实验室常用细胞表征及处理方法(实战版)

实验室常用细胞表征及处理方法

一、细胞培养

1.1细胞培养基配方

普通细胞所需要的培养基配方主要为：购买的培养基+10 %血清（小牛或者胎牛）+1%双抗。（常用的双抗及胰酶建议直接购买）

1.2细胞传代

1.2.1洗涤：将培养瓶内的旧培养液吸出，加入2~3ml PBS缓冲液洗涤2-3次，摇晃使其均匀铺满整个平面，清洗细胞，随后吸弃PBS液以除去残留的血清和死细胞。

1.2.2消化：加入适量（盖满细胞层表面即可，25cm2的培养瓶加入0.5-0.6mL 即可，75 cm2加入1.0mL）的0.25%胰蛋白酶液，轻轻摇晃，普通细胞一般需要60s左右，特别难以消化的细胞可以放在37℃孵箱孵育适当的时间，如Hela细胞大约需要30s-40s，翻转培养瓶。然后在倒置相差显微镜下观察细胞消化情况,待细胞开始收缩成圆形、细胞间的连接明显消失，细胞间出现明显的空隙，即可终止消化（若细胞成片收缩，倒去消化液）。若存在细胞团，可以轻轻拍打培养瓶侧壁，尽量消化完全，不然传代后会出现较多的细胞团，再次消化会非常困难。

1.2.3终止消化：在培养瓶中加入1-3ml培养液（胰酶遇血清会终止其活性）以终止消化。用吸管反复吹打洗瓶壁上的细胞，边角部分特别注意多次吹打。可在倒置相差显微镜下观察细胞吹打的程度，（轻轻摇动培养瓶，观察细胞是否完全脱壁），最后形成单细胞悬浮液。

将单细胞悬液移入15ml离心管内,离心1000r×5min,弃去上清液,加入5ml 培养基进行吹打重悬（也可不用离心，直接把单细胞悬液分装于新的培养瓶里，补加适量培养基）。小培养瓶需5ml左右培养基，直径60mm培养皿5-7ml，以上均应视细胞的数目而定，细胞多，可适当加多些培养基）。

1.2.4.传代：取上述步骤所得单细胞悬液，进行细胞悬液计数，然后按所需密度接种到其它培养瓶中。标注上代数、日期及操作人。

注：本实验所需的PBS液、DMEM细胞培养液及0.25%胰蛋白酶液均需37℃预热处理。

1.3细胞冻存

1.3.1消化：若细胞生长状态良好，则在冻存前一天弃去旧培养液，更

换新鲜培养液，并加入适量0.25%胰蛋白酶液，消化细胞。

1.3.

2.计数：加入2~5ml培养基，终止消化。吹打细胞制成单细胞悬液，

利用细胞计数板计数。并将吹打分散的单细胞悬液转移至无菌离心管，离心1000r×5min，弃去上清液。

1.3.3转移：根据细胞计数结果调整加入的培养基体积，使细胞浓度约

为1-2×106/ml，吹打进行细胞重悬。吸取1ml该细胞悬浮液转移至2ml细胞冻存管中，并补加50μl DMSO（终浓度约为5%），并在管上标注细胞株名称、代数、密度、冻存日期、冻存人等信息。

1.3.4冻存盒：将室温放置的冻存盒内内置管架取出，并加入250ml异

丙醇，放回内置管架。冻存盒反复使用5次后更换异丙醇。直接将细胞冻存管放入冻存盒保存于-80℃冰箱。

81孔板：直接使用81孔板进行冻存需要进行梯度降温，即4℃保存1h，转入-20℃保存4h，最后转入-70℃短期冻存或者转移至液氮进行长期冻存。

（在深低温（零下200度）保存细胞的冻存过程中，为防止细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤，有必要使用含有DMSO 冷冻保护剂。DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤。

深低温时二甲基亚砜的细胞毒性受到抑制。但复苏时动作要快，尽快洗掉二甲基亚砜，否则会造成对细胞严重的毒性。二甲基亚砜（DMSO）是目前最好的细胞冻存保护剂，但也是一种细胞毒性很大的化学试验剂。研究结果表明，培养液中DMSO浓度为10%时，细胞生长抑制率近100%；1‰浓度时抑制率为35%，即使是0.04‰的浓度，DMSO对细胞的生长也有不利的影响。）

1.4细胞复苏

1.41.解冻：迅速将保存于液氮或者-80℃的冷冻管取出，投入37~40℃

的温水水浴，充分摇动，使其迅速融化。

1.4.

2.清洗：融化后迅速转移至超净工作台，取离心管并加入3-5ml培

养基，迅速将细胞悬浮液转移至离心管以稀释DMSO的浓度,1000r/min离心

5min，弃去上清液，加入4-5ml培养基（以复苏的细胞数量估计），轻轻吹打悬浮细胞使其分散均匀。

1.4.3.培养：将细胞悬浮液转移至新的培养皿内，置于37℃孵箱内培养。

第二天观察后换液。

二、细胞活性检测

为了能够更好的延续细胞的活性，减少细胞损伤，本研究采用Alamar Blue（AB）试剂进行表征，这种方法的独特优点在表征后的细胞可以继续培养。具体的操作步骤如下：

2.1材料与细胞培养一定时间的时间后，将旧培养基吸去，加入一定量的PBS（配方见附录）清洗2-3次。

2.2将培养基与AB溶液按照10:1（9:1）的比例配置一定体积的工作液。

2.3在实验组，对照组和空白组中加入等量的工作液，然后盖上锡箔纸避光，放入37℃孵箱孵育4个小时。

2.4将孵育后的工作液（200μL）分别加入到96孔板中，使用酶标仪在波长570和600nm 处测试其吸光度值，然后按照相应的公式计算其活性（计算公式建附录）。

2.5将孔板中多余的工作液吸出，然后加入PBS清洗3-5次，然后加入新的培养基继续培养。

三、细胞铺展测试（SEM）

细胞在材料上的铺展情况可以通过SEM进行表征，SEM的样品处理步骤如下：

3.1将细胞与材料共同培养一定时间后，吸取培养基，PBS清洗3次，然后用2.5 % 戊二醛进行固定（配方见附录）。加入的戊二醛盖过材料即可，然后在37℃条件下孵育20-30min。

3.2吸取上步的戊二醛，加入30 %，50 %，70 %，80 %，90 %，100 %的乙醇进行梯度脱水。每次脱水时间间隔15-20 min。

3.3然后将其进行冷冻干燥或者37 ℃条件下缓慢干燥，然后储存在37℃，干燥条件下，进行保存。（电压不宜过高一般为8或者10KV）。

3.4喷金，SEM扫描，常采用×250、×500、×1000倍数进行观察。

四、细胞活死染色

通过荧光显微镜观察细胞的活性和形态也是细胞实验中常见的表征方法，目前常用的荧光染料为Calcein-AM和PI。具体步骤如下：

4.1染色储备液的配置

AM储备液配置：将 1 mg Calcein-AM 粉末加入 1 mL 无水 DMSO 中，配制成 1 mM 的 Calcein-AM储备液，-20℃避光保存；用前溶解，取 10 μL Calcein-AM 储备液至 5 mL PBS 中配置染色液 (Calcein-AM 的终浓度为 2 μM)。

PI储备液配置：用1 ml UP水溶解1 mg PI，制备成1.5 mmol/l的PI储备液 (1 mg PI/1 ml H

O)，-20℃下密闭冷冻保存。染色液终浓度 Calcein-AM: 2

2

μmol/l,，PI: 4 μmol/l（可以分别取10μL AM储备液和15μL PI储备液，然后加入 5ml PBS或者生理盐水。其他等比例计算）

注意：PI致癌，注意防护措施。

4.2染色步骤

4.2.1将各组特定时间节点的细胞用PBS清洗2-3次，加入适量的AM和PI 的混合染色液，在细胞培养箱内避光孵育20-30min。

4.2.2孵育结束后，将染料吸出，用 PBS 清洗染料2-3次，将细胞置于荧光显微镜下观察活死细胞情况。其中，绿色代表活细胞，红色代表死细胞。激发波长：490 nm（具体介绍见附录）。

(小白楼实验室显微镜无需知道波长，钙黄绿素用蓝光激发，PI用绿光激发即可)

5、罗丹明/DAPI细胞形态染色

6、Alamar Blue

6.1检测原理

阿尔玛蓝（Alamar Blue）是一种氧化还原指示剂，能根据代谢活性产生吸亮度变化和荧光信号。这是一种安全无毒的染料，可用于细胞活性和细胞增殖的定量分析以及细胞因子生物测定和体外细胞毒性研究，能有效测定动物、真菌和细菌细胞的天然代谢活性。Alamar Blue在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，反映所研究的细胞或微生物对氧分子的消耗，因而常被用作氧化还原指示剂，以显示被观察细胞和细菌的代谢

活动。这种测定是基于具有代谢活性的细胞将试剂转换成荧光和比色指示剂的能力。在细胞增殖过程中，细胞内NADPH/NADP、FADH/FAD、FMNH/FMN和NADH/NAD 的比值升高，处于还原环境。摄入细胞内的染料被这些代谢中间体及细胞色素类还原后释放到细胞外并溶于培养基中，使培养基从无荧光的靛青蓝变成有荧光的粉红色。受损和无活性细胞具有较低的天然代谢活性，因此对应的信号较低。可以用普通分光光度计或荧光光度计检测，其激发光波长在530-560 nm之间，发射光波长为590 nm。吸光度和荧光强度与活性细胞数成正比。

本品可广泛地用于细胞增殖代谢，药物的细胞毒作用的体外测定以及病原微生物的的快速检测与鉴定。与台盼兰、TTC、MTT、MTS等分析法相比，Alamar Blue 具有更多的优势。Alamar Blue采用单一试剂，可以连续、快速地检测细胞的增生状态。由于Alamar Blue对细胞无毒、无害，不影响细胞的抗体合成与分泌等活性，因此可以对同一批细胞的增生状态进行连续观察和进一步的实验观察，因此有操作简便和几乎不干扰细胞正常代谢的特点。

6.2测试步骤

1、首先将细胞培养用的培养基与Alamar Blue（AB）配置成工作液，其中培养基与AB体积比例10:1。

2、将培养一定时间的细胞中的培养基吸出。

3、将工作液加入各细胞中，工作液浸没材料为准。记得加一个空白对照和阴性对照。

4、加入一定体积的工作液之后，将其用灭菌后的锡箔纸进行包裹避光，然后将其放入孵箱进行孵育4-8小时，或者观察到工作液变为红色。

5、将孵育后的工作液取出，取200微升加入96孔板中；剩余的工作液吸出，用PBS清洗若干次，然后加入新鲜培养基继续培养。

6、把96孔板放在酶标仪中进行检测，分别在波长570和600 nm进行检测。根据检测结果，然后按照如下公式计算细胞的还原率和增值率。

Alamar Blue还原率 (%) = [(E600×OD570) – (E570×OD600)]/[(E570’×OD600’) – (E600’×OD570’)] ×100%

相对增殖率 (%) = 第n天时Alamar Blue还原率 / SA+ MP球1 d时Alamar Blue 还原率×100%

式中 E570—氧化型 Alamar Blue 在 570 nm 波长的消光系数，即 80 586；E600—氧化型 Alamar Blue 在 600 nm 波长的消光系数，即 117 216；

OD570—检测孔在 570 nm 波长的吸光度值；

OD600—检测孔在 600 nm 波长的吸光度值；

E570’—还原型 Alamar Blue 在 570 nm 波长的消光系数，即 155 677；

E600’—还原型 Alamar Blue 在 600 nm 波长的消光系数，即 14 652；

OD570’—阴性对照孔在 570 nm波长的吸光度值 (含 10% Alamar Blue的培养基，无细胞)；

OD600’—阴性对照孔在 600 nm波长的吸光度值 (含 10% Alamar Blue的培养基，无细胞)。

支架的生物学性能表征

一、支架的前期处理

1、将打印后的支架（24*24*5mm）泡在生理盐水中12 h，然后换入新的生理盐水，浸

没支架为止（在50ml离心管中）。

2、将50ml离心管放入80 ℃的烘箱中，放置30min,然后取出再放置30 min。这种过

程循环3-4次，进行灭菌（巴氏消毒法）。

3、将灭菌后的支架放在12孔板中，加入2 ml的培养基然后37 ℃孵育12 h，直接在

支架上加入细胞，然后培育1-2h，最后加入2ml培养基进行培养。

QPCR实验过程（陈友）

一、细胞培养

1.1 不同配比的SA-GG/TMP复合水凝胶支架的制备

四种水凝胶的配比按照之前的实验方案操作，将制备的复合墨水用0.5M的氯化钙交联24h，然后利用模具将其切成直径15mm*5mm的圆柱凝胶盘。

1.2 凝胶样品的灭菌处理

将制备好的凝胶样品放到无菌的50m离心管中，然后加入无菌的生理盐水至盖过样品。然后密封，放入80℃烘箱中加热30分钟，然后在冷却30分钟，如此往复3-5次即可。

1.2水凝胶样品的接板

将灭菌的样品放入6孔板中，每个样品三个平行样，然后加入3-5ml培养基，培养基为DMEM高糖培养基，10%FBS，1%双抗，培养12h，去除水凝胶中的水分和多余的钙离子。然后去除旧的培养基，用生理盐水清洗3次，按每个孔5*104/cell细胞密度接板，接板时间分别为1、3、5、7d进行培养，每两天进行换液。

二、PCR操作过程

2.1 M-RNA的提取

2.1细胞裂解

将培养到时间的细胞去除材料，然后用PBS清洗3-5遍，加入Trizol 1ml（实际可以加入500微升即可），轻轻吹打1min左右，然后将孔板直接放到-80 ℃的冰箱中至少冷冻12小时。

2.2 M-RNA提取

2.2.1将冷冻的细胞裂解液解冻并且移到1.5mL的离心管中，然后按照Trizol与氯仿（三氯甲烷）比例为5:1的比例,即取0.2ml的氯仿，上下颠倒剧烈震荡15s,再冰上室温放置3分钟。然后2-8 ℃，12000*g离心15min。离心后样品分为三层：底层为红色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRizol试剂的60%。

2.2.2 把水相转移到1.5 mL的离心管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相。此处尽量洗干净水相，以1mlTRizol为例，约为500 μl的水相，如果吸到红色无机相，此样品重新进行上部离心。然后向离心管中加入每1ml TRzol加入0.5 ml

的异丙醇，在冰上放置10min。

2.2.3剧烈混匀后2-8 ℃，12000*g离心10min，离心前看不到RNA沉淀，离心后可能也看不到，属于正常现象。剧烈磕去上清液。

2.2.4加入75%的乙醇洗涤RNA。没1ml TRzol加入1 ml75%乙醇。2-8 ℃，不超过7500*g离心5分钟，用力磕去上清液，然后在冰面上进行干燥30min.

2.2.5加入40 μl的DEP水进行稀释，然后混匀，离心后备用。若不立即使用可以存放在-80 ℃。

三、逆转录操作过程

本逆转录过程使用的是Thermo Scientific的K1622试剂盒。

3.1 按照操作说明书预先配好逆转录试剂前驱液（每个样品用量）

（1）加入引物为Random Hexamer : 1 μl

（2）加入5X Reaction Buffer : 4 μl

（3）加入RiboLock RNase Inhibitor (20 U/μl) : 1 μl

（4）加入10 mM dNTP MiX : 2 μl

（5）加入RevertAid M-MulV RT (200U/μl): 1 μl

（6）加入Water，nulease-free : 3 μl

（7）加入Template RNA : 8 μl

1-6步骤可以多个样品同时配好，在分装。以上所有物质加在一起共20 μl反应体系。（也可以参考试剂盒说明书）

3.2 逆转录过程及程序设计

将3.1步的所有样品加入PCR小管子中，然后涡旋震荡30 s，再用小离心机离心30 s.然后将其放到PCR仪器中。

3.3逆转录程序设置

第一步：在25 ℃保温5 min，然后在42 ℃保温60 min，最后在70 ℃反应5min。（参照试剂盒说明书）

3.4 逆转录完成后取出样品，如不立即使用放置在-80 ℃。

四、RT-PCR操作过程

4.1 反应体系配置

具体配比按照下表（单个样品）：

总反应体系选择为20 μl，由于样品较多，为了省时间和方便添加试剂，可以分为三步走的方法。首先配置所有样品所需要的荧光染液，其次配置不同引物的各自总含量，最后加入所需要的CDNA含量。（我实验选择的为20 μl）

4.2 实验的布板

将上述三种试剂加到PCR专用孔板中，然后封膜，不能有气泡。最后进行涡旋混匀30 s，然后利用孔板离心机离心30 s。具体样品布板说明案例，以4个样品，每个样品三个平行样，每个平行样分出两个样。共检测5个基因，一个内参基因。具体布板如下图

注意，加样品时要非常小心，避免出错，且孔板要在冰上，内参基因每个板子单独存在。

4.3 三步法PCR扩增标准程序

预变性

95 ℃，2 min；

PCR 反应

95 ℃，10 s;

50-60 ℃，30-34 s; 40 cycles

72 ℃，30 s；

溶解曲线（判断特异性）

95 ℃，1 min；

55 ℃，1 min；

55-98 ℃(10 sec/cycle 0.5 ℃/cycle) 86 cycles。

五、仪器操作

开机：先开电脑，然后开启PCR仪器电源，带出现DNA分子链，按PCR仪器中间按钮立刻打开舱门。然后开启相应程序，逆转录按照程序进行即可。PCR过程操作：打开程序后，确认参数，然后点击下一步；点击create，选择板子，在sample位置选择Unknow，然后选择带有样品的板子（可以直接全选），

最后对孔板进行命名，分为横向样品名称和纵向基因名称，然后保存程序文件，点击运行，保存数据文件位置，然后开始PCR扩增程序，预计等待2-3个小时，结束实验，取出样品。

六、结果分析

反应结束后确认PCR的扩增曲线和溶解曲线，进行PCR定量分析。

七、实验注意事项

7.1安全性主要

实验使用的Trizol，氯仿、异丙醇、荧光染料等具有一定的挥发性和毒性，要戴手套和口罩，以及在通风橱下操作。

7.2实验耗材注意

本实验的所用的枪头，离心管必须经过灭菌处理，防止存在细菌和酶的存在。所使用的水均为专用的无酶水。

7.3 RNA的降解防护

RNA室温极易降解，所有关于RNA的操作必须在冰上进行，且所有用到的实际必须在冰箱或者冰上降温后使用。实验操作尽量快速进行。

附录

一、AM和PI的具体介绍

Calcein-AM是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，Calcein-AM由于在Calcein(钙黄绿素)的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein(钙黄绿素)留在细胞内,发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如BCECF-AM和Carboxy-fluorescein diacetate）相比，Calcein-AM是最适合作为荧光探针去染活细胞的，因为它的细胞毒性很低。Calcein(钙黄绿素)不会抑制任何的细胞功能如增殖或淋巴球的趋化性。另外，使用了Calcein(钙黄绿素)的活性检测的实验结果是十分可信并且与标准的51Cr-释放法所得结果相一致的。Calcein(钙黄绿素)的激发和发射波长分别为490 nm和515 nm。

Calcein-AM和碘化丙啶（PI）溶液，它们分别可对活细胞和死细胞染色。Calcein-AM的乙酸甲基酯亲脂性很高，使其可透过细胞膜，通过活细胞内的酯酶作用，Calcein-AM能脱去AM基，产生的Calcein(钙黄绿素)能发出强绿色荧光，因此Calcein-AM仅对活细胞染色。另一方面，作为核染色染料的PI不能穿过活细胞的细胞膜。它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光（激发：535 nm，发射：617 nm），因此PI仅对死细胞染色。由于Calcein(钙黄绿素)和PI-DNA都可被490 nm 激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545 nm激发，仅可观察到死细胞。根据以上特点，Calcein-AM和碘化丙啶（PI）经常被结合用来作为活细胞和死细胞的双重染色。

由于不同细胞系的最佳染色条件不同，我们建议个别确定Calcein-AM和PI的合适浓度。