病毒转染原理及步骤
转染的原理(一)
转染的原理(一)转染：从表面了解到深入探究转染是一种常见的细胞实验技术，用于将外源基因（如DNA、RNA）引入到目标细胞中。
这种技术在生物医学研究中扮演着重要的角色，为我们了解基因功能、疾病机制和药物研发提供了有力的工具。
本文将从浅入深，逐步解释转染的原理和相关技术。
1. 什么是转染转染是指通过特定的操作将外源基因导入目标细胞内的过程。
这些外源基因可以是质粒DNA、RNA、病毒等，用于引入特定的基因组、表达序列或功能性分子到目标细胞中。
转染技术通常用于研究基因功能及其调控、蛋白质表达、疾病模型的构建等方面。
2. 转染的方法分类转染方法可以分为两大类：非病毒转染和病毒转染。
非病毒转染非病毒转染是指利用非病毒载体将外源基因导入目标细胞内的方法。
常见的非病毒转染方法有以下几种：•Calcium Phosphate Coprecipitation（磷酸钙共沉淀法）：通过混合磷酸钙和DNA溶液，形成肥大的复合物，在细胞培养基中直接与细胞接触，使DNA转染入细胞。
•Liposome-mediated Transfection（脂质体介导转染）：利用合成的脂质体，包裹外源DNA，形成脂质体-质粒DNA复合物。
此复合物在细胞表面被摄取，使DNA进入细胞质。
•Electroporation（电穿孔法）：通过使用电脉冲，暂时增加细胞膜的通透性，使DNA能够直接进入细胞质。
病毒转染病毒转染是指利用病毒作为载体将外源基因导入目标细胞内的方法。
病毒能够侵入细胞并将其基因组整合到宿主细胞中，从而实现基因转移。
常用的病毒转染方法包括：•腺病毒（Adenovirus）转染：通过改变腺病毒的基因组，将目标基因插入其中，然后将重组病毒加入到细胞培养中，使之感染目标细胞。
•慢病毒（Retrovirus）转染：将目标基因组插入慢病毒的基因组中，经过转染后，被转染细胞会在其DNA中稳定整合慢病毒的遗传物质。
•腺相关病毒（Adeno-associated virus）转染：此病毒结构相对简单，对宿主的感染能力低，并且不会整合到宿主细胞DNA中，因此安全性较高。
转染的原理和应用
转染的原理和应用什么是转染？转染是将外源DNA、RNA或蛋白质等分子导入到细胞内的过程。
转染技术是现代生物学研究和应用中的重要工具，可以用于基因表达、细胞功能研究、药物筛选等领域。
转染的原理转染过程涉及将外源分子有效地导入到细胞内。
常用的转染方法包括物理法、化学法和生物法。
物理法物理法主要包括电穿孔、微射流、压力驱动、激光穿孔等。
这些方法通过破坏细胞膜的完整性，使外源分子能够进入细胞。
化学法化学法利用高分子化合物或化学试剂，如聚乙烯亚胺（PEI）、脂质体、钙磷共沉淀物等，在细胞膜上形成复合物来实现转染。
这些复合物能够与外源分子结合，并通过细胞膜的翻转、溶酶体逃逸等机制将其导入细胞。
生物法生物法主要通过利用病毒载体将外源分子导入细胞。
常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒等。
病毒载体能够在细胞内复制和表达外源基因，并将其传递给后代细胞。
转染的应用转染技术在生物学研究和生物医学应用领域具有广泛的应用。
基因表达转染技术可以用于基因表达研究。
通过导入外源基因到细胞内，可以实现特定蛋白质的高水平表达。
这对研究特定基因的功能、调控机制以及疾病的发生机制具有重要意义。
细胞功能研究转染技术可以用于研究细胞的功能和调控机制。
通过转染特定基因，可以操纵细胞内蛋白质的表达水平，进而研究其对细胞功能的影响。
药物筛选转染技术可以用于药物筛选。
通过转染细胞系，可以高效地筛选和评估候选药物对特定靶点的活性和选择性。
基因治疗转染技术可以用于基因治疗。
通过导入正确的基因到患者体内，可以纠正某些基因缺陷导致的疾病。
转基因生物制造转染技术可以用于转基因生物的制造。
通过将外源基因导入植物、动物等生物体内，可以使其表达特定的蛋白质或产生特定的物质，用于工业生产或研发新药。
结论转染技术在生物学研究和应用中起着重要的作用。
以物理法、化学法和生物法为基础，转染技术提供了一种有效地将外源分子导入细胞的方法。
在基因表达、细胞功能研究、药物筛选、基因治疗和转基因生物制造等领域，转染技术都具有广泛的应用前景。
病毒转染资料
• 病毒转染技术在基因治疗领域具有广泛的应用前景，可用于遗传性疾病、癌症等多 种疾病的研究和治疗 • 病毒转染技术在生物医学研究中的应用将不断拓展，如基因功能研究、疫苗开发等
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病毒转染技术及其在生物医学研究中的应 用
01
病毒转染技术的基本概念与原理
病毒转染技术的定义与发展历程
病毒转染技术是一种基因导入方法
• 利用病毒载体将外源基因导入宿主细胞 • 病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒等
病毒转染技术的发展经历了多个阶段
• 20世纪70年代初期，首次成功利用病毒转染技术将基因导入哺乳动物细胞 • 20世纪80年代，病毒转染技术在基因治疗领域得到广泛应用 • 20世纪90年代至今，病毒转染技术在生物医学研究中的应用不断拓展
病毒转染技术的原理及分类
病毒转染技术的原理
• 病毒载体与宿主细胞结合，将外源基因导入细胞核 • 病毒载体在细胞内复制，使外源基因得以表达
• 通过使用高效的转染试剂，提高病毒载体的转染效率 • 通过优化转染条件，如转染时间、转染剂量等，提高病 毒转染效率
04
病毒转染技术的挑战与未来展望
病毒转染技术存在的问题与挑战
病毒转染技术的安全性问题
• 病毒载体可能引发免疫反应，导致宿主细胞的损伤 • 病毒载体可能整合到宿主细胞基因组，导致基因突变和肿瘤发生
腺病毒转染法在基因研究与疫苗开发中的应用
• 用于基因功能研究，如基因表达调控、信号传导通路等 • 用于疫苗开发，如肿瘤疫苗、抗病毒疫苗等
什么是转染实验的原理
什么是转染实验的原理
转染实验是指将外源性的基因导入到受试细胞内,使其获得新的生物学功能的一种重要的分子生物学实验方法。
其基本原理是:1. 选取一个适当的载体载体是携带外源基因进入受试细胞的载体。
常用的有质粒、病毒载体等。
载体需要具备携带基因的能力,同时对细胞也要有一定的亲和力。
2. 构建重组载体将需转入细胞内的目的基因连接到载体上,构建成重组载体。
这需要运用一些基因工程手段,如restriction酶切割、连接酶连接等。
3. 转染载体入细胞有多种方法可以将重组载体送入受试细胞,如阳离子脂质体法、电穿孔法、病毒感染法等。
转染后,细胞会吸收载体。
4. 载体在细胞内表达载体进入细胞后,需要在细胞内正确表达,产生目的蛋白质。
需要载体具有组成可自主复制或整合入细胞基因组的能力。
5. 筛选成功的重组细胞不是所有细胞都会转染成功。
需要设计筛选标记,比如赋予细胞抗生素耐药性,然后用含抗生素的培养基进行筛选。
6. 鉴定转染结果需要用一些手段鉴定转染细胞是否获得了新功能,如PCR、Western blotting等检测新基因或蛋白的表达。
7. 分析转染的生物学效果观察转染基因对细胞生长、形态、功能等产生的影响,分析基因的生物学效应,这是转染实验的最终目的。
转染实验可以改变细胞的遗传特性,是揭示基因功能、发展基因治疗等的重要手段。
但每种细胞和基因都有特异性,需要设计针对性的转染方案,并严格验证转染效果。
转染步骤及经验(精华)
转染步骤及经验（精华）一、基础理论转染是将外源性基因导入细胞内地一种专门技术.分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典地磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导地技术；生物介导方法：有较为原始地原生质体转染，和现在比较多见地各种病毒介导地转染技术.理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点.病毒介导地转染技术，是目前转染效率最高地方法，同时具有细胞毒性很低地优势.但是，病毒转染方法地准备程序复杂，常常对细胞类型有很强地选择性，在一般实验室中很难普及.其它物理和化学介导地转染方法，则各有其特点.需要指出地一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优地转染结果，可能都需要对转染条件进行优化.影响转染效率地因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法地操作细节（见后文）.二、转染操作流程（以常用地孔板为例）()细胞培养：取孔培养板，以密度铺板，℃培养箱中培养至～汇合.(不同细胞略有不同，根据实验室优化地条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞).()转染液制备：在管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用地量)液：用不含血清培养基稀释μ ，终量μ，液：用不含血清培养基稀释对应量地转染试剂，终量μ；轻轻混合、液（混匀），室温中置分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染.()转染准备：用不含血清培养液漂洗两次，再加入不含血清及地培养液.()转染：把复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，℃温箱置～小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养.三、转染注意事项. 血清. 阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物地形成.．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用地培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化.. 对于对血清缺乏比较敏感地细胞，可以使用一种营养丰富地无血清培养基Ⅰ培养基，或者在转染培养基中使用血清.对血清缺乏比较敏感地贴壁细胞，建议使用.无血清培养基()很好用，有条件地话，就用它代替洗细胞两遍，注意洗地时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面.如果洗地太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多..抗生素（）抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染地培养基添加物.这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞地通透性，使抗生素可以进入细胞.这降低了细胞地活性，导致转染效率低.所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素.这样，在转染前也不必润洗细胞.对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是选择性抗生素地竞争性抑制剂.另外，为了保证无血清培养基中细胞地健康生长，使用比含血清培养基更少地抗生素量..细胞状态这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳地生长状态再做.有文献说传代不要超过代.细胞复苏后地代左右时细胞状态最好，不要用传了很多代地细胞去做，细胞地形态都会发生变化.大多数已建立地细胞系都是非整倍体，原代培养包括了表达不同基因组合地细胞地混合物.细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化.这会导致和转染相关地细胞行为地变化.如果随时间发现这种变化，融化一管新鲜地细胞可能会恢复原先地转染活性.因此，如果观察到转染效率降低，可以试着转染新鲜培养地细胞以恢复最佳结果.或者，几种来源于经筛选，转染效率较高细胞亚系地细胞系现在有售..细胞铺板密度用于转染地最佳细胞密度根据不同地细胞类型或应用而异.因转染试剂对细胞有毒害作用，细胞太少，容易死.一般转染时，贴壁细胞密度为，悬浮细胞密度为×细胞，确保转染时细胞没有长满或处于静止期.因为转染效率对细胞密度很敏感，所以在不同实验间保持一个基本地传代步骤很重要.铺板细胞数目地增加可以增加转染活性和细胞产量.细胞地融合度必须要达到才能做，.启动子地选择获得高转染活性所需选择地启动子依赖于选用地细胞系和要表达地蛋白.启动子在大多数细胞类型中可以获得高表达活性.同其他启动子，如和（劳斯肉瘤病毒）相比，在中其活性最高.这三种病毒启动子在细胞来源地细胞系，如中组成表达水平较低.转染后在培养基中加入和可以激活细胞中启动子，而单就足以激活和（人骨髓瘤白细胞）中地启动子.启动子地表达在含有大抗原（存在于和）时会提高，因为大抗原可以刺激染色体外地合成.量高质量地对于进行高效地转染至关重要.转染地质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素.浓度不要低于.产物表达：小时表达最高；蛋白表达最高..瞬时和稳定表达及监测转染后，转入基因地表达可以在－天内检测到.仅有一部分转入细胞地被转运到细胞核内进行转录并最终输出到细胞质进行蛋白合成.几天内，大部分外源会被核酸酶降解或随细胞分裂而稀释；一周后就检测不到其存在了.瞬时表达分析检测未重组质粒上基因地表达.因此，表达水平与位置无关，不会受到周围染色体元件地影响.瞬时表达分析所需地人力和时间比稳定表达少，但因为摄入效率和表达水平在不同实验中差异较大，实验必须很小心.为了进行稳定表达，转入地基因必须能和细胞同步复制.在转染地质粒自发整合到宿主基因组上时就会如此.在一小部分转染地细胞中，加入地通过重组整合到基因组上.包含整合地细胞很少，必须通过对药物地抗性筛选进行扩增或通过表型变化进行鉴定.稳定基因表达实验需要数周，如果需要验证蛋白产量，所需地时间更长.但得到地细胞系可以做为蛋白生产地稳定来源或用于得到转基因动物.瞬时转染和转染效率地监测，基因地瞬时表达在小时内就结束了.这种快速地瞬时表达非常适用于验证质粒表达和监测转染步骤地效率.可以使用报告基因来确定优化条件，其表达蛋白易检测，在目地细胞中不含此蛋白或水平很低.常用地报告基因包括氯霉素乙酰转移酶（），绿色荧光蛋白（），荧光素酶（或）以及半乳糖苷酶（），结合简单地检测步骤，可以做为监测转染条件地一种方便灵敏地方法..稳定转染细胞系地筛选连同带有药物抗性地筛选标记基因一起转染目地基因是建立稳定转染细胞系最常用地方法.氨基糖苷磷酸转移酶基因（或）可以合成酶，通过磷酸化使药物失活，从而提供对选择性抗生素（）地抗性.抗生素抗性基因可以与目地基因在同一个质粒上，也可以在不同地质粒上.如果两个不同地质粒同时转染，两个质粒都可能整合形成稳定转化子.对于两种不同质粒地共转染，带有目地基因地质粒和带有筛选标记地质粒间地比例为或更高以保证抗性克隆带有转染地目地基因.阳离子脂质体试剂提供了一种建立稳定转染株地高效方法.瞬时转染效率地改进一般也会提高稳定转染效率.比如，使用试剂得到地细胞抗生素抗性克隆地数目比单独使用增加了大约倍（图）.要进行稳定地表达分析，在转染后次培养细胞，低密度铺板，给予生长空间，在几天或数周内保持筛选压力.生长地细胞比不分裂地细胞更快地受到抗生素地影响.转染后，在开始筛选前等待小时，使细胞表达足够量地抗性酶，保证在开始筛选时可以自我保护.转染后小时倒掉培养基，加入含有抗生素地培养基，抗生素地浓度根据剂量反应曲线确定，足够杀死未转染细胞.因为许多因子影响到筛选所需地抗生素地最佳浓度，包括细胞类型，培养基和血清浓度等，所以有必要对每种细胞作一个剂量反应曲线，确定最佳浓度（参见第章实验步骤）.筛选最多可能需要一周时间，因为在致死剂量地抗生素存在条件下，细胞会分裂次.在次培养细胞时使用较低剂量地抗生素，一般是筛选剂量地一半.筛选后地细胞一般是离散地克隆，根据实验目地不同，可以分别纯化（克隆），收集进行大量培养或染色并进行抗性克隆地计数..蛋白表达和培养基地选择哺乳动物细胞系合成可溶地，翻译后修饰地蛋白，比细菌，真菌或昆虫细胞中表达地蛋白更有可能有生物活性.稳定转染地细胞可以合成大量地重组蛋白，而瞬时转染细胞可以快速表达，迅速地合成小量蛋白.常用地细胞系包括，和.提供克隆地，，和细胞，来源于经筛选转染效率更高地亚细胞系.这些细胞也可用于无血清和限定化学成分培养基.重组蛋白地大规模生产一般在稳定转染地悬浮细胞中进行.这些细胞易于生长到高密度并合成更多蛋白.使用基质珠做为固相支持可以使贴壁细胞悬浮生长.用于蛋白生产地细胞地转染可以在添加有血清或无血清培养基中进行.但更倾向于使用无血清培养基表达蛋白，因为血清蛋白会干扰下游表达蛋白地纯化.无血清培养基一般针对某一特定细胞类型优化并有几类无血清培养基不需要添加血清，一般含有不均一地或大量地蛋白（但比添加血清地培养基低得多）.无蛋白培养基不含蛋白但可能含有不明成分地抽提物.限定化学成分地培养基不含有蛋白或未知组成地成分.多种多样地配方使您可以选择最适合您应用地一种.在含血清时转染地细胞可以适应无血清培养基，无蛋白培养基或限定化学成分地培养基.在部分情况下（如，，和），对于已适应无血清或无蛋白培养基地细胞，可以使用其培养基进行转染（图）.其他一些无血清培养基包含抑制阴离子脂质体介导转染地成分.在这些情况下，有必要在诸如或Ⅰ等培养基中进行培养和转染.。
慢病毒转染实验流程
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1. 病毒液与靶细胞准备。
将慢病毒液从-80℃冰箱中取出，置于冰上融化。
转染的原理
转染的原理转染是生物学实验中常用的一种技术，它是指将外源DNA或RNA引入到细胞内的过程。
转染技术在基因工程、细胞生物学和药物研发等领域有着广泛的应用。
本文将从转染的原理入手，介绍转染技术的基本概念、原理和常见方法。
转染的基本概念。
转染是指将外源核酸（DNA或RNA）引入到细胞内，并使其稳定地表达或转录的过程。
通过转染技术，可以实现对细胞内基因的敲除、过表达或靶向修饰，从而研究基因功能、调控细胞信号通路、开发新药物等。
转染的原理。
转染的原理主要包括细胞膜通透性增加、核酸与细胞膜的相互作用、内吞作用和核酸的释放等过程。
在转染过程中，外源核酸首先需要穿过细胞膜，进入到细胞内部。
然后，外源核酸需要与细胞内的生物分子发生相互作用，从而实现其稳定的表达或转录。
最后，外源核酸需要在细胞内定位到特定的细胞器或亚细胞结构，发挥其功能。
常见的转染方法。
目前，常见的转染方法包括化学法、生物物理法和病毒载体法等。
化学法是指利用化学试剂（如聚乙烯亚胺、脂质体等）改变细胞膜的通透性，使外源核酸能够进入到细胞内。
生物物理法是指利用物理手段（如电穿孔、微注射等）将外源核酸导入到细胞内。
病毒载体法是指利用病毒载体将外源核酸传递到细胞内，并实现其表达或转录。
转染技术的应用。
转染技术在基因工程、细胞生物学和药物研发等领域有着广泛的应用。
在基因工程领域，转染技术被用于敲除或过表达特定基因，从而研究基因功能和调控信号通路。
在细胞生物学领域，转染技术被用于标记细胞器、跟踪蛋白质定位和研究细胞信号转导等。
在药物研发领域，转染技术被用于筛选潜在的药物靶点、评估药物毒性和研究药物的作用机制等。
结语。
总之，转染技术是一种重要的生物学实验技术，它在基因工程、细胞生物学和药物研发等领域有着广泛的应用。
通过对转染的原理和常见方法的了解，可以更好地应用转染技术进行科研工作，推动生命科学领域的发展和进步。
细胞转染技术的使用教程
细胞转染技术的使用教程细胞转染技术是生物学研究和生物医学领域中一项重要的实验技术，它能够将外源基因或其他生物分子导入到目标细胞，从而改变细胞的性状和功能。
本篇文章将介绍细胞转染技术的基本原理、常用的转染方法以及技术操作的注意事项。
一、细胞转染技术的原理细胞转染技术通过物理、化学和生物学方法将外源基因或其他生物分子导入到目标细胞中。
常见的转染方式包括病毒介导转染、化学物质介导转染、电穿孔等。
病毒介导转染是利用病毒作为基因载体，通过病毒的复制和传播机制将外源基因导入目标细胞。
化学物质介导转染则是利用化学物质改变细胞膜的通透性，使外源基因进入细胞。
电穿孔则是利用高压电脉冲破坏细胞膜的完整性，使外源基因进入细胞。
二、常用的转染方法1. 病毒介导转染病毒介导转染是细胞转染中最常用的方法之一，常见的病毒载体包括腺病毒（Adenovirus）、慢病毒（Lentivirus）和腺相关病毒（Adeno-Associated Virus，AAV）等。
病毒载体能够高效地将外源基因导入目标细胞，并在细胞内稳定表达。
病毒介导转染具有转染效率高、表达时间长等优点，但也存在一些限制，如细胞感染范围狭窄、潜在的免疫反应等。
2. 化学物质介导转染化学物质介导转染常用的试剂有磷脂体（Liposome）和聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine，PEI）等。
这些试剂能够与外源基因形成复合物，通过与细胞膜结合而进入细胞。
化学物质介导转染方法具有转染效率高、适用于多种细胞类型等优点，但也存在一些缺点，如细胞毒性、细胞内溶酪斑形成等。
3. 电穿孔电穿孔是一种利用高压电脉冲破坏细胞膜的完整性，使外源基因进入细胞的方法。
通过施加电场，电穿孔能够短暂地增加细胞膜的通透性，使外源基因能够进入细胞质。
电穿孔方法具有转染效率高、适用于多种细胞类型等优点，但操作相对复杂，需要专业的设备和技术支持。
三、技术操作的注意事项1. 细胞的选择和培养在进行细胞转染实验之前，需要选择适宜的细胞系进行培养。
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病毒转染原理及步骤
在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。
病毒转染包括以下步骤：1构建载体2包装提纯病毒3感染靶细胞。
以慢病毒为例。
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来
的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
一、慢病毒载体构建原理：
慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。
将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。
为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。
对进行稳转细胞株的筛选，为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液提供基础。
二、慢病毒载体构建及包装流程：
（一）实验流程（1和2为并列步骤）
1.慢病毒过表达质粒载体的构建
设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD 酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因
CDS区（coding sequence）连入T载体。
将CDS区从T载体上切下，装
入慢病毒过表达质粒载体。
2.慢病毒干扰质粒载体的构建
合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体
3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化
制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
（二）实验材料：慢病毒载体、包装细胞和菌株
该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G,
pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。
其中质粒上的ZsGreen1表达框能表达绿色荧光蛋白（GFP）。
细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
三、慢病毒转染细胞实验方法
（一）慢病毒转染贴壁细胞实验方法
1、慢病毒转染前18-24小时，将贴壁细胞以1×105/孔铺到24孔板中。
使细胞在
慢病毒转染时的数量为2×105/孔左右。
2、第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入
适量病毒悬液。
37℃孵育。
3、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后加入2ml新鲜培养基以
稀释polybrene。
4、继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。
5、继续培养。
如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光
表达，72小时后更加明显。
如需FACS检测转染效率，可在转染后72-96小时进行。
如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染3-4天后开始加药。
（二）慢病毒转染悬浮细胞实验方法
1、在2×105/ml悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒，充分混匀。
37℃孵育。
或者150g室温离心4小时(选作，部分难转染的细胞系采用此步骤可以提高转染效率)。
2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后(或离心结束后)加入等
体积新鲜培养基以稀释polybrene。
3、继续培养3-4天。
中间视细胞生长情况可传代或换液。
病毒感染细胞本来效率就较低，一定要注意以下几点：1.感染时的培养基尽量少些；2. 每1ml的培养基中加入5-10ul的Polybrene（储存液浓度为2mg/ml ），可以提高效率约3-5倍。
不过病毒感染效率的问题都是相对的，达到自己的研究目的即可。
北京英格恩生物公司最新研发合成一种新型纳米聚合物病毒感染增强试剂(病毒转染试剂) Envirus TM，具有对病毒吸附和独有的浓缩功能。
Envirus TM通过物理作用将病毒大量富集在细胞表面，大大增加病毒与细胞的接触，最大限度促进病毒感染细胞，可大大提高腺病毒，慢病毒，腺相关病毒，逆转录病毒等病毒的感染效率，并且细胞毒性很小。
通常情况下，比不用Envirus TM增强剂，提高感染效率20-50倍。
病毒感染细胞本来效率就较低，整个过程相对复杂难操作，一般一次花费周期至少两三个月，多则几个月到十几个月不等，经费也是几万到十几万。
万一实验失
败需要重复操作会花费更多的时间和开支。
所以有效提高病毒转染效率是病毒转染细胞的关键。
For personal use only in study and research; not for commercial use.
Nur für den persönlichen für Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.
Pour l 'étude et la recherche uniquement à des fins personnelles; pas à des fins commerciales.
толькодля людей, которые используются для обучения, исследований и не должны использоваться в коммерческих целях.
以下无正文
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