实时荧光定量PCR——TaqMan探针法及设计原则
realtimePCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价
realtimePCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价real time PCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价一、实时荧光Taqman 探针设计总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。
即real-time PCR 的扩增片段是50bp----150bp。
当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。
在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。
但要注意的是：在那条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游引物)。
这样，可保证在将来扩增时，即便没有完全扩增，也有荧光信号报告出来。
两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠。
若在原序列中找不到合适的探针与引物(1主要是探针和上游引物的距离太远，而离下游引物的距离却较近时；2突变位点要求在探针的5’ 端也能检测到荧光信号，但却是在3’端)，可在互补的序列中设计引物与探针。
另real-time PCR中的探针和引物的Tm值，均要高于平常PCR 的引物和杂交的探针的Tm值。
二、探针的设计探针设计的基本原则：1．保守：探针要绝对的保守，有时分型就单独依靠探针来决定。
理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。
若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。
且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。
且最好为A或T，而不能为G或A，因为A、T为双键，而G、A为三键。
2．探针长度Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm 值要比引物的Tm值高出10℃，这样可保证探针在煺火时先于引物与目的片段结合。
因此探针最好是富含GC的保守片段，保证其的Tm值较高。
Taqman探针设计要领
如何设计荧光定量PCR实验方案 如何设计荧光定量PCR实验方案 PCR
根据仪器和个人的喜好，确定荧光定量PCR的方 法，选择荧光素的种类 合成引物和探针 收集样品、提取RNA或DNA（-80℃保存，避免反 复冻融 ） 制备标准品（质粒、化学合成的目的基因）
拷贝数=质量÷分子量×6.0×1023 标准曲线通常由4～5个点组成
定量—— 定量 绝对标准曲 线方法
标准品：纯化的质粒dsDNA，体外转录的RNA 准确配制标准系列并且注意其稳定性，最好 分装后保存于-80℃ 荧光材料：杂交探针、水解探针或SYBR Green I 不可以使用DNA作为标准品对RNA进行定量 应用于定量病毒荷载量等
定量—— 定量 相对 标准曲 线方法 指在测定目的基因的同时测定某一内对照基因，用
配制好的引物和探针，保存于-20℃，注意避光 保存探针 RT反应
如何设计荧光定量PCR实验Байду номын сангаас 如何设计荧光定量PCR实验方 PCR 案
不加探针的常规PCR反应，验证引物是否 合适、模板是否降解、模板纯度是否合适。 同时确定最佳反应体系和反应条件 每次实验都设置阴性对照和标准品，每个 样品设两个平行孔
• 引物和探针的设计原则的重要程度由上 往下越来越低 • 如果是设计SYBR Green I引物，也要选 择TaqMan Primer and Probe design并 遵守这些规则，但是只需要合成引物就 可以了。 • 为了确保引物和探针的特异性，最好将 设计好的序列在 www.ncbi.nlm.nih/blast 中核实一次， 如果发现由非特异性互补区，建议重新 设计引物探针。
一系列已知外参物做标准曲线，根据该标准曲线得 到目的基因和内对照基因的量，再将目的基因的同 内对照基因的比值作为定量的最后结果
实时荧光定量PCR技术
千里之行，始于足下。
Real-time PCR for mRNA quantitation一、原理实时荧光定量PCR技术是通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量PCR产物的目的，目前该技术已在动植物基因工程，微生物和医学领域中得到广泛应用。
实时定量PCR 包括探针法和染料法两种，探针法是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增强，特异性高，如Taq Man TM技术；染料法则是利用染料来指示扩增的增强，特异性相对较低，但简便易行。
染料法的原理是在PCR 反应体系中，参加过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增强与PCR产物的增强彻低同步。
荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA 产量成正比，检测PCR 过程中的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度，从而达到定量目的。
目前染料法实时荧光定量PCR主要使用的是美国Molecular Probes 公司的SYBR Green 1 和SYBR Gold 染料。
二、实验步骤一）、单链cDNA 摸板的合成（参照相关资料）二）、Real-time PCR操作主意(TIANGEN 公司RealMasterMix(SYBR Green) PCR Kit)1、20×SYBR Green solution 在室温下平衡并彻底混匀。
2、将125μL 20×SYBR Green solution 参加至1.0 ml 2.5×ReaMasterMix 中并轻轻混匀。
3、照表1决定多个PCR反应混合物并分装到各个PCR管中。
4、将PCR管放入热循环仪并启动循环程序（表2）。
三、计算在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才干够被检测到。
荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。
在实际操作中普通以前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。
荧光定量PCR中一个关键的数据是“Ct（threshold cycle）值”，其中“t”是Threshold ，即PCR管内荧光超过本底（达到可检测水平）时的临界数值；第 1 页/共 3 页朽木易折，金石可镂。
实时荧光定量PCR方法简介
实时荧光定量PCR方法简介一．实时荧光定量PCR的基本原理理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。
但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。
因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性.如采用常规的终点检测法（利用EB 染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量),即使起始模板量相同经PCR扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。
为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数-—Ct值,定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。
Ct值是如何得到的在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行,定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。
Ct值的定义Ct值中的“C”代表Cycle（循环）,“t”代表检测threshhold(阈值）,其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对应的横坐标。
Ct值与样品中模板的对应关系Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系(y=ax+b,x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。
与终点法相比利用Ct值的优势由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数,该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确,重复性也更好。
传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少,从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。
下图中是96个复孔的实时扩增曲线(完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度)，可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。
定量PCR Taqman探针设计要领-2
定量PCR Taqman探针设计要领-2第三步：寻找一家信赖的公司合成引物和探针，一般引物合成大家比较熟悉，而且价格也比较便宜（特别是这两年便宜了许多），而探针则相对来说贵了许多，一般Taqman探针合成在1000到5000元不等（不同的合成要求价钱不同）——而这只是标记价钱，序列合成基本上和引物合成价钱相似。
第四、五、六步：一般的定量PCR反应体系与普通PCR其实也差不了多少，只是要加入Taqman探针，另外不同就是分步法的不同。
其中需要注意的是：* 扩增酶最好选用热启动酶* 引物和探针的浓度需要进行优化，有人建议从50nM开始，在50nM—900nM之间优化，一般为200nM（注意探针需要避光保存。
* 同样Mg+和酶量也需要进行优化，酶的推荐反应浓度是1.25-1.5U（50ul）* DNA模板的添加量通常在100 ng以下，因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。
如果欲进行2 Ste p RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
另外循环参数虽然在引物和探针设计完之后也就确定了，但是有时也需要进行优化。
第七步：在进行数据分析的时候，通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。
方程式的斜度可以用来检查PCR的效率，对于100%PCR效率来说，一个理想的斜率是3.32。
最佳的标准曲线是建立在PCR的扩增效率为90%-100 %(100%意味着在每个循环之后，模板的总数将增加为前一次的2倍)的基础上。
所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数(R2≥0.99) ，这样才能认为实验的过程和数据是可信的。
使用这个方程式我们可以计算出未知样本的初始模板量。
大多数定量PCR仪都有这样一个软件，它可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。
taqman荧光定量pcr基本原理
taqman荧光定量pcr基本原理
TaqMan荧光定量PCR是指采用荧光标记的PCR技术，它可以实现对特定序列DNA的定量分析，即可以直接测量所检测序列在模板文库中的相对浓度。
TaqMan荧光定量PCR可以说是一种双通道的实时PCR技术，最初由PE Applied Biosystems（PE）推出。
它是通过特定的标记技术，开发了FRET和TaqMan技术，结合PCR技术，以达到定量分析和监测某一特定序列DNA的目的，这种技术比以往的技术有很大的优势，更易于完成。
TaqMan荧光定量PCR的基本原理比较简单，大致可以分为以下四步：
（1）样本处理：检测序列DNA及其作为模板的原始样品将在定量PCR试剂盒中经过一系列处理，得到模板文库。
（2）探针标记：样品处理完成后，将开发出一对对应该特殊序列的5'荧光探针—特殊碱基对相对应的序列和3'分子耦合（MolecularBeacon）。
探针内部具有双螺旋结构，当处于开放状态时，荧光物质才能折射发射自己特有的颜色荧光。
（3）反应物添加：在模板文库中添加进Taq DNA 聚合酶、核酸类型的合成引物，以及缓冲液，用水调节总体浓度。
（4）加热-冷却：完成上述步骤，将反应液放入定量PCR仪，按照一定的条件，经由一系列的加热、冷却过程，Taq DNA聚合酶将碱基对引物合成，产生复制模板文库。
同时在复制过程中，反应液中复制数量也不断增加，一旦达到一定温度，则表明文库复制到足够多，荧光探针能够在反应液中爆炸，产生光谱，得以直接测定检测序列DNA的定量。
此外，TaqMan荧光定量PCR技术能够检测DNA的扩增曲线，并由此提供准确的定量结果，同时也不受PCR技术的一些影响，更易于操作。
realtimePCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价
real-time-PCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：real time PCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价一、实时荧光Taqman 探针设计总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。
即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。
当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。
在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。
但要注意的是：在那条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游引物)。
这样，可保证在将来扩增时，即便没有完全扩增，也有荧光信号报告出来。
两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠。
若在原序列中找不到合适的探针与引物(1主要是探针和上游引物的距离太远，而离下游引物的距离却较近时；2突变位点要求在探针的5’ 端也能检测到荧光信号，但却是在3’端)，可在互补的序列中设计引物与探针。
另real-time PCR中的探针和引物的Tm值，均要高于平常PCR的引物和杂交的探针的Tm值。
二、探针的设计探针设计的基本原则：1．保守：探针要绝对的保守，有时分型就单独依靠探针来决定。
理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。
若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。
且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。
且最好为A或T，而不能为G或A，因为A、T为双键，而G、A为三键。
2．探针长度Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm 值要比引物的Tm值高出10℃，这样可保证探针在煺火时先于引物与目的片段结合。
实时荧光Taqman 探针设计
一、实时荧光Taqman 探针设计总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。
即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。
当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。
在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。
但要注意的是：在那条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游引物)。
这样，可保证在将来扩增时，即便没有完全扩增，也有荧光信号报告出来。
两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠。
若在原序列中找不到合适的探针与引物(1主要是探针和上游引物的距离太远，而离下游引物的距离却较近时；2突变位点要求在探针的5’ 端也能检测到荧光信号，但却是在3’端)，可在互补的序列中设计引物与探针。
另real-time PCR中的探针和引物的Tm值，均要高于平常PCR的引物和杂交的探针的Tm 值。
二、探针的设计探针设计的基本原则：1．保守：探针要绝对的保守，有时分型就单独依靠探针来决定。
理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。
若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。
且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。
且最好为A或T，而不能为G或A，因为A、T为双键，而G、A为三键。
2．探针长度Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出10℃，这样可保证探针在煺火时先于引物与目的片段结合。
因此探针最好是富含GC的保守片段，保证其的Tm值较高。
现在有Taqman MGB探针，在TAMER之后再标记一个MGB，可使探针的Tm值较高,即使探针片段较短，也可达到Taqman探针的Tm值要求(68-70℃)。
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