深黄被孢霉突变株A35

深黄被孢霉突变株A35摘要：以深黄被孢霉（mortierella isabellina）突变株a35-4为材料，通过单因素试验及正交试验探讨了发酵条件对a35-4产多不饱和脂肪酸的影响。

结果表明，突变株a35-4的最佳发酵培养基配方为60 g/l果糖、3 g/l牛肉膏、3 g/l磷酸二氢钾、0.6 g/l mgso4、2.0 g/l柠檬酸钠、1.0 g/l菜子油，初始ph 6.0，先28 ℃培养4 d，然后20 ℃培养3 d。

关键词：深黄被孢霉（mortierella isabellina）；多不饱和脂肪酸；优化；发酵中图分类号：q815 文献标识码：a 文章编号：0439-8114（2013）08-1920-04多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，pufas）及其衍生物在大脑发育、过敏反应及心血管运动等一系列生理功能中发挥重要作用，具有维护生物膜的结构和功能、治疗心血管疾病、抗炎、抗癌、促进大脑发育、减肥以及增加动物的产仔率和成活率等生理功能[1-7]。

随着人类生活水平的提高，运动量的减少，pufas 对人类的健康就显得越来越重要。

长期以来人们都是从动植物油脂中提取pufas，但动植物的生长受到季节、地理位置等的影响而使pufas含量变动较大，提取成本高，周期长，不能适应市场的需要，且动植物油脂资源含油量及不饱和脂肪酸类型、比例均受到一定的限制。

因此，近年来人们一直在探索利用诱变育种等技术，对现有产pufas菌株进行改造，进一步提高pufas的含量。

开发微生物pufas 可以部分或完全取代动物、植物中的 pufas，有着广阔的市场前景[8，9]。

袁成凌等[6]采用不同诱变方法对高山被孢霉（mortierella alpina）进行诱变育种，获得多株花生四烯酸（arachidonic acid，ara）高产菌株，ara 产量最高达到7.43 g/l，王啸等[10]对深黄被孢霉（as3.2793）进行复合诱变获得突变株mui0310，ara 产量为 0.73 g/l。

目前产 pufas 的出发菌株多为被孢霉属真菌，但由于野生菌株产pufas的能力很低，因此急需利用诱变育种等方法培育出高产菌株[11，12]。

在前期研究中，以深黄被孢霉as3.3410为出发菌株，利用微波诱变和紫外诱变，乙酰水杨酸与低温（15 ℃）相结合的筛选方法，获得1株高产多不饱和脂肪酸菌株a35-4[13]，其生物量为17.9 g/l，油脂含量为67.8%，油脂产量为12.12 g/l，pufas含量为20.3%，pufas产量为2.46 g/l，连续斜面传代培养证实该菌株具有较好的遗传稳定性。

本研究探讨了深黄被孢霉突变株a35-4的发酵条件，对其培养基组成和培养条件进行了优化，得到深黄被孢霉突变株a35-4发酵的最佳培养基组成和合适的产脂条件，为工业化生产打下基础。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种深黄被孢霉突变株 a35-4由购自中国科学院微生物研究所的深黄被孢霉as3.3410诱变筛选得到。

1.1.2 培养基斜面培养基为 pda 培养基（土豆琼脂培养基）：200.0 g/l马铃薯，20.0 g/l葡萄糖，20.0 g/l琼脂，于1×105pa 灭菌20 min。

种子培养基：100.0 g/l葡萄糖，1.0 g/l磷酸二氢钾，0.3 g/l硫酸镁，2.0 g/l酵母膏，2.0 g/l硫酸铵，ph 6.1，于1×105 pa灭菌20 min。

1.2 方法1.2.1 培养方法摇瓶种子培养：取活化7 d的pda菌种斜面，用5 ml无菌水洗下孢子，倒入装有50 ml摇瓶种子培养基的150 ml 三角瓶中，于28 ℃以180 r/min振荡培养48 h。

摇瓶产脂培养：取培养48 h的摇瓶种子培养液2 ml接入装有 100 ml产脂培养基的 250 ml三角瓶中，于28 ℃以180 r/min振荡培养7 d。

1.2.2 分析方法油脂含量定量分析：索氏抽提法[14]。

气相色谱分析： pufas含量的气相色谱测定委托中国农业科学院油料作物研究所测试中心完成。

1.2.3 单因素试验①温度对突变株发酵的影响。

在不同温度（5、10、15、20、25、30、35 ℃）条件下探讨发酵温度对突变株生产和产脂的影响。

菌株固定接种量为2%，以180 r/min振荡培养7 d 后收集菌体并测量生物量和油脂含量。

②碳源对突变株发酵的影响。

在基本产脂培养基中分别添加浓度均为100 g/l的葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖和乳糖，配制成含不同碳源的产脂培养基。

菌株固定接种量为2%、以180 r/min振荡培养7 d后收集菌体并测量生物量和油脂含量。

③氮源对突变株发酵的影响。

在基本产脂培养基中分别添加浓度均为3 g/l的酵母膏、硫酸铵、硝酸铵、牛肉膏、蛋白胨和尿素，配制成含不同氮源的产脂培养基。

菌株固定接种量为2%，以180 r/min振荡培养7 d后收集菌体并测量生物量和油脂含量。

④金属离子对突变株发酵的影响。

在基本产脂培养基中分别添加浓度均为0.5 g/l的na2so4、feso4、mgso4、znso4和ti（so4）2，配制含不同金属离子的产脂培养基。

菌株固定接种量为2%，以180 r/min振荡培养7 d后收集菌体并测量生物量和油脂含量。

⑤添加植物油对突变株发酵的影响。

在基本产脂培养基中添加体积分数均为0.1%的橄榄油、大豆油、芝麻油、花生油和菜子油，配制成含植物油的产脂培养基。

菌株固定接种量为2%，以180 r/min振荡培养7 d后收集菌体并测量生物量和油脂含量。

1.2.4 正交试验以基本产脂培养基+2.0 g/l柠檬酸钠+1.0 g/l 菜子油为基本培养基，添加不同浓度的果糖、牛肉膏、磷酸二氢钾和mgso4，初始ph 6.0，菌株接种量为2%，先于28 ℃培养4 d，然后于20 ℃培养3 d，接下来收集菌体并测量pufas含量，计算pufas产量。

采用四因素三水平的正交试验l9（34）优化深黄被孢霉突变株的产脂培养基配方。

试验的因素与水平见表1。

2 结果与分析2.1 温度对突变株发酵的影响由图1可知，菌丝生长和油脂合成的最适温度不一致，在10 ℃时由于温度过低，突变株菌丝几乎停止生长，25～30 ℃的温度适合于菌丝生长，菌丝大量繁殖。

15～20 ℃适合于油脂积累，因此在试验中采取先在28 ℃使其菌丝增殖，再降低培养温度至20 ℃，使其积累油脂。

2.2 碳源对突变株发酵的影响由表2可知，以果糖为碳源时，生物量和油脂含量均较大，说明果糖是突变株a35-4合成油脂的较好碳源。

2.3 氮源对突变株发酵的影响由表3可知，酵母膏和牛肉膏较适合菌体生长，蛋白胨和牛肉膏较有利于油脂合成，综合考虑各氮源对油脂产量的影响，确定牛肉膏为a35-4生长和产油脂的合适氮源。

2.4 金属离子对突变株发酵的影响由表4可知，添加feso4时油脂产量最高，但各处理间油脂产量没有显著差异。

2.5 添加植物油对突变株发酵的影响shinmen等[15]研究发现，在培养基中添加植物油对微生物积累油脂有促进作用。

由表5可知，在基础产脂培养基中分别添加花生油、菜子油、大豆油、芝麻油和橄榄油，都能不同程度地促进菌丝体的生长及菌丝体中油脂的积累，其中菜子油效果最好，生物量提高了30.31%，油脂含量提高了16.04%，这可能是因为植物油中都含有丰富的油酸和亚油酸，这些脂肪酸既可作为碳源又可作为合成pufas等的前体物被利用。

2.6 果糖、牛肉膏、mgso4、磷酸二氢钾浓度对发酵产pufas的影响由表6可知，基本产脂培养基中添加果糖、牛肉膏、磷酸二氢钾、mgso4的最佳组合为a1b2c3d3，即60 g/l果糖、3 g/l牛肉膏、3 g/l 磷酸二氢钾和0.6 g/l mgso4。

在基本培养基+60 g/l果糖+3 g/l 牛肉膏+3 g/l磷酸二氢钾+0.6 g/l mgso4+2.0 g/l柠檬酸钠+1.0 g/l菜子油，初始ph 6.0，先28 ℃培养4 d，然后20 ℃培养3 d 的条件下进行验证试验，得到pufas的最高产量达到3.6 g/l。

3 小结与讨论自1988年shimizu等[16]报道高山被孢霉是进行γ-亚麻酸（gla）商业化生产的潜在资源以来，国内外对产gla的微生物进行了大量研究。

为提高gla含量，研究人员主要通过物理或化学手段改变菌株遗传物质，然后进行培养条件的优化。

1996年hiruta 等[17]以拉曼被孢霉为出发菌株，经过亚硝基胍诱变，采用抗低温筛选方法，获得一株突变株，经过培养条件优化后其gla含量高达18.3%。

陈波等[18]以深黄被孢霉为出发菌株，经紫外线诱变，用抗脂肪酸脱氢酶抑制剂抑芽丹的筛选方法，获得深黄被孢霉突变株，其gla含量是出发菌株的1.07倍。

李忠玲等[19]以少根根霉为出发菌株，利用紫外线诱变结合失水苹果酰肼筛选的方法，选育出突变株，摇瓶培养后菌体油脂含量为35.55%，其中gla占油脂的12.5%，比原始菌株油脂含量提高了93.94%，gla含量提高了276.5%。

李丽娜等[20]采用微波诱变并结合乙酰水杨酸对深黄被孢霉进行筛选，获得一株高产菌株，其生物量为30.85 g/l，总油脂含量为15.5 g/l，花生四烯酸（ara）浓度为2.61 g/l，ara产量比原始对照菌株提高3.18倍，并且遗传性能稳定。

在前期试验中，通过诱变结合低温筛选的方法，得到高产菌株a35-4，但其生物量低[13]。

本研究通过单因素试验及正交试验，对突变株a35-4发酵生产pufas的发酵条件进行了优化，确定突变株a35-4最佳产脂培养基组成和发酵条件为：60 g/l果糖、3 g/l 牛肉膏、3 g/l磷酸二氢钾、0.6 g/l mgso4、2.0 g/l柠檬酸钠、1.0 g/l菜子油，初始ph 6.0，先28 ℃培养4 d，然后20 ℃培养3 d。

参考文献：[1] hamazaki-fujita n， hamazaki k，tohno h， et al. polyunsaturated fatty acids and blood circulation in the forebrain during a mental arithmetic task[j]. brain research，2011， 1397：38-45.[2] hardin-fanning f，boissonneault g a， lennie t a. polyunsaturated fatty acids. immunomodulators in older adults [j]. journal of gerontological nursing，2011，37（5）：20-28.[3] erkkil？魧 a，de mello v d，ris？魪rus u，et al. dietary fatty acids and cardiovascular disease：an epidemiological approach[j]. progress in lipid research，2008，47（3）：172-187.[4] 张艳荣，单玉玲，李玉.姬松茸w-6多不饱和脂肪酸对高血脂鼠的降血脂作用[j].吉林大学学报（医学版），2006，32（6）：960-963.[5] bei r，frigiola a，masuelli l，et al. effects of omega-3 polyunsaturated fatty acids on cardiac myocyte protection [j]. frontiers in bioscience-landmark，2011，16：1833-1843. [6] 袁成凌，姚建铭，王纪，等.低能离子注入在花生四烯酸（ara）高产菌株选育中的研究[j].辐射研究与辐射工艺学报，2003， 21（4）：237-242.[7] borsonelo e c，galdur？魷z j c. the role of polyunsaturated fatty acids（pufas） in development， aging and substance abuse disorders： review and propositions[j]. prostaglandins leukotrienes and essential fatty acids，2008，78（4-5）：237-245.[8] karr j e，alexander j e，winningham r g. omega-3 polyunsaturated fatty acids and cognition throughout the lifespan： a review[j]. nutritional neuroscience，2011，14（5）：216-225.[9] cipak a，hasslacher m，tehlivets o，et al. saccharomyces cerevisiae strain expressing a plant fatty acid desaturase produces polyunsaturated fatty acids and is susceptible to oxidative stress induced by lipid peroxidation[j]. free radical biology and medicine，2006，40（5）：897-906.[10] 王啸，邱树毅，叶丹，等.花生四烯酸产生菌的选育[j].贵州工业大学学报，2005，34（1）：56-59.[11] 于长青，李丽娜.紫外线诱变深黄被孢霉选育花生四烯酸高产菌株[j].微生物学通报，2009，36（6）：853-857.[12] botha a，paul i，roux c，et al. an isolation procedure for arachidonic acid producing mortierella species[j]. antonie van leeuwenhoek，1999，75（3）：253-256.[13] 许本波，巴敏，谢伶俐，等.高产 pufas 深黄被孢霉菌株的筛选[j].遗传，2011，33（10）：1147-1152.[14] 王爱国，邵从本，罗广华，等.大豆下胚轴线粒体的衰老与膜脂的过氧化作用[j].植物生理学报，1988，14（3）：269-273.[15] shinmen y，shimizu s，akimoto k，et al. production of arachidonic acid by mortierella fungi[j]. applied microbiology and biotechnology，1989，31（11）：11-16. [16] shimizu s，kawashima h，shinmen y，et al. production of eicosapentaenoic acid by mortierella fungi[j]. j am oil chem soc，1988，65（9）：1455-1459.[17] hiruta o，kamisaka y，yokochl t，et al. γ-linolenic acid production by a low temperature-resistant mutant of mortierella ramanniana[j]. fermentation and bioengineering，1996，82（2）：119-123.[18] 陈波，张玲，贺新生，等.用抗性筛选法选育γ-亚麻酸（gla）高产菌株[j].微生物学通报，2003，30（1）：53-55.[19] 李忠玲，徐霞美，王卫卫，等.少根根霉γ-亚麻酸高产菌株选育[j].食品科技，2008，33（1）：19-21.[20] 李丽娜，汤华成，于长青.深黄被孢霉高产花生四烯酸菌株的微波诱变育种[j].食品与生物技术学报，2009，28（1）：117-121.。