盖玻片浸入95%酒精固定15min，PBS洗两次，每次1min，盖玻片浸入含染液的培养皿中，静置1min，取出浸入染色液与ddH2O按1:2体积的培养皿中，静置15min，自来水冲洗经70%、80%、90%酒精各一次，95%2次，100%3次，每次1min二甲苯透明3次，每次1min，低价中性树胶，封片2.1.3.2 MTT检测1: 收集血细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度1000-10000 孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
2: 5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间。
在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况3: 5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
4: 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。
若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5: 终止培养，小心吸去孔内培养液。
6: 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7: 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
2.1.3.3细胞计数1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。
2.制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液（0.4％）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。
3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中没有被染液染上色的细胞数目。
5.计算原细胞悬液的细胞数L：按照下面公式计算细胞密度：（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4)×2×104说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。
公式中乘以2因为细胞悬液与染液是1：1稀释。
公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3而1ml＝1000mm3。
3结果细胞玻片混合染色那一步经固定染色封片以后可以进行形态学观察以及鉴定。
另外可以进行光镜100倍随机视野下的统计细胞数，进行一些统计学的分析。
MTT那一步结果会得到一些吸收值，进而进行分析。
2.1.3.4传代测贴壁率倒出培养液，PBS洗2次，胰酶消化，加入3ml培养基，采用2个培养瓶Giemsa染色步骤：Giemsa染色也是最常用的染色方法之一，适用于多种细胞和染色体染色。
其主要用Giemsa染液可将细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色，在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。
Giemsa染色的基本材料为：Giemsa粉0.5g，甘油22mL，将Giemsa粉置于研钵内先用少量甘油与之充分混合，研磨至无颗粒；然后将剩余的甘油混在一起，56℃保温2小时后，加入33mL纯甲醇，保存于棕色瓶内。
染色的基本步骤为：（1）准备染液：用pH6.81～7.38的Sorensen缓冲液，按1:9比例取Giemsa染液和Sorensen 缓冲液混合配成染色液；Sorensen缓冲液的配制：pH6.81：Na2HPO4(1/15M) 50mL + KH2PO4(1/15M) 50mL;pH6.98：Na2HPO4(1/15M) 60mL + KH2PO4(1/15M) 40mLpH7.17：Na2HPO4(1/15M) 70mL+ KH2PO4(1/15M) 30mL；pH7.38：Na2HPO4(1/15M) 80mL + KH2PO4(1/15M) 20mL。
(2)细胞标本用甲醇固定10分钟，或用1:3醋酸/甲醇固定30分钟，用滴管把染色液布满玻片上，注意不要有气泡，用染色缸染色亦可，染10～15分钟；(3)用自来水冲去玻片上多余的染料，自然干燥，二甲苯透明，光学树脂胶封固。
染色液宜现用现配，保存时间不超过48小时。
缓冲液pH值要准确，否则影响染色效果。
用染色缸染色前应先用小片滤纸刮除液面的氧化后，再进行染色。
染色完毕将标本浸入水中洗除染液。
Giemsa染色光镜下观察细胞核呈紫红色或蓝紫色，细胞浆成粉红色Wright瑞士染色一般用于血液涂片，也可用于检查肿瘤细胞。
1、试剂配制⑴瑞士染液：（由酸性染料伊红（E-）和碱性染料亚甲蓝（M+）组成）瑞士染料1g甲醇600ml将瑞士染料放入研钵内，加入适量甲醇与之混合研磨，使染料逐渐溶解。
将溶解的染液倾入另一玻璃瓶内，然后再加入适量甲醇继续研磨；未溶解的染料如此反复多次，直至染料完全溶解、甲醇用完为止。
染液避光保存备用。
⑵磷酸盐缓冲液：无水磷酸氢二钠 6.5g磷酸二氢钠4g蒸馏水1000mlPH：6.5—7.02、染色程序⑴涂片自然干燥。
⑵滴加瑞士液染色1min。
⑶滴加等量的磷酸缓冲液，轻轻摇荡玻片或洗耳胶球在玻片上轻轻吹气，使两液体混合均匀，持续10—15min。
⑷流水洗去染液。
⑸涂片风干后，二甲苯透明，中性树胶封片。
注意事项1）血涂片干透后固定，否则细胞在染色过程中容易脱落。
2）冲洗时应以流水冲洗，不能先倒掉染液，以医.学教.育网整.防染料沉着在血涂片上。
冲洗时间不能过久，以防脱色。
如血涂片上有染料颗粒沉积，可滴加甲醇，然后立即用流水冲洗。
3）染色过淡可以复染，复染时应先加缓冲液，然后加染液。
染色过深可用流水冲洗或浸泡，也可用甲醇脱色。
4）瑞氏染色Ⅰ液由瑞氏染料、甲醇（AR级以上）和甘油组成，Ⅱ液为磷酸盐缓冲液（pH6.4～pH6.8）。
细胞计数具体操作：实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
一、准备工作：取一瓶传代的细胞，待长成单层后以备使用。