染色体病产前诊断方法的研究

染色体病产前诊断方法的研究染色体病是由于染色体数目、结构畸变造成基因物质得失所引起的特有的临床表现。

现已发现人类染色体数目和结构畸变3000余种，在一般新生儿群体中，染色体异常的发生率为0.517%[1]。

由于染色体病的种类多、发病率高，而且目前对于绝大多数染色体病都缺乏有效的治疗方法，因此及时准确的产前诊断是唯一有效的防止染色体病儿出生的技术手段，本文就近年染色体病产前诊断的方法作一综述。

产前诊断技术可分为创伤性产前诊断及非创伤性产前诊断 ,前者是目前临床应用较为广泛的产前诊断技术，包括:孕早期绒毛活检技术、孕早中期胚胎(胎儿)镜检查技术、孕中期羊膜腔穿刺取样技术、孕中晚期脐静脉穿刺胎血取样技术等。

后者包括植入前诊断、宫腔灌洗收集滋养细胞、孕妇血清筛查及超声诊断、孕母外周血胎儿细胞、DNA分离诊断等。

近年来，随着分子生物学技术的不断发展，从母血中获取胎儿DNA来进行产前诊断逐渐受到重视，其应用也越来越广泛。

1 创伤性产前诊断技术1.1 羊膜腔穿刺孕中期羊水穿刺是一种通过B超引导，经腹部穿刺羊膜腔收集羊水的方法，是当今世界各国产前遗传学诊断较为常用的手段之一。

它为产科医生提供了一个获取胎儿遗传物质有效、可靠的途径。

穿刺时间以孕 18～22w为宜，有报道现在B超引导下获取羊水的成功率高达98％,仅2％的病例需要重新穿刺。

它诊断染色体疾病的可靠性约98％[2]，是最终确诊方法之一。

但它存在一定的局限性，①首先羊水染色体诊断时间受到妊娠时间的限制，孕中期妇女在最适宜于羊水穿刺的孕18～22周已能清楚地感觉到胎动，带着焦急的心情等待2～3周的羊水培养结果，一旦培养失败由于孕周的增加已丧失最佳的诊断时间，且发现胎儿异常只能中期引产，其所带来的身心损伤及手术操作的危险性明显增加。

②培养技术要求高，培养时间长③对嵌合现象难以判断。

④不能诊断多种单基因或者多基因遗传病，对于<5Mb片段基因的异常无法检测[3]。

近年来 ,孕早期羊膜腔穿刺引起越来越多人们的关注。

经过大量的研究发现，早期羊水穿刺较中期羊水穿刺具有较高的胎儿流产率，约3%～5%[4]，一些研究还表明先天性的足畸形，主要是马蹄内翻足的风险明显增加[5]，由于上述并发症，早期羊水穿刺没有在产前诊断中得到广泛推广。

1.2绒毛活检取样技术（CVS）早期绒毛活检由于它在妊娠早期即可对胎儿某些遗传性疾病进行诊断，减轻了孕妇及家属的心理压力，使孕妇身体创伤降到最低点，而且，从绒毛提取DNA量多质优，成功率高;即使不成功，也有足够的时间在孕中期进行其他的产前诊断检查。

但其有发生流产、畸形足和嵌合体的风险。

但绒毛细胞培养染色体制备时易出现分裂相少、易缺失、染色体形态不佳等现象，影响诊断结果，而其长期存在的嵌合问题，即染色体检测结果异常胎儿实际无异常等问题一直困扰着产科医生。

1.3胎儿脐静脉穿刺术胎儿脐带血穿刺为近年来发展的一项新技术 ,一般为 18至足月妊娠均可进行，为已超过羊膜腔穿刺时间的孕妇，赢得了做产前诊断的机会。

该技术利用胎儿血液可以进行多项检查，胎儿细胞培养只需要48小时即可进行染色体制备，可对绒毛及羊水培养出现的假嵌体或培养失败进行校正或补救诊断，特别是确诊X综合征方面是羊水和绒毛检查无法比拟的。

国内的一组资料显示，脐血穿刺术所导致的脐带或胎盘渗血率为13.1%，胎儿心动过缓率为5.2%，流产率0.8%，早产0.2%，绒毛膜羊膜炎0.1%[6]。

1.4孕早中期胚胎(胎儿)镜检查技术这是利用细小的纤维内窥镜进人羊膜腔，直视下检查胚胎(胎儿)。

国外最早在孕7周可进行胚胎镜检查，而胎儿镜检查通常在孕18-22周进行。

通过检查，可准确地诊断或排除胎儿体表畸形、可进行胎儿组织活检以及脐血穿刺采集胎血等。

但因其属损伤性检查，可引起早产和流产，且操作难度，再加上其视野有限，因此，胚胎(胎儿)镜在临床诊断胚胎或胎儿异常受到限制。

有创性产前诊断技术的共同之处是对母儿的损伤，可能发生母儿刺伤、羊水减少、羊水栓塞、羊膜腔感染、流产、脐带胎盘出血、胎儿一过性胎心减慢经积极处理无效而死亡等;同时，也存在操作技术失败以及实验室结果有误差等风险。

2 无创伤性产前诊断技术2.1植入前遗传学诊断（PCD）植入前遗传学诊断是在胚胎植入母体前完成的遗传学诊断，由于可以有效避免传统的产前诊断技术对异常胚胎进行治疗性流产的要求，更易于为大众接受，特别适用于有高风险生育遗传病患儿夫妇[7] ,是优生领域中的重要进展。

随着体外受精－胚胎移植技术（IVF-ET）的广泛开展，加上荧光免疫杂交（FISH）技术的深入发展，PGD可应用于染色体非整倍体病、X连锁隐性遗传病、单基因遗传病的检测 [8]。

2.2超声产前诊断技术传统的绒毛、羊水、脐血检测方法难以在如此众多的人群中进行产前诊断，因此人们研究了很多非损伤性技术，其中B超产前检查是引起关注的方法之一。

目前较为公认的B超检测妊娠期期发现染色体异常方面的观察标志有: ⑴孕早期发现染色体异常的标志：①颈部透明层（nuchal translucency, NT）在孕 11～14孕周，NT值增厚与很多染色体异常相关。

有文献报道早孕期孕妇血清学筛查+胎儿颈项透明层厚度（NT），可检出90%的21三体[9]。

②鼻骨（nasal bone, NB）在 11～14孕周，胎儿鼻骨缺失与 21 -三体综合征及其它染色体异常有很高的相关性[10],21 -三体、18 -三体、13 -三体综合征胎儿中，鼻骨缺失的比例分别为 60%～70%、50%、30%。

正常胎儿中只有 1.4%的鼻骨缺失。

③头臀长（crown - rump length, CRL）18 -三体及三倍体与中度及严重生长迟缓相关，13 - 三体及特纳氏综合征与轻度生长迟缓相关，而21 -三体胎儿的生长发育基本正常。

其它的指标还有胎心率、单脐动脉等。

⑵孕中期期发现染色体异常的标志：①颈背部皮肤厚度（nuchal fold, NF）对 21 -三体综合征检出的敏感性可达 75%, 特别是不合并其它严重畸形的 21 -三体综合征胎儿，NF增厚常是最易检出的声像表现[11]。

②肠管回声强：诊断标准为肠管回声增强，与骨骼回声接近。

有人认为，发现肠管回声增强，21 - 三体综合征胎儿的发生率增高[12] ; 27%的染色体非整倍体胎儿出现肠管回声增强; 4.8%的唐氏儿有肠管回声增强。

另外股骨短或肱骨短、脑室扩大、严重畸形通常与21 - 三体综合征、18 -三体综合征、13 -三体综合征相关。

其它指标如肾盂扩张、心室灶状强回声、脉络丛囊肿等，都是筛查染色体异常的指标，相关性待进一步研究。

2.3宫腔灌洗收集滋养细胞人类胚胎在第6～8w时绒毛膜表面的绒毛数丰富，12w时包蜕膜与壁蜕膜相贴而合一。

因此受精后6～12w之间进行宫腔冲洗,可获多量滋养细胞。

有研究从宫腔冲洗出的滋养细胞作细胞培养获得成功[13] ,证明此细胞仍具有活力。

不少研究报道用此方法作产前诊断成功[14,15] 。

但该操作不当会引起出血及流产，实验技术要求比较高，目前还处于临床试验阶段。

2.4母血胎儿细胞及胎儿DNA的检测近年来从孕妇血中分离胎儿细胞及孕妇外周血中胎儿游离DNA的发现，为我们提供了一种无创性产前诊断的新途径[16] 。

目前采用的一些分子细胞遗传方法，包括PCR、巢式PCR、荧光定量PCR（FQ-PCR）、FISH技术、引物原位标记技术（PRINS）,为产前诊断提供更直观、快速的方法。

荧光原位杂交（FISH）它是利用标记的 DNA 探针在一个特定序列进行杂交以检测靶片断。

FISH技术的优点在于能利用间期细胞作标本，而且所需要的细胞数量不多，因此省去了细胞培养，染色体制备和核型分析等过程，可以使用未经培养的羊水细胞和绒毛细胞、植入前诊断和母体外周血富集胎儿细胞诊断等。

它只需根据杂交位点数目即可迅速确定染色体数目，检测时间明显缩短，可在 24～48h内得出结果。

但FISH也有一定的局限性：以 FISH为基础诊断间期细胞染色体异常时，如染色体结构重排、嵌合型的染色体和一些罕见的非整倍体都不能被发现，故此间期 FISH实验诊断非整倍体应辅以传统的细胞遗传学技术。

而且FISH技术与染色体核型分析不同，FISH一次只能检测出 1个或几个已知的染色体异常，而有些染色体病是由于一些比较零散的染色体重排造成不能一次性的分析所有染色体，且技术复杂、操作烦琐、试剂昂贵，不适合临床大规模的开展。

因此，FISH 法不能完全代替染色体核型分析法对染色体病进行产前诊断，只能用于有限的已知的染色体异常的诊断。

近些年来，人们摸索着将一些新的分子生物学技术应用于产前诊断中进行基因诊断，这些分子生物学方法主要包括荧光定量 PCR（QF- PCR）和巢式PCR等。

随着现代分子遗传学技术的发展，产前诊断将会在这些技术的辅助下对染色体病的认识不断提高，诊断技术也将会不断得到改进和更新。

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