骨髓间质干细胞分离培养的经验总结
小鼠骨髓间充质干细胞分离培养新方法
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是骨髓中除造血干细胞外另一重要的干细胞。
MSC 具有自我更新、多向分化、免疫调控和支持造血的能力，而且来源广泛，容易在体外培养和扩增，目前已经应用于临床并显示了良好的治疗效果。
虽然MSC临床应用广泛，但许多关键问题如免疫调控的具体机制等并未解决。
小鼠是重要的实验动物之一，广泛用于基础实验研究。
在体外成功分离培养MSC，并得到大量纯化的MSC是研究其分化及功能调控机制的前提。
目前分离小鼠骨髓MSC的方法包括全骨髓贴壁法、骨片消化法、流式或磁珠分选法等。
然而全骨髓贴壁法获得的细胞往往含有不少造血细胞；骨片消化法需要进行胶原酶消化，步骤多且消化时问不好控制；流式或磁珠法虽然获得细胞较纯，但程序复杂，花费高且获得的细胞相对少。
骨髓MSC的分离目前常用的方法有全骨髓贴壁法、骨片消化法和流式细胞术或磁珠分选法。
全骨髓贴壁法即根据MSC的贴壁性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。
然而该方法获得的MSC往往含有较多基质细胞和造血细胞污染。
我们的结果也显示，全骨髓贴壁法原代培养的细胞有75％为CD45阳性的细胞，传至第3代，MSC中仍有5％的CD45阳性细胞，即造血细胞。
骨片消化法，是先将骨髓冲干净，将股骨和胫骨剪碎，然后进行胶原酶消化。
虽然该方法获的MSC纯度较高，但是程序复杂，且不同鼠龄骨片胶原酶消化时间不同，不容易掌握。
随着对MSC表面抗原认识的深入，有研究者利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法对其进行分离纯化旧191；虽然这些方法可以得到纯度较高的细胞，但分离过程对细胞的活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性；而且实验条件要求高，需要骨髓量大，加之耗费较大和技术难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。
本研究采用骨髓加骨片法分离小鼠MSC，即将股骨和胫骨肌肉去干净后，不需冲骨髓，不需消。
骨髓细胞进修个人总结
骨髓细胞进修个人总结
骨髓细胞进修个人总结
在骨髓细胞进修期间，我有幸获得了深入的专业知识和实践经验。
在这个过程中，我
对骨髓细胞的结构、功能和相关疾病有了更全面的了解。
以下是我的个人总结和收获：
1. 知识储备：通过参加课程和独立学习，我对骨髓细胞的形态学、生理学和分子遗传
学有了扎实的基础知识。
我学习了骨髓细胞的分化、增殖和调控机制，以及与血液系
统疾病相关的分子改变。
2. 实验技能：在实验室实践中，我学会了使用各种技术和仪器，包括流式细胞术、细
胞培养和PCR。
通过这些实验技能的习得，我能够进行细胞分离、鉴定和功能研究，
进一步加深了对骨髓细胞的理解。
3. 科研经验：在导师的指导下，我参与了一项关于骨髓细胞的研究项目。
通过实验设计、数据采集和结果分析，我学会了科学研究的方法和思维。
这个经验不仅锻炼了我
的实验技能，还培养了我解决问题和团队合作的能力。
4. 学术交流：在骨髓细胞进修期间，我参加了多个学术会议和研讨会，与其他专业人
士进行了交流和讨论。
这些学术交流不仅让我了解到最新的研究动态，还让我有机会
向其他人展示我的研究成果，获得反馈和建议。
总的来说，骨髓细胞进修经历是我成长和发展的宝贵机会。
通过这段时间的学习和实践，我对骨髓细胞的认识更加深入，实验技能和科研经验也得到了提升。
我相信这些
收获将对我的未来学术和职业发展产生积极的影响。
骨髓间充质干细胞总结
2003年8月，为给大家提供一个网上交流干细胞研究经验的平台，我们干细胞版设立了骨髓间充质干细胞培养讨论区，经过近三个月的讨论学习，我们既学习丰富了自己的知识体系，也对间充质干细胞尤其是分离培养方面有了更为翔实的认识，为了大家阅读的方便，我们决定把本版中的相关内容，同时参考部分书目和文献，做一总结。
一、骨髓间充质干细胞的分离目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。
密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。
随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。
1. 直接培养法（全骨髓培养法）1987年，Friedenstein等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞扩增2 0-30代后仍能保持其多向分化潜能，这类细胞即为骨髓间充质干细胞（BMSC），其工作对今后MSC的研究具有重要意义，不仅证实了骨髓MSC的存在，而且创建了一种体外分离和培养MSC的简便可行的方法，得到了广泛的应用。
culture-spirit采用直接贴壁法，24-36小时首次换液，换液时用PBS洗两次，7 -10天传第一代，以后2-3天传代。
培养基采用Hyclone的DMEM/F-12（1:1），血清是天津TBD的FBS（顶级），得到了较好的培养结果。
布兰卡根据自己培养大鼠MSC的经验，详细介绍了实验步骤：（1）接种后60-80分钟，换液去除悬浮细胞（2）原代培养24h,48h各换液一次（3）观察细胞情况，在原代培养7天左右时，如观察到成片的典型形态的细胞，在瓶底用Marker笔标记，0.25%胰酶消化，镜下观察控制，约5-10分钟（室温太低时应放置到孵箱中），加入全培养基终止消化，瓶体朝上，吸管轻轻吹打4-8分钟，尤其是标记部位。
BMSCs成脂成骨分化实验总结
骨髓间充质干细胞（BMSCs）培养以及成脂、成骨诱导分化一，C57小鼠BMSCs原代培养1，实验前准备好相关手术器械，培养器材及相关试剂PBS 平衡缓冲液、10％FBS，IMDM培养基。
2，脱颈法处死C57小鼠，在75％乙醇中浸泡5min，转移至超净工作台中，无菌条件下分离出小鼠的长骨(股骨和胫骨)，浸泡于PBS溶液中。
3，对股骨和胫骨进行深层次解剖，去除附着的肌肉组织，剪掉长骨两端的干骺端，用10％FBS，IMDM培养基反复冲洗骨髓腔，直至骨髓腔发白，收集洗涤液，用移液枪轻轻吹散分离为单个细胞。
4，细胞接种于六孔板中培养，轻微摇匀，使细胞在孔中均匀分布，放置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养，培养期间不要移动六孔板，使BMSCs充分贴壁。
5，培养48h后换液，用预热的PBS缓冲液轻轻洗涤细胞2次，添加新鲜培养基，之后每隔48h换液1次。
原代培养6-7d 后细胞铺满80％(图1)，可进行传代培养。
图1：BMSCs原代培养6-7d二，BMSCs成脂诱导分化BMSCs铺皿，细胞融合达80％以上后，弃去原培养基，添加成脂诱导培养基(IMDM中加入10%FBS，10μg/ml胰岛素，1μM 地塞米松，0.5mMIBMX，0.1mM吲哚美辛)。
3d换液1次，分化12d。
待脂滴形成后进行油红O染色，PBS缓冲液清洗3次，10％中性甲醛固定20min，再用PBS缓冲液清洗2次，油红O染液浸染30min，PBS缓冲液清洗2次，苏木素染液浸染1min，弃去染液，倒置显微镜下观察拍照。
成脂诱导分化过程中发现在诱导5d时，细胞形态开始变圆并大量脱落，部分细胞中出现细小脂滴(图2)。
图2：BMSCs成脂诱导5d三，BMSCs成骨诱导分化BMSCs铺皿，细胞融合达80％以上后，弃去原培养基，添加成骨诱导培养基(IMDM中加入10%FBS,5μg/ml胰岛素，0.1μM 地塞米松，0.2mM维生素C和10mMβ-甘油磷酸盐)。
干细胞治疗个人工作总结
时光荏苒，转眼间我在干细胞治疗领域的工作已过去一年。
在这一年的时间里，我在领导和同事的关心与帮助下，逐渐熟悉了干细胞治疗的相关知识，并在实践中不断提升自己的专业能力。
以下是我对过去一年的工作总结：一、积极学习，提升专业素养自加入干细胞治疗团队以来，我深知自己肩负的责任和使命。
为了更好地服务于患者，我积极参加各类培训和学习，努力提升自己的专业素养。
通过阅读专业书籍、参加学术会议、与专家交流等方式，我对干细胞治疗的理论基础、技术操作、临床应用等方面有了更深入的了解。
二、严谨态度，确保治疗安全在临床工作中，我始终保持严谨的工作态度，严格遵守操作规程，确保治疗过程的安全。
具体表现在以下几个方面：1. 严格筛选患者：根据患者的病情、年龄、病史等因素，选择合适的干细胞治疗方案，确保患者能够从中受益。
2. 严格操作规范：在采集、制备、输注干细胞的过程中，严格按照无菌操作规程进行，降低感染风险。
3. 密切关注患者：治疗过程中，密切关注患者的病情变化，及时发现并处理可能出现的并发症。
三、团结协作，共同进步在团队中，我注重与同事的沟通与协作，共同推进干细胞治疗技术的发展。
具体表现在：1. 积极分享经验：在遇到技术难题时，与同事共同探讨，分享经验，共同提高。
2. 参与科研项目：积极参与科研项目，为团队的发展贡献自己的力量。
3. 帮助新同事：关心新同事的成长，耐心解答他们在工作中遇到的问题，共同进步。
四、展望未来，继续努力过去的一年，我在干细胞治疗领域取得了一定的成绩，但深知自己还有许多不足之处。
在今后的工作中，我将继续努力，不断提高自己的专业水平，为患者提供更加优质的医疗服务。
1. 深入研究干细胞治疗技术，紧跟国际前沿动态，为我国干细胞治疗事业贡献力量。
2. 加强与国内外专家的交流与合作，学习先进经验，提高自己的临床治疗水平。
3. 积极参与科研项目，为团队的发展和创新提供支持。
总之，过去的一年是我职业生涯中宝贵的一段经历。
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，广泛应用于组织工程、再生医学等领域。
原代骨髓间充质干细胞的分离和提取是进行相关研究的基础。
本文将详细介绍原代骨髓间充质干细胞的分离及提取方法。
一、实验材料1.骨髓样本：取自健康志愿者或实验动物（如大鼠、小鼠等）。
2.PBS缓冲液：磷酸盐缓冲液，用于细胞洗涤和分离。
3.胎牛血清：用于细胞培养。
4.抗生素：如青霉素和链霉素，用于细胞培养液中，防止细菌感染。
5.细胞分离液：如Ficoll分离液、Percoll分离液等。
6.细胞培养瓶、离心管、移液器等实验室常用器材。
二、分离方法1.骨髓样本采集：在无菌条件下，从志愿者或实验动物体内抽取骨髓，置于含有抗凝剂的离心管中。
2.骨髓细胞分离：将骨髓样本用PBS缓冲液稀释，然后缓慢加入细胞分离液，进行密度梯度离心。
离心后，收集界面层的细胞，即含有骨髓间充质干细胞的一层。
3.细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞，去除残留的分离液和红细胞。
4.细胞计数：用细胞计数板对洗涤后的细胞进行计数，调整细胞浓度为合适的值。
5.细胞接种：将细胞接种于含有胎牛血清和抗生素的细胞培养液中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。
三、提取方法1.原代培养：将分离得到的骨髓间充质干细胞进行原代培养，待细胞生长至80%-90%汇合时，进行传代。
2.传代培养：将原代细胞用胰蛋白酶消化，然后按照1:2或1:3的比例进行传代。
传代后的细胞继续培养至所需细胞量。
3.细胞冻存：将提取得到的骨髓间充质干细胞进行冻存，以备后续实验使用。
4.细胞复苏：将冻存的细胞在37℃水浴中快速融化，然后用细胞培养液重悬，继续培养。
四、注意事项1.在实验过程中，严格遵循无菌操作原则，防止细胞污染。
2.骨髓样本的采集和处理应在抗凝条件下进行，以保持细胞活性。
3.选择合适的细胞分离液和离心条件，以提高骨髓间充质干细胞的分离纯度。
干细胞个人工作总结
干细胞个人工作总结
干细胞研究是当今医学领域备受瞩目的研究方向之一。
在过去的几十年里，科学家们不断努力探索干细胞的潜力，希望能够利用其特殊的生物学特性来治疗各种疾病。
作为一名从事干细胞研究的科学家，我也在这个领域做出了一些个人的工作总结。
首先，我在干细胞的分离和培养方面取得了一些进展。
干细胞的分离是研究的第一步，我通过改进传统的分离方法，成功地提高了分离效率，并且减少了对干细胞的损伤。
在干细胞培养方面，我也进行了一些创新，成功地建立了一种更为稳定和高效的培养系统，为后续的实验提供了可靠的基础。
其次，我在干细胞的分化和应用方面也取得了一些成果。
干细胞具有多能性，可以分化成各种不同类型的细胞，因此在再生医学和组织工程方面有着广阔的应用前景。
我通过研究不同的分化因子和培养条件，成功地诱导干细胞分化成特定的细胞类型，为相关疾病的治疗奠定了基础。
最后，我还在干细胞的基因编辑和转基因方面进行了一些探索。
基因编辑技术的发展为干细胞研究提供了新的思路和方法，我利用CRISPR/Cas9等技术成功地对干细胞进行了基因编辑，使其具有特定的功能或特性，为相关疾病的治疗提供了新的途径。
总的来说，干细胞研究是一项具有挑战性和前景广阔的工作，我在这个领域取得了一些成果，但也意识到还有许多问题和挑战需要解决。
未来，我将继续努力，希望能够为干细胞研究和医学治疗做出更多的贡献。
骨髓间充质干细胞培养方法大全
一、四种方法简介及优缺点：骨髓间充质干细胞主要有4种体外分离方法：贴壁筛选法，密度梯度离心法，流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法。
贴壁筛选法是利用细胞贴壁时间及贴壁牢固性的不同逐步将非贴壁细胞和其它杂质细胞去除的一种简单易行的培养MSCS的方法。
贴壁分离培养法分离的MSCS能在体外培养条件下生长良好、可连续传代，体外培养扩增能力较强，其缺点是细胞纯度较低。
此方法简便，冲出骨髓直接培养，然后利用骨髓MSCS 贴壁生长特性，更换培养液逐步去处漂浮生长的造血系细胞即可获得较纯化的MSCS；而且骨髓中的造血干细胞能分泌生长因子和促贴壁物质，可促进MSCS 贴壁生长，因此全骨髓贴壁法更为可取。
密度梯度离心法梯度离心法的核心主要是基于密度梯度离心技术。
梯度离心法是根据骨髓中细胞成分的比重不同，使用淋巴细胞分离液提取单个核细胞，再进行贴壁培养，从而达到分离、纯化MSCS的目的。
Pittenger等的研究发现通过密度梯度离心分离培养的间充质干细胞在第一代时纯度可以达到95%。
常用的分离方法免疫磁珠法，是利用免疫学的技术分离MSCS，分离细胞的纯度高。
Phinney 用一种免疫耗损技术精确地将造血细胞系和内皮细胞系从基质细胞中分离出来，提供了一种能高效的分离纯化间充质干细胞的方法，但目前仍未筛选到真正特异性的细胞表面标记;而且，这两种分离方法的操作对细胞活性都有较大影响，造成MSCS损伤，出现增殖缓慢等问题，这些技术问题很大程度上限制了这两种方法的应用。
因此，如何能简便高效地获得均质性的间充质干细胞和细胞群仍需要继续探索。
分离细疫磁珠分离和流式细胞仪筛选的方法，不仅对细胞活性影响较大，而且操作复杂，价格昂贵。
然而，这些纯化间充质干细胞的方法比较复杂，一般仅限于在各自的实验室应用。
二、具体实验流程1. 免疫磁珠法分离纯化骨髓间充质干细胞：1 实验动物Sd大鼠2 试剂和仪器BSA、荧光标记小鼠抗体x、PE磁珠试剂盒、抗生物素磁珠、MiniMACS分离器及MS分离柱。
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骨髓间充质干细胞经验总结
2003年8月，为给大家提供一个网上交流干细胞研究经验的平台，我们干细胞版设立了骨髓间充质干细胞培养讨论区，经过近三个月的讨论学习，我们既学习丰富了自己的知识体系，也对间充质干细胞尤其是分离培养方面有了更为翔实的认识，为了大家阅读的方便，我们决定把本版中的相关内容，同时参考部分书目和文献，做一总结。
一、骨髓间充质干细胞的分离
目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。
密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。
随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。
1．直接培养法（全骨髓培养法）
1987年，Friedenstein等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞扩增20－30代后仍能保持其多向分化潜能，这类细胞即为骨髓间充质干细胞（BMSC），其工作对今后MSC 的研究具有重要意义，不仅证实了骨髓MSC的存在，而且创建了一种体外分离和培养MSC 的简便可行的方法，得到了广泛的应用。
culture-spirit采用直接贴壁法，24-36小时首次换液，换液时用PBS洗两次，7-10天传第一代，以后2-3天传代。
培养基采用Hyclone的DMEM/F-12（1：1），血清是天津TBD的FBS（顶级），得到了较好的培养结果。
布兰卡根据自己培养大鼠MSC的经验，详细介绍了实验步骤：
（1）接种后60-80分钟,换液去除悬浮细胞
（2）原代培养24h,48h各换液一次
（3）观察细胞情况，在原代培养7天左右时，如观察到成片的典型形态的细胞，在瓶底用Marker笔标记，0.25%胰酶消化，镜下观察控制，约5-10分钟（室温太低时应放置到孵箱中），加入全培养基终止消化，瓶体朝上，吸管轻轻吹打4-8分钟，尤其是标记部位。
不要用力吹打，以免把贴壁较牢的成纤维细胞，上皮样细胞吹打下来
（4）传代到新瓶中，加入少量培养基，孵箱静置20-30分钟后，MSC大多牢固贴壁。
瓶底朝上，轻轻吹打，丢弃悬浮以及贴壁不牢的细胞（大多是上皮样细胞），加入全培养基开始传代培养，如观察仍有较多杂细胞，可重复上述步骤。
（5）经上述处理后，原代的那瓶细胞仍有一些MSC生长，可继续按原代培养，如观察到MSC的克隆，仍可按上述步骤纯化处理。
（6）原代或传代的细胞如观察的少量成片的杂细胞，可直接镜下瓶底标记后，超净台里用长吸管尖端机械刮除，吸出去掉。
菊花与刀用的是全骨髓培养法，直接用含10%的FBS培养基冲洗大鼠的股骨和胫骨，为了避免冲起许多气泡应缓慢冲，冲的次数不应太多。
冲洗后不用离心直接接种在培养瓶里，48h~72h后首次换液，一般7~10天可传代。
天之饺子介绍的小鼠MSC的分离方法：取6w小鼠的股骨和胫骨，直接用含培养基冲出骨髓，一定要尽量把干垢端的骨髓冲干净。
冲洗后不离心直接接种在培养瓶里，24－48h后去悬浮，再接下来的每3－4天换液一次，直到需要传代。
2. 密度梯度离心法
裴雪涛等用比重为1.073g/ml的percoll分离（400g×20min）人骨髓MSCs，取界面处细
胞层，离心后洗涤以2×105/cm2的密度接种，72h后更换培养液，弃掉未贴壁细胞，以后每3d换液一次。
细胞长到80％汇合时1：1传代。
菊花与刀利用PERCOLL密度1.073分离大鼠MSC 时，用2400rpm×20mins后可见中间有一层约1～2mm厚的白色层，仔细用吸管吸取这一层再用PBS离心2遍即可加培养基和胎牛血清培养即rMSCs，。
周进明等利用密度为1.082的percoll分离小鼠MSCs，500g×30min离心后，取中间的单个核细胞层，PBS洗两次，接种于IMDM培养基，1d后换液，去掉非贴壁细胞，以后每3-4天换液。
jetter用过FICOLL,FERCOLL,上海二分厂的淋巴细胞分离液分离MSC细胞效果都不错，当然所获细胞群的纯度不一，Percoll最纯，而上海二分厂的淋巴细胞分离液所获细胞群的传代能力优秀（35 PASSAGE）。
本版的部分园友认为MSC贴壁培养得到的细胞不均一，但是多能分化能力和增殖力好，percoll分离得到的细胞较为均一，多能分化性和增殖力不如贴壁培养的，尤其是增殖力相差很远，有人添加bFGF或/和表皮生长因子发现可以增强增殖能力。
二、骨髓间充质干细胞的培养
天之饺子认为，间质干细胞的培养一定要用塑料培养瓶，不能用玻璃的。
因为象间质干这类的基质细胞不易贴玻璃，而且现在买的进口好品牌的培养瓶都涂有一层促细胞贴壁的物质，多数园友培养时都添加10－15％胎牛血清。
分离培养结果的差异可能是由于各个研究小组标本来源、采用的分离方法不同从而所获得的细胞不同，或者用来检测的细胞代数不同，或者培养过程中用的胎牛血清不同，导致MSCs获得或失去这些表面标记物的表达。
三、骨髓间充质干细胞的特性
体外培养的MSC体积小，成梭形，核浆比大。
不表达分化相关的细胞标志，如I、II、III型胶原、碱性磷酸酶或Osteopontin；也不表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124、CD166和多种表面蛋白，这群细胞特性稳定，扩增一代和两代后的细胞同质性分别达到95％和98％。
MSC联系传代培养和冷冻保存后仍能具有多向分化潜能，而且保持正常的核型核端粒酶活性，但不易自发分化，在体外特定的诱导条件下，MSC可以分化为骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉、神经等多种细胞。
四、其他相关内容
Jiang将从成人以及成年大鼠和小鼠骨髓分离的间充质干细胞（CD45－TER119－）命名为多潜能成年祖细胞，他们证明，MAPC高表达端粒酶，而且随着细胞的扩增，端粒的长度不变，单个MAPC来源的细胞群不仅能在体外向3个胚层的细胞分化，而且能在体内能够向各种组织细胞分化，相比较而言，形态与MSC相似的体外培养的皮肤成纤维细胞则不具有类似的分化潜能。
参考文献
生理学报2003.55（2）：153－159
人骨髓间充质干细胞在成年大鼠脑内的迁移及分化
中华放射医学与防护杂志.2002,22(3).-167-169
培养小鼠骨髓间充质干细胞及其移植后在体内的定位分布
Exp Biol Med Vol. 226(6):507–520, 2001
Mesenchymal Stem Cells
NA TURE |VOL 418 | 4 JULY 2002
Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow。