激光共聚焦使用技巧和注意事项
共聚焦开关机流程及使用注意事项
共聚焦开关机流程及使用注意事项一、开机：1．打开PSU主电源（Main），先开开关，再开钥匙。
2．打开MCPSU（含半导体激光电源405，635nm）, 直接开开关3．打开显微镜电源IX2-UCB4．打开电脑，进入共聚焦软件5．打开荧光汞灯光源（15分钟内勿开、关），根据需要开激光器（黑盒子氩离子激光器：488,515nm; 白盒子LD559nm）。
注意：开氩离子激光器时先开开关，再开钥匙。
开LD559激光器时先开开关，见绿灯(Temp）闪烁，待绿灯闪烁约5分钟完毕后，再开钥匙，此时见红灯闪烁，待红灯闪烁约5分钟完毕后即可使用。
二、关机：1．488,515nm氩离子激光器：先关钥匙由1到0，等待风扇凉下来（会听到很大的声音停止）再关开关。
2．LD激光器（559nm），先关钥匙再关开关。
3．其他部件有钥匙的先关钥匙，后关开关。
三、使用注意事项1．每次切换物镜时务必先将其落至最低位置。
每次试验结束后，务必将物镜落至最低位置，然后切换到4倍物镜处。
2．实验完毕后将手动光闸小门关闭，即由空心圈转至实心圈。
使用时开机后再将其打开。
3．调节焦距时，注意微粗调的转换，并且注意观察显示器操作界面上焦距的数值，防止焦平面调得过高使样品片损伤物镜镜头。
一般样品焦平面在正负600µm 以内。
4．只拍CCD图片时，激光器都不用开，只开汞灯即可。
汞灯光源有三个激发波段：WU 330-385nm, NIBA 470-495nm, WIG530-550nm。
汞灯光源的强弱可以用黑色光源盒子的闸调节。
5. 用镜头液擦拭镜头时，向同一个方向擦拭，不要来回擦，用力要轻。
6．通风机组的使用：先打开配电箱的绿色按钮，开启通风，再开空调。
不可单独使用空调。
关闭时，先关空调再关闭配电箱的红色按钮。
激光共聚焦显微镜注意事项
激光共聚焦显微镜注意事项《激光共聚焦显微镜：那些你不可不知的注意事项朋友们，今天咱就来唠唠激光共聚焦显微镜这个“神奇”的玩意儿，不过在使用它的时候，那可真是有不少需要注意的事儿呢，且听我一一道来。
首先，这仪器就像是个娇贵的大小姐。
每次使用前，你得像伺候大小姐起床一样，精心准备。
那环境温度和湿度得在合适的范围，温度要是太高了或者太低了，这显微镜就像大小姐耍小脾气似的，可能就不那么好使了。
湿度也是，稍不注意就可能让仪器受潮，那就麻烦了。
我有一次就因为疏忽了湿度，结果图像上总有一些奇怪的噪点，费了好大劲排查才发现是这个问题。
在操作过程中，样品的制备简直是关键中的关键。
这就好比给大小姐打扮，如果打扮不好，她可不会美给你看。
样品要是太厚了，激光就像个疲惫的工人，根本穿不透啊，你就没法得到理想的图像。
而且，荧光标记的时候必须准确无误，就像给大小姐涂口红，涂歪了可不行。
有一次我少加了一种荧光染料，结果想要看的两个信号硬是少了一个在图像里，感觉就像准备了一场接力赛，结果发现少了一个运动员。
再说到聚焦的问题。
你得小心翼翼地转动旋钮，就像走钢丝一样，稍微一转多了，美好的图像就“失焦”了，那画面一下子就成了模糊的“印象派”画作，看起来一团糟。
这时候心里那个郁闷啊，就像精心准备的演出结果一下子乱了套。
还有，对激光功率也要谨慎对待。
这激光功率像是大小姐的饭量，给多了不行，给少了也不行。
功率太高，样品会被烤焦的啊，就像头发用了太多高温直板夹，变得脆脆的。
功率太低呢，荧光信号又弱得可怜，像是星星点点散在夜空中微弱的光一样，根本看不清全貌。
当使用完之后，这仪器的清洁和复位可不能偷懒。
你要把它恢复如初，就像是送大小姐回闺房休息一样，各种部件要归位，该清洁的地方要清洁干净。
要是觉得用完就万事大吉，下次使用的时候，可能就会遭遇各种莫名奇妙的问题。
激光共聚焦显微镜虽然是一个超级强大的工具，但使用起来就像和一个挑剔的伙伴合作一样。
你必须细心周到，遵守这些注意事项，才能让它乖乖听话，为你展现出微观世界的精彩画卷。
Zeiss激光扫描共聚焦显微镜操作手册
Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜操作手册目录：1 系统的组成系统组成及光路示意图实物照片说明2 系统的使用开机顺序软件的快速使用说明显微镜的触摸屏控制关机顺序3 系统的维护1 系统的组成激光扫描共聚焦显微镜系统主要由：电动荧光显微镜、扫描检测单元、激光器、电脑工作站及各相关附件组成;系统组成及光路示意图：电脑工作站激光器电动荧光显微镜扫描检测单元实物照片说明：电动荧光显微镜扫描检测单元CO2 培养系统控制器激光器电脑工作站2 系统的使用开机顺序1打开稳压电源绿色按钮等待2 分钟电压稳定后,再开其它开关2主开关MAIN SWITCH “ON”电脑系统SYSTEMS/PC “ON”扫描硬件系统COMPONENTS “ON”3打开电动显微镜开关打开荧光灯开关注：具有5 档光强调节旋钮4Ar 离子激光器主开关“ON”顺时针旋转钥匙至“—”预热等待约15分钟,将激光器扳钮由“Standby”扳至“Laser run”状态,即可正常使用5打开电脑开关,进入操作系统注：键盘上也具有电脑开关软件的快速使用说明1电脑开机进入操作系统界面后,双击桌面共聚焦软件ZEN 图标2进入ZEN 界面,弹出对话框：“Start System”——初始化整个系统,用于激光扫描取图、分析等;“Image Processing”——不启动共聚焦扫描硬件,用于已存图像数据的处理、分析;3软件界面：1 功能界面切换：扫描取图Acquisition、图像处理Processing、维护Maintain注：Maintain仅供Zeiss专业工程师使用2 动作按钮；3 工具组多维扫描控制；4 工具详细界面；5 状态栏；6 视窗切换按钮；7 图像切换按钮；8 图像浏览/预扫描窗口；9 文档浏览/处理区域；10 视窗中图像处理模块动作按钮：Single ——扫描单张图片、并在图像预览窗口显示;Start ——开始扫描单张图片或一个实验流程1组图片,如XYZ、XYT 等;Stop ——暂停/结束扫描;New ——建立一个新图像扫描窗口/文档;激光连接状况检查眼睛观察/相机/共聚焦LSM 光路切换ZEN软件界面右上角：Ocular ——通过观察筒用眼睛观察;激光安全保护装置自动阻断激光、保护眼睛; Camera ——光路切换至相机;LSM ——共聚焦扫描成像光路;显微镜设置：“Ocular”——>“Light Path”——>点击物镜图标,选择物镜——>样品聚焦;透射光控制Transmitted Light Control反射光光闸控制Reflected Light Shutter荧光激发块选择Reflector共聚焦LSM 扫描设置点击“LSM”ZEN软件界面右上角,系统切换至共聚焦扫描光路：光路设置：Smart Setup ——自动预设光路选取“荧光探针”、“颜色”、扫描方法,应用“Apply”;注：Fastest 为最快速扫描,多条激光谱线同时扫描;Best signal 为最佳信号扫描,多条激光谱线顺序扫描;Best compromise 为兼顾速度与信号的折中式扫描;扫描图像参数设置：每个通道的精细调节：包括：1Pinhole的调节一般设为1AU;该值越大,则信号越强,但共聚焦图像效果会降低;原则上, 在保证图像质量的前提下,该值越接近于1AU 越好；2Master Gain的调节增大则信号和噪音都增强,减小则信号和噪音均减小;原则上,在保证图像质量的前提下,Gain值越小越好；3Digital Offset的调节可扣除背景噪音,但标本信号也有一定程度的扣除;原则上,在保证图像质量的前提下,Digital Offset值越接近于0越好；4Digital Gain的调节增大则信号和噪音都增强,减小则信号和噪音均减小;原则上,在保证图像质量的前提下,Gain值越接近于~越好；5另外,对于每个通道,需要灵活调节激光的强度激光强度越高,则信号越强,但噪音也相应增强,同时标本更容易被漂白或淬灭;原则上,在保证图像质量的前提下,激光强度越低越好; 选择可连续扫描、一边预览图像效果、一边精细调节各个通道的扫描参数;如果预览图像的效果可以,则先“Stop” ,再点击“Single” 或“Start”即可完成图像的扫描;图像的保存：三种方法：1“File”菜单下,“Save”或者“Save AS”;2点击右下角按钮;3点击工具栏按钮;如图所示另外,通过“File”菜单下的“Export”,也可将图像以其它格式输出;显微镜的触摸屏控制显微镜可由TFT 液晶触摸屏进行控制：由触摸屏“Home/主页”进入“Control/显微镜控制”界面,触摸屏常用控制界面：TFT触摸屏控制直观、便捷;Objectives物镜控制TL透射光光闸RL反射光光闸Reflector荧光激发块控制荧光观察时,需要选择相应的荧光激发块或者激发波长、发射波长相近的荧光激发块Light path光路设置触摸控制,可将光路切换至“Eyepiece”目镜观察筒,或者将光路切换至左侧共聚焦光路“Sideport L”,或者将光路切换至前侧“Frontport”相机;关机顺序：1关闭软件：主菜单“File”——>“Exit”,退出共聚焦软件ZEN;2关闭主电脑操作系统、显示器电源;3关闭荧光灯电源;4关闭电动显微镜电源;5关闭Ar 激光器：先将扳钮从“Laser run” 扳到“Standby” 状态；再将钥匙逆时针从“—”旋转到“O”状态；等待约8-10分钟、激光器风扇停止转动后切记,将主开关按钮按到“OFF”;6扫描硬件系统COMPONENTS “OFF”电脑系统SYSTEMS/PC “OFF”主开关MAIN SWITCH “OFF”7等灯箱充分冷却后,再放防尘罩;8如果系统长时间超过5个小时不使用,则关闭稳压电源;3 系统的维护主要注意事项如下：1打开稳压电源时,应等待2 分钟电压稳定后,再开其它开关;2严格遵守激光器的开、关流程详见“、开/关机顺序”;3如果使用过油镜,或者物镜表面较脏,则需用擦镜纸擦干净物镜的前表面清洁液使用无水乙醇和无水乙醚的混合液,混合比例：无水乙醇30%、无水乙醚70%;4不使用荧光时,不打开荧光灯;避免频繁开/关荧光灯;5必须等灯箱充分冷却后,再小心地盖上防尘罩;6显微镜可由TFT触摸屏控制,使用触摸屏时注意：①手指保持清洁、干燥状态,并且为了保证他人使用安全,触摸时严禁配戴有可能接触污染物或危险样品的手套；②触摸屏已足够灵敏,不要大力按压触摸屏；③不要旋转、插拔触摸屏;7刻录图像数据资料：应使用刻录光驱刻录,实验前应准备好刻录光盘; 切记：为了防止计算机病毒,严禁在共聚焦电脑上使用U盘、硬动硬盘或者上网8未经授权,严禁自行安装任何软件9实验室温度应保持在22℃±2℃,湿度40%-60%;10避免空调直接对着显微镜吹风;11整个实验过程应注意保持显微镜周围环境清洁;。
激光共聚焦显微镜操作指南说明书
激光共聚焦显微镜操作指南说明书激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope）是一种高分辨率、高对比度的显微镜，广泛应用于生物医学研究、材料科学等领域。
本操作指南将详细介绍激光共聚焦显微镜的操作流程和基本操作技巧，帮助用户正确、高效地使用该设备。
一、设备准备在开始使用激光共聚焦显微镜前，需要进行以下设备准备：1. 检查电源线和数据线是否连接正常，确保设备供电和数据传输正常；2. 检查激光源是否正常工作，激光功率是否稳定；3. 检查镜头和滤光片是否清洁，清除灰尘和污渍，确保成像质量；4. 准备适当的标本样品，并将其固定在载玻片上。
二、系统启动1. 确保设备处于待机状态，按下电源按钮，等待系统启动；2. 检查系统软件是否正常运行，若出现异常情况，及时联系维修人员进行处理；3. 检查镜头和滤光片的安装是否正确，确保成像时的光路通畅；4. 开启激光源，根据需要选择合适的激光波长和功率；5. 调节扫描镜和物镜的位置，使光线准确聚焦在样品上。
三、图像获取1. 打开激光共聚焦显微镜软件，并根据需要选择合适的成像模式；2. 调节激光功率和增益，确保图像的亮度和对比度适宜；3. 调节扫描镜的扫描速度，根据样品的要求选择合适的扫描速度；4. 调节焦距和聚焦位置，通过手动或自动对焦功能获取清晰的图像；5. 点击图像捕捉按钮，记录当前图像或录制图像序列。
四、图像处理和分析1. 通过激光共聚焦显微镜软件提供的图像处理功能，对图像进行调整和增强，以获得更好的观察效果；2. 根据需要，利用软件提供的计算和分析功能对图像进行进一步处理，如三维重建、光学切片等；3. 对图像进行定量分析时，选择合适的工具和算法，并按照要求设定参数；4. 记录和保存处理后的图像数据，以备后续分析和报告撰写使用。
五、设备关闭1. 停止图像采集和处理工作；2. 降低激光功率，关闭激光源；3. 将扫描镜和物镜返回初始位置，关闭设备；4. 断开电源和数据线，保持设备清洁干燥。
共聚焦使用指南
共聚焦使用指南一、开机1.打开显微镜开关，汞灯开关，电脑开关（地上）。
2.打开激光器开关按钮（右边3个，左边1个（观察DAPI））。
若只分析图片，只开PC/Stand的开关。
3.电脑上打开软件Leica confocal software:公司模式。
4.打开激光外器钥匙（右边3个，左边1个（观察DAPI））。
若只分析图片，不用打开钥匙。
5.488激光调节器（LevelAr/ArKr）至水平状态。
若只分析图片，不用调节此处。
二、显微镜下观察1.放好样品。
2.显微镜身左边：分光拉杆拉至中间，转盘调至相应激发光。
3.显微镜身正前方：Poris调至VIS;MAG调至1x。
4.选择合适倍数调好焦距：荧光弱需要大倍数200x,400x采集图片。
三、电脑下观察采集图片（选择第一通道）1.显微镜转盘转至SCAN，分光拉杆全部推进。
2.显微镜身正前方Poris调至side;MAG调至B灯亮后回调至UV。
3.电脑软件左下角microcontrol选择SCAN。
4.点击软件左下角Beam，选择荧光通道（用途）。
5.双击选择Beam右上角DAPI ，点击软件左下角Continous实时观察。
6.显示窗口Experiment的Qlut看曝光是否过度（蓝色表示过度），可调节Beam左上角的ND值，桌上PMT1和pinhole(此值一般AE在1-1.5，慎调)控制曝光；ZOPS可调节图片Z轴聚焦。
7.点击Beam上Save(回车2次)。
8.Continous调至STOP关闭实时观察。
（选择第二通道）9.双击选择Beam右上角ZZ-FITC，点击软件左下角Continous实时观察。
10.显示窗口Experiment的Qlut看曝光是否过度（蓝色表示过度），可调节Beam上的488通道的百分值，桌上PMT1和pinhole(此值一般AE在1-1.5，慎调)控制曝光；ZOPS可调节图片Z轴聚焦。
11.点击Beam上Save(回车2次)12.Continous调至STOP关闭实时观察（选择第三通道）13.双击选择Beam右上角ZZ-TRITCwide，点击软件左下角Continous实时观察。
初学者 激光共聚焦应用技巧
激光共聚焦应用技巧
一、巧用针孔（pinhole）
1、针孔越大，光学切片越厚，图像荧光越亮，纵向（Z轴）分辨率下降。
2、针孔越小，光学切片越薄，图像荧光亮度变低，纵向分辨率提高。
（最终受限于物
镜）。
3、贴壁细胞拍摄，荧光较弱，增大针孔（2-3AU）
4、三维层扫，薄样品的精细三维结构获取，缩小针孔（0.8AU）。
5、Live预览下的快速聚焦：增大针孔，快速找到焦面后在缩小。
二、自发荧光解决办法
1、提高激光压低Offset
2、进行光谱拆分扫描：标记前样品------XYλ扫描------标记后样品---- XYλ扫描
------Process:/Tools:/Dye separation
三、荧光弱时的对策：
1、扩大PMT通道的检测范围
2、增大针孔
3、线/面叠加
4、Live预览时降低激光强度，提高Gain；Capture时提高激光强度，降低Gain
5、同时注意降低噪点：减低Speed，Frame/Line Average
四、三维扫描的技巧
1、补偿Compension
2、对易淬灭的多标记样品，在顺序扫面过程中选择“between stacks”，先采集易淬灭
的荧光信号。
3、调节层切间隔距离（z-step size）。
激光共聚焦使用方法
激光共聚焦使用方法嘿，朋友们！今天咱就来聊聊激光共聚焦这玩意儿的使用方法。
激光共聚焦啊，就好比是一个超级厉害的微观探险家！你想啊，它能带着我们深入到那些小小的细胞世界里，去发现好多神奇的东西呢。
首先呢，得把设备准备好呀，就像战士要先磨好自己的刀一样。
确保仪器干净整洁，各部件都正常工作。
然后呢，把咱要观察的样本放好，这可不能马虎，得放得稳稳当当的。
接下来就是调整各种参数啦。
这可不能瞎调，得根据实际情况来。
就像调收音机的频率似的，得找到最合适的那个点。
激光的强度啦、扫描的速度啦，都得仔细琢磨。
要是调得不合适，那看到的图像可就不清晰啦，那不就白折腾啦！当一切都准备就绪，就可以开始扫描啦。
看着那激光束在样本上扫来扫去，就好像是在给细胞们做按摩一样。
嘿嘿，这时候你就等着那些神奇的图像出现在屏幕上吧。
你说这激光共聚焦神奇不神奇？它能让我们看到平时看不到的细节，那些细胞里的小秘密都能被它给揪出来。
这就好比我们有了一双超级眼睛，能看穿一切！在使用的过程中，可别粗心大意哦。
要时刻关注着图像的质量，要是有啥不对劲的地方，赶紧调整。
就像开车一样，得时刻注意路况，随时调整方向。
而且哦，使用完了也得好好收拾。
把仪器清理干净，该关的关了，该保存的数据保存好。
可别用完就不管啦，那下次再用的时候可就麻烦咯。
总之呢，激光共聚焦的使用可没那么简单，但也绝对不是什么难事。
只要咱用心去学，用心去做，肯定能把它用得溜溜的。
让我们一起用激光共聚焦去探索那些微观世界的奇妙吧！难道不是吗？。
激光共聚焦使用技巧和注意事项
激光共聚焦使用技巧和注意事项激光共聚焦（Laser Scanning Confocal Microscopy，简称LSCM）是一种高分辨率、高对比度的显微镜技术。
它通过使用高功率激光束和扫描探测器来获得样品的三维影像。
在使用激光共聚焦之前，我们需要了解一些使用技巧和注意事项。
首先，为了获得高质量的图像，我们需要认真选择合适的探测器和滤光片。
常见的探测器包括光电倍增管（PMT）和雪崩光电二极管（APD），它们具有不同的检测范围和灵敏度。
滤光片的选择决定了激光的发射和接收，所以我们要根据样品的荧光颜色选择合适的滤光片。
其次，样品的处理和固定也非常重要。
在进行激光共聚焦之前，我们需要对样品进行固定，以防止运动。
有许多不同的固定方案，如化学固定、交联固定和冷冻固定等。
不同的固定方法适用于不同类型的样品。
此外，处理样品时要尽量避免引入氧气，以防止荧光物质的氧化。
第三，我们要注意激光的功率和曝光时间。
激光功率过高会导致样品的灼伤和荧光物质的衰减。
因此，在使用激光之前，我们应该先经过一定的实验确定适当的功率范围。
同样地，曝光时间也需要适当调整，以避免图像的过曝。
此外，选择适当的对焦方式对于获得清晰图像非常重要。
在使用激光共聚焦时，我们可以选择自动对焦或手动对焦等方式。
自动对焦通常需要校准焦距和步长，以获得最佳成像结果。
手动对焦需要操作人员不断地通过调节焦距来保持图像的清晰。
最后，数据的处理和分析也是使用激光共聚焦的重要部分。
在获得图像后，我们可以使用图像处理软件对图像进行修饰和增强。
在对图像进行分析时，我们可以使用各种图像分析工具和算法，如3D重建、荧光定量和荧光共振能量转移等。
综上所述，激光共聚焦是一种强大的显微镜技术，但在使用时需要注意一些技巧和注意事项。
选择合适的探测器和滤光片，适当处理和固定样品，控制激光功率和曝光时间，选择适当的对焦方式，以及有效处理和分析数据，将有助于获得高质量的图像并提供准确的结果。
激光共聚焦扫描显微镜操作规程
激光共聚焦扫描显微镜操作规程一．开机程序1．开启总电源，确认所有仪器电源状态正常工作2．开启电脑，双击桌面上的LSM510图标，开启显微镜。
3．在初始平面上点击Start Expert Mode 键开启专家拍摄模式。
4．在主菜单中点击File New键，建立新的数据库。
二．软件拍摄1．在主菜单上点击Acquire Laser键，开启需要使用的激光2．在主菜单上点击VIS键，开启显微镜观察模式3．把需要观察的玻片放到载物台上选择需要观察的平面4．在主菜单上点击LSM键，开启进入显微镜激光扫描模式5．在主菜单上点击Config键，选择所需要扫描的模式及参数6．在主菜单上点击Scan Find键，进行图像参数自动校正7．在Scan子菜单下点击Fast X键，进行层面选择8．在连续扫描中调节放大器增益、补偿；激光强度等图像参数来优化图像9．点击图像子菜单上的Save键存储优化好的图像三．关机程序1．完成所有操作后，关掉激光开关，冷却5分钟后，点击主菜单上Exit键，退出所有程序2．关闭电脑3．关闭电源ZEISS 510 MET A二维扫描程序1.在Acquire → config →确定扫描所需的波长，（如果已作过相同方法的扫描，可直接调出一张相同条件的图像，用图像窗中的Reuse确定有关的扫描条件）2.在Acquire → micro →在低倍镜(透射光或荧光)下找到要观察的图像3.在Scan control → mode → find →在显示器上找到图像，选定扫描需用的分辨率4.调节物镜到适当的放大倍数5.Scan control → mode →New，打开一新图像窗6.在Scan control → mode → cont →用zoom将图像大小调至最佳，用Pinhole（一般选1）、Detector Gain（650左右，不宜时间超过800，也不宜低于500）、Amplifier offset（不宜过低），以及选择作算术平均值次数、调节激光强度（488nm不超过25%）等调节图像质量至最佳。
激光扫描共聚焦显微镜操作指南说明书
激光扫描共聚焦显微镜操作指南说明书[激光扫描共聚焦显微镜操作指南说明书]引言：本操作指南为用户提供激光扫描共聚焦显微镜的详细操作流程及相关注意事项。
在使用本设备之前，请仔细阅读本指南，以确保能够正确、安全地操作设备，并获得最佳的成像效果。
一、设备介绍激光扫描共聚焦显微镜是一种先进的显微镜技术，结合了共聚焦成像和激光扫描技术，可以实现高分辨率、三维成像及活细胞观察等功能。
本设备由以下主要部分组成：1. 共聚焦显微镜主体：包括光源系统、光学系统、扫描系统、探测器等核心部件。
请勿对主体进行任何未经授权的拆卸或修改。
2. 控制系统：用于控制设备的开关、成像参数设置、图像采集及处理等功能。
在操作设备之前，请确保控制系统处于正常工作状态。
二、准备工作在操作激光扫描共聚焦显微镜之前，请进行以下准备工作：1. 检查设备：确保设备的电源线、信号线、光纤等连接线路良好，无损坏或松动情况。
2. 准备标本：根据需要观察的样本类型，准备适当的标本片，并在标本片上施加适当的荧光染料。
3. 调整镜片：根据需要选择适当的镜头，并按照设备说明进行安装和调整。
三、操作步骤以下为基本的操作流程，具体步骤可能会因设备型号和厂家而有所不同，请根据实际情况进行操作：1. 打开设备电源：将电源开关置于“开启”位置，待设备启动完全后，检查设备各部分是否正常。
2. 设置成像参数：通过控制系统，设置激光波长、放大倍数、成像模式等参数。
根据标本类型及观察需求，合理选择参数设置。
3. 校准镜片：根据设备说明书，进行扫描头和标本之间的焦距调整，保证成像过程中的清晰度和准确度。
4. 开启激光：根据标本需要，选择相应的激光波长，并逐一打开相应激光。
5. 定位标本：通过显微镜目镜进行初步观察，调整位置和焦距，使标本位于成像区域。
6. 开始扫描成像：在控制系统中选择扫描图像模式，点击“开始扫描”按钮，启动扫描成像过程。
7. 图像采集和处理：根据需要，可设置图像采集的帧数、分辨率等参数，并在采集图像后进行必要的图像处理和分析。
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犹他大学神经生物与解剖学 美国犹他州盐湖城 样品：斑马鱼胚胎视网膜神经轴突 技术：共聚焦显微镜
吉森大学生殖生物学系解剖学与细胞生物学中心 德国吉森 样品：大鼠睾丸冰冻切片 技术：共聚焦显微镜
德国汉堡大学医学中心 德国汉堡 样品：端复胞器 技术：共聚焦显微镜
显微镜常用观察方式：
BF-明场
PH -相差
光谱拆分（Unmixing）
光谱反卷积（deconvolution）
各种荧光蛋品，普遍存在着荧光发射光谱重叠 染料串色（DAPI/FITC… ） 背景自发荧光 （组织FISH、植物标本…）
Spectral Unmixing
YOYO-1 (nuclei) 515-nm emission before unmixing Alexa488 (F-Actin) Colour merged after unmixing
分辨率∝物镜数值孔径（NA） 荧光亮度∝NA4/M2
UPLFLN40XO UAPO40XO PLAPON60XO UPLSAPO60XW UPLSAPO100XO
:NA1.30 :NA1.30 :NA1.42 :NA1.20 :NA1.40
正确使用物镜
低倍至高倍找标本、观察、扫描成像
针孔、激光强度和检测器灵敏度
针孔
一般情况Pinhole处于 Auto状态
实际使用中：
薄标本（活细胞等）：增大针孔，提供图像亮度 ，得到更好反差的图像，有效的保护标本。 厚标本（厚组织切片等）：减小针孔，获取更薄 的图像，更好细节的图像。
针孔大小关系
检测器：PMT
HV推荐值：不高于700
CTRL+H
激光等级:Class 3B
佛罗里达显微镜知识资源网站
全世界最全的各类显微镜产品和应用宝库
谢 谢！
选择合适荧光染料
理想的荧光染料或探针
1.高QE(quantum efficiency) 2. 不容易漂白（ photobleaching） 3. 对于活细胞无或少光毒性（phototoxic ) 4. 与自发荧光（ autofluorescence）重叠少 5. 多标尽量减小不同荧光物质间激发/发射光谱 的重叠。 6.多标选择发射波段距离远的不同探针
7S/Frame
扫描速度
推荐值: 8/10us/pixel
建议：
适当放慢扫描速度，可获得更佳的成像信噪比
但是:快速测量需注意
1.改变扫描速度 2.采用双向扫描 3.减少采样点数(牺牲空间分辨率） 4.采用线扫描(xt) KCL
KCL
KCL诱导的细胞外Ca++内流测量
亮度补偿
AutoHV: 自动补偿电压值
大鼠平滑肌 肌动蛋白 糖蛋白 细胞核
向日葵花粉粒 自发荧光
激光扫描共聚焦显微镜 常用观察方式
荧光： FL
微分干涉：DIC
逐点扫描 逐点成像
制样准备
常用培养器具
培养瓶 培养皿 （ 35mm/60mm/100mm ） 培养板 （6孔/12孔/24孔/48孔/96孔）
薄底培养皿(0.17mm)
有盖片(0.17)的玻片标本
Intensity
Big difference in intensities
lambda
注意事项：油镜
过多的镜油造成： 污染其他镜头 污染显微镜机身 浪费 推荐： 一小滴即可 用完立即清洁
关机注意事项
待灯箱冷却后，再盖上 防尘罩。
维护与保养
清洁液： 无水乙醇 （分析纯） 清洁工具： 擦镜纸、镊子、吹气球
清洁方向： 由内自外 顺时针/逆时针
清洁位置
目镜、聚光镜顶部、物镜
3 2
1
激光安全
DIC-微分干涉
FL -荧光
DF- 暗场
RC-浮雕相衬
PO-偏光
共聚焦核心原理
光电倍增管 (PMT) 分光系统 共聚焦针孔 (Pinhole)
WF
Confocal
激光
物镜
针孔效应：
标本
XY方向的分辨率有提升 Z方向分辨率明显提升
激光扫描共聚焦显微镜
普通宽场荧光
激光扫描共聚焦
小鼠脑片 胶质纤维酸性蛋白 神经纤维丝蛋白 细胞核
共聚焦观察推荐
标本放置
细胞贴壁面，靠近物镜一侧
玻片四角用透明指甲油固定
盖片标本: 盖片向下—倒置显微镜 盖片向上—正置显微镜
避免油镜观察时，会引起标本的移动
共聚焦成像对标本的基本要求
肉眼能看到荧光信号 必须先用宽场荧光观察确认标本
共聚焦利用针孔阻挡非焦平面荧光信号 ，意味着其实际检测的焦平面荧光信号 比传统宽场荧光显微镜更少
激光扫描共聚焦显微镜使用技巧
奥林巴斯（中国）有限公司
样品：拟南芥气孔 技术：共聚焦显微镜
剑桥大学植物科学系 英国剑桥 样品：拟南芥芽胚 技术：共聚焦显微镜
爱沙尼亚共和国塔林 样品：燕麦表皮细胞，表皮和叶肉组织 技术：共聚焦显微镜，自发荧光
美国马萨诸塞坎布里奇 样品：斑马鱼尾部感觉神经轴突 技术：共聚焦显微镜
64X64 128X128 512X512 640X640 800X800 1024X1024 2048X2048 4096X4096
推 荐 值
图像放大（ZOOM）
优先考虑使用高倍物镜
推荐值： 不高于4-6X
ZOOM: 1X
ZOOM: 4X
ZOOM: 10X
降低图像噪音
推荐值：Kalman打开 模 式 ： Line( 静 态 可 使 用 Frame) 数值：2、3
图像调节(显示反差需要，如比较强度实验，不建议使用）
调节图像灰度值、背景和颜色
图像调节
原始图像
图像调节之增强显示
增强图像信号
图像调节之扣除背景
扣除背景
采集参数一键调取
需要调回的参数: 扫描速度 扫描分辨率 激光强度 检测器HV 针孔大小 。。。。。。。 OIB/OIF文件记录所有参数
Effect of Pinhole
转共聚焦模式，如不好寻找标本，将针孔模式专为手动，针孔 调至300以上，找到 标本后，再考虑使用AUTO模式
正确使用物镜
正确使用物镜
物镜—是显微镜的核心
光学分辨率由物镜决定 光学分辨率 D= 0.5 *λ / NA NA为物镜数值孔径
获取亚细胞或大分子图像必须使用高NA物镜
推荐：一直保持按下状态
多标选择序列扫描和染料最适带宽问 题,避免窜扰和自发荧光
扫描分辨率
扫描分辨率不是光学分辨率！！
光学分辨率未能区分出的细节，扫描分辨率 再高也是重复扫描。没有实际意义！
扫描分辨率
常用扫描分辨率选择：
光学分辨率未能区分出的细节， 扫描分辨率再高也是重复扫描。 没有实际意义！ 以NA值1.4的60X油镜为例 最佳扫描分辨率为2048X2048即可
以灰度显示 判断背景是否扣除 以及信号是否过曝
激光强度
用尽量低的激光成像，避 免光毒性和光漂白（两个 不同概念），但不可教条 ，具体情况具体分析
扫描速度
扫描速度与图像质量成反比！! 根据实验的需要： 如要高质量图像，适当放慢扫描速度 如要快速成像，适当牺牲图像质量
1S/Frame
2S/Frame
调节方法： 先调焦，再调校正环。
使用技巧
预览—快速找到标本
推荐值： Focus x 2或Focus x 4
选择降低扫描分辨率（512X512）
有利于快速调整焦平面，迅速找到标本 尽量避免激光毒性对标本的漂白
预览—快速找到标本
开大针孔
提高PMT HV值
适当增强激光强度
快速操作： 鼠标单击、滚轮滚动和直接输入数据
丹佛士植物科学中心显微镜设备所 美国密苏里州圣路易斯市 样品：矮牵牛花 技术：共聚焦显微镜
意大利罗扎诺 样品：血液与淋巴脉管系统成像 技术：共聚焦显微镜
罗切斯特大学医学中心神经发育与疾病中心 美国纽约罗切斯特 样品：小鼠皮层与皮质血管中的小神经胶质细胞 技术：双光子显微镜
伦敦学院大学医学研究中心实验室分子细胞生物学 英国伦敦 样品：小鼠橄榄体小脑系统轴突连接 技术：共聚焦显微镜
UPLANSAPO 4X N.A 0.16
UPLANSAPO 10X N.A 0.4
UPLANSAPO 20X N.A 0.6
UPLANSAPO 40X N.A 0.9
一旦采用油镜观察， 不能再直接切换到低倍 因为会污染低倍物镜
正确使用物镜
校正环的使用(校正球差）
调节条件： 1.盖片或者培养皿底部厚度不 标准时 2.需要看细胞或组织深层时