用多聚赖氨酸作载体制备IVM人工抗原的研究
兽医科技
收稿日期:2008-12-21;修回日期:2008-10-31
基金项目:中国农科院兰州畜牧与兽药研究所基金项目(MY JJ05-3)
作者简介:魏小娟(1976-),女,助理研究员,硕士.
用多聚赖氨酸作载体制备I VM 人工抗原的研究
魏小娟,张继瑜,张 梅,李剑勇,周绪正,李金善,牛建荣
(中国农业科学研究院兰州畜牧与兽药研究所中国农业科学院新兽药重点开放实验室,甘肃兰州730050)中图分类号:S852.4+
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文献标识码:B 文章编号:1004-7034(2009)01-0065-02
关键词:伊维菌素;人工抗原;多聚-L-赖氨酸
摘 要:采用N -羟基琥珀酰亚胺活性酯法和混合酸酐法,将伊维菌素(I V M )分别与多聚-L-赖氨酸(PLL)和卵清蛋白(OVA )连接制备人工免疫原5-O -(单)琥珀酰I V M -PLL 和包被原5-O -(单)琥珀酰I VM -OVA,经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析证实人工抗原合成成功。 伊维菌素(Lver m ecti n ,I V M )是大环内酯类杀虫、杀螨剂,由于其具有杀菌活性强以及杀菌谱广等特点已被广泛地应用于畜禽及水产养殖业,也是农业生产上广泛使用的一种杀虫剂。但此类药物在动物性产品中的残留严重影响到我国农产品的国际竞争力,同时也对人及环境存在潜在的威胁。
随着人们对I VM 残留的毒性及环境风险的日益关注,迫切需要简单、快速、高效的I V M 残留检测方法,但目前常用的H PLC 法检测的灵敏度较低,无法满足农产品中I V M 及其有毒代谢物的残留分析要求。为此,笔者根据I V M 的结构特点,采用N -羟基琥珀酰亚胺活性酯法和混合酸酐法将伊维菌素与载体蛋白偶联,成功地制备了伊维菌素完全抗原,为畜禽产品中伊维菌素残留的ELISA 检测奠定了基础。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 伊维菌素 白色粉末,有效成分含量>98%(其中B 1a 含量约为92%,B 1b 含量约为18%),浙江海正药业有限公司提供。1.1.2 主要试剂 牛血清白蛋白(BSA )、卵清蛋白(OVA )、多聚-L -赖氨酸(PLL)、乙基二甲氨基碳化二亚胺盐酸盐(EDC ),Sig m a 公司产品;二甲基甲酰胺(DMF )、咪唑、琥珀酸酐、吡啶,北京化工厂生产;N -羟基琥珀酰亚胺(NH S)、叔丁基二甲基氯硅烷(t-Bu M e 2S i-C l),天津化学试剂公司生产;硅胶GF254(200~400目),青岛海洋化工厂生产;羊抗兔I gG-HRP ,北京鼎国生物公司生产。1.1.3 主要仪器 透析膜(Sig m a)、Sartorious 电子天平、95-1型磁力恒温搅拌器、DDY -6B 型电泳
仪、凝胶成像系统及分析软件(Syngene 公司)。1.1.4 试验动物 新西兰成年白兔,体重1.7~2.0kg ,购自中牧集团兰州生物制药厂。1.2 试验方法1.2.1 半抗原5-O -(单)琥珀酰I V M 的合成 以C 5-OH 为反应位点,在无水吡啶的催化下进行反应。取0.1g I VM 加2.0m L 无水吡啶溶解,加入0.05g 琥珀酸酐,45e 、磁力搅拌下避光反应12h ,反应物在3.6%HC l 和乙酸乙酯间分配,收集酯层减压浓缩;用二氯甲烷复溶残留物,TLC 分离产物(GF 254,展开剂C H 2C 12B TH F B HAC (90B 9.5B 0.5),共有4个条带,Rf 分别为1.0,0.5,0.3,0.2;分别刮取4条带,以乙酸乙酯淋洗,收集洗脱液,减压浓缩,真空干燥。1.2.2 人工抗原的合成 免疫抗原5-O -(单)琥珀酰I V M -PLL 的合成(NH S 法):取12m g 半抗原5-O-(单)琥珀酰I V M,加0.4mL D M F 溶解,再依次加入2.7m g NH S 和4.7m g EDC -HC l 混合,20e 避光搅拌10h ,将上述反应液逐滴加至6mL 含20m g PLL 的硼酸盐缓冲液(0.2mm ol/L ,p H 值为9.4)-10%DM F ;溶液开始略显混浊,最后有少量沉淀出现,继续搅拌1h ,再转至4e 条件下搅拌12h,产物经PBS (0.01m o l/L ,p H 值为7.2)透析72h,Sephdex G -200纯化。
包被原5-O -(单)琥珀酰I V M -OVA 的合成(混合酸酐法):取10m g 5-O-(单)琥珀酰I V M,用1mL D M F 溶解,加入15L L 氯甲酸异丁酯,20e 搅拌45m i n ,制成A 液;称取30m g 的OVA 溶于10m L 0.2m ol/mL 硼酸盐缓冲液(pH 值为9.4)中制成B 液。将A 液逐滴加入B 液,边加边搅拌,之后在4e 搅拌反应12h ,然后将混合物装入事先处理并在0.01m o l/m L PBS(p H 值为7.4)中浸泡过夜的透析袋中,在4e 、0.01m o l/mL PBS(p H 值7.4)中透析3d ,每天换2次透析液。1.2.3 半抗原和人工抗原的结构鉴定 半抗原的结
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5黑龙江畜牧兽医62009年第1期
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构鉴定:采用薄层色谱法点样,以I V M 的标准品作为对照,采用质谱法确证。
人工抗原的SDS-PAGE 鉴定:SDS-PAGE 所用浓缩胶浓度为5%,分离胶浓度为15%,浓缩胶电压为80V,分离胶电压为120V;电泳完毕后用考马斯亮蓝R-2502.5g /L 染色5h,用脱色液脱色至背景清晰为止,然后用凝胶成像系统软件计算载体蛋白与半抗原的结合比。2 结果2.1 半抗原的合成与鉴定
合成产物共有4条带,Rf 分别为1.0,0.5,0.3,0.2,进行质谱鉴定,Rf 0.3的分子质量(976bp)与目标产物分子质量(976.6bp)一致,见图1。质谱分析结果从分子质量上说明了反应产物为目标产物。
目标产物干燥后称重,最终得到75m g 白色粉末,计算其收率为67.63%
。
图1 5-O -(单)琥珀酰I VM 质谱图
2.2 人工抗原的SDS-PAGE
鉴定
.5-O-(单)琥珀酰I VM -OVA;2.5-O -(单)琥珀酰I V M -PLL ;
3.载体OVA;
4.载体PLL;M.低分子蛋白质量标准。
图2 人工抗原的SDS-PAGE
人工抗原及其载体的SDS-PAGE 结果显示,合成的人工抗原SDS -PAGE 条带的迁移率均比各自载体的迁移率略小(见图2),表明人工抗原的分子质量大于相应载体的分子质量,证明人工抗原合成成功。用凝胶成像系统软件分析得出5-O -(单)琥珀酰I V M -PLL 的分子质量为79.6ku,载体PLL 的分子质量为55.0ku ,PLL 与5-O -(单)琥珀酰I V M
的分子结合比为1B 25.3。5-O-(单)琥珀酰I V M -OVA 的分子质量为58.0ku ,载体OVA 的分子质量
为40.0ku ,OVA 与5-O -(单)琥珀酰I V M 的分子结合比为1B 18.6。3 讨论
目前,用于检测动物性食品I V M 残留的检测方法主要是H PLC 法,样品前处理复杂、耗时且设备昂贵,不适用于大批量样品的快速筛选、检测。而ELISA 法具有快速、特异性强、灵敏度高等优点,甚至可以制成试纸用于现场快速检测,已广泛应用于农药、激素、兽药及其他化学残留物的检测。
笔者以NH S 法合成了5-O -(单)琥珀酰I V M -PLL 人工免疫原,以混合酸酐法合成了5-O -(单)琥珀酰I V M -OVA 人工包被原,经SDS -PAGE 鉴定,表明人工抗原合成成功,经计算PLL 与5-O-(单)琥珀酰I VM 的偶联比为1B 25.3。
制备小分子化合物的人工抗原需要与载体进行交联,但小分子化合物必须具有或衍生出能与载体进行交联反应的功能基团(氨基、羧基、重氮盐等)才能与载体交联。对于羟基的半抗原,需要将其羟基衍生为羧基后才能与载体交联合成人工抗原。I V M 分子结构中有3个羟基,即C4d -OH 、C5-OH 和C7-OH,但7位羟基由于空间阻碍作用较难反应,本试验选用5位羟基与琥珀酸酐反应生成其衍生物I V M 的半琥珀酸酯,从而在5位羟基上引入了1个羧基,进而与载体交联合成了I V M 的人工抗原。
对于含有羧基半抗原与载体蛋白质偶联的方法有混合酸酐法、碳化二亚胺法和NH S 法。其中NH S 法首先利用NH S 和半抗原合成酯,在EDC 的作用下使产物与蛋白失水产生稳定的连接,偶联的效果较好,所以采用该方法制备免疫抗原。半抗原和载体蛋白连接免疫动物后,不可避免地会产生针对免疫部位的抗体,为了避免此现象,选用混合酸酐法制备包被原,以利于血清的筛选。
I V M 作为一种半抗原,本身并不具备免疫原性,必须将其与相应的载体结合后才具有免疫原性。常选用的载体有鸡卵清蛋白(OVA )、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HAS)等。本试验首次选用多聚-L-赖氨酸作载体来合成I V M 的人工抗原,PLL 自身免疫原性很差,但可以增加半抗原的免疫性,有利于机体产生特异性更高的抗体,且具有比BSA 更多的自由氨基(与BSA 相当分子质量的自由氨基数约是BSA 所含数目的10倍),可以大大提高在提蛋白质与半抗原的偶联率。试验结果表明,以PLL 作载体的偶联比为1B 25.3,比BSA 作载体时的偶联率有所提高,且产物的收率也较高。
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H e ilong jiang A ni m a l Sc i ence
and V e teri nary M edicine
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多聚赖氨酸溶液(10×PLL,1mgml,无菌)
多聚赖氨酸溶液(10×PLL,1mg/ml,无菌) 简介： 多聚赖氨酸溶液英文名为Poly-L-lysine Solution 简称PLL 。Leagene Poly-L-lysine 为Poly-L-lysine hydrobromide ，分子式为L-Lys-(L-Lys)n-L-Lys ?xHBr ，分子量为150,000～300,000，CAS Number 25988-63-0。 PLL 是一种粘附剂，常用于载玻片的包被,可以直接稀释后用于细胞或组织培养方面的实验。分子量大于70,000的多聚赖氨酸可以促进细胞贴壁生长，本产品可以用于促进细胞的贴壁生长和核酸杂交，制备好的载玻片可4℃保存半年。 组成: 操作步骤(仅供参考)： 1、 用于细胞培养 ①_x0001_ 根据实验需要Poly-L-lysine Solution 稀释至适当浓度溶液后即可使用。不同的细胞，Poly-L-lysine Solution 包被(Coating)的时间和浓度，甚至稀释液的选择有所不同，请自行参考相关文献进行适当的包被。 ②Poly-L-lysine Solution 用于细胞培养时，包被至少5min ，有些实验需要包被1～2h ，有些情况则需要包被过夜。 ③包被完成后，吸Poly-L-lysine Solution ，干燥培养器皿，至肉眼观察完全干燥。通风橱内吹风数分钟即可完成干燥，对于有些实验则需要干燥2h 或更长时间。干燥时间较长通常会更加有利于后续的细胞粘附。 ④进行细胞培养，也可以用水、PBS 或培养液等适当溶液润洗后再进行细胞培养。 2、 用于核酸杂交 ①_x0001_ 方法一：取事先准备好的载玻片或盖玻片经冷却至室温，在Poly-L-lysine Solution 上下浸蘸几下，自然干燥，4℃备用，亦可室温保存1个月。 ②_x0001_ 方法二：Poly-L-lysine Solution 涂于玻片上，自然干燥后即可使用，可用于细胞涂片和切片。 ③_x0001_ 方法三：滴加5～10μl Poly-L-lysine Solution 至玻片上，用另一盖玻片以血涂片方法推片或用另一玻片紧贴于其上，相互摩擦以使两玻片相对的一面涂布上明胶包被溶液。 编号 名称 IH0095 Storage Poly-L-lysine Solution(1mg/ml,无菌) 10ml -20℃ 避光 使用说明书 1份
多聚赖氨酸处理
配制0.01%的多聚赖氨酸: 首先买来sigma 公司的多聚赖氨酸，如是25mg，就需要250ml三蒸水，用移液管将少量三蒸水加到多聚赖氨酸的小塑料瓶中，然后将溶解的多聚赖氨酸加到200ml左右三蒸水中，(已置烧杯中)。最后加三蒸水达250ml，过滤除菌分装与小瓶中即可。保存于-20度，近期用的话可放于4度冰箱内保存。注意每一小瓶的量不要太满，若20ml的瓶子，只装15ml可，若太满，放于-2度有可能会将瓶子弄碎，因冻后体积增加。(我就有这个教训) 另外烧杯，小瓶、移液管都要灭菌处理的，泡酸高压什么的。我们用的是一种用注射器过滤的过滤器，一次性的。一个能最多有效过滤200ml。 铺板的操作:首先要在消毒实验室，包括超净台，紫外消度20-30分钟。消毒后30分钟进入实验室。事先准备100ml三蒸水，经高压灭菌处理。具体细节就不多说了。 首先打开板子，用消毒好的试管将0.01%的多聚赖氨酸加入每一孔中，大概每孔3-4滴吧。将板子盖好放到培养箱中(37度 5%CO2)30分钟。 取出板子，用吸管将多聚赖氨酸吸出。换吸管，加入三蒸水，冲洗三次，即将每孔内加入三蒸水，没过底，多点也行。再将水吸出来。反复三次。注意换吸管，要无菌操作的。 最后将铺好的板子放于培养箱待用。 如果你做免疫组化，需要放小的玻片到孔内，就在加多聚赖氨酸之前用无菌的镊子将无菌的玻片夹到孔内即可。 我曾用过多聚赖氨酸包被培养瓶,但浓度是0.1mg/ml,我都是放一夜,第二天吸 掉晾干就用,当然要紫外消一下.我觉得时间长点没什么大碍。 我们这里的老师说，多聚赖氨酸不能用紫外线照射。
1.用赖氨酸包被培养板和培养瓶时，应该选用多聚左旋赖氨酸(分子量为15-30万) ； 2.感觉你“浓度为50ng/1ml”有些低，我一般最后多聚赖氨酸使用浓度达到20－30ug/ml； 3.包被时间一般为6－7h，或者过夜也可； 4.使用时应该先用灭菌水洗三次＋PBS（起平衡盐作用）洗一次，洗液的量应该大于包被液的量； 5.“多聚赖氨酸可以在培养瓶中放多长时间，太长了会有影响吗？”，我包被时间最长的经历有过48h,最后只是多聚赖氨酸随着时间延长蒸发一些而量变少了，但是对细胞生长并无大碍，这是我曾经有过的经历，所以我会负责地告诉你； 6.“多聚赖氨酸能在4度冰箱里放多久？”，最好置于－20度保存，放置数月 乃至半年都可以。 我问过博士德公司，他们分装的多聚赖氨酸是用来作免疫组化的，没有做过细胞培养实验，他们不保证能否用在细胞培养中，建议你买其他公司的吧，有固体的，分子量为15-30万，我们实验室用浓度0.01%的来促进神经细胞贴壁。 我们用的多聚赖氨酸浓度为100ug/ml,一般包被3-4小时即可用.我们包被完后 一般放在培养箱里,临用时拿出来洗三次，吹干即可．如果不急着用，放在培养箱里较长时间也没关系，把瓶盖拧紧即可，我最长放了２星期也没有问题。 左旋和右旋的多聚赖氨酸都可以用于包被细胞培养器具,主要看你的细胞贴壁能力如何,左旋的更利于细胞贴壁.我们一般使用0.01%浓度的,包被过夜,第二天 用双蒸水洗两三次,超净台紫外照射,风干。可以直接买sigma的原装粉剂自己配。还有,配好的多聚赖氨酸在4度时间不能放置太久,大概就一两周吧。存放于-20度中的一般为0.1%的,而且不能反复冻融,只能融化一次。最好是配好后分装。
赖氨酸发酵生产
赖氨酸发酵生产 摘要：赖氨酸是人体必需的八大氨基酸之一，能促进人体发育、增强免疫功能，并有提高中枢神经组织功能的作用。赖氨酸为碱性必需氨基酸。由于谷物食品中的赖氨酸含量甚低，且在加工过程中易被破坏而缺乏，故称为第一限制性氨基酸。将赖氨酸添加到食品中能大大提高蛋白质的利用率，又是一种优良的食品强化剂。因此研究赖氨酸的生产有着很高的价值。关键词： 简介： 赖氨酸是一种碱性氨基酸，是仅次于谷氨酸的第二大氨基酸产品，是谷物蛋白的第一限制性氨基酸，在谷物食料中添加适量的赖氨酸，其蛋白质的生物价大大提高。 赖氨酸的应用范围很广。①作为食品强化剂；②作为药物可用作肝细胞再生剂，对改善肝功能，治疗肝硬化、高氨症，增进食欲、改善营养状况有明显的疗效；③作为饲料添加剂，在畜、禽类的饲料中添加少许的赖氨酸，对家禽、家畜的日增重、料肉比、家禽的产卵量等方面效果尤为显著。 1．赖氨酸发酵机制 赖氨酸合成途径的调节机制 （1）谷氨酸优先合成，谷氨酸合成过剩就会抑制谷氨酸脱氢酶（GD）的活性，使得生物合成的代谢流转向天门冬氨酸。天门冬氨酸的过剩也会抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性，使得天门冬氨酸不致大量积累。 （2）赖氨酸的前体物质天门冬氨酸与乙酰辅酶A的生成形成平衡合成，乙酰辅酶A的增加能逆转天门冬氨酸对其自身合成的反馈抑制。 （3）天门冬氨酸激酶（AK）受赖氨酸与苏氨酸的协同反馈。AK是一个变构酶，催化天门冬氨酸和ATP形成α-天门冬氨酸磷酸，有两个变构位置可以接受末端产物。AK受赖氨酸与苏氨酸的协同抑制，当只有赖氨酸或苏氨酸与变构位置结合时，酶活影响不大，当赖氨酸与苏氨酸同时结合到两个变构位置时，酶活受到强烈的抑制。此外，AK是赖氨酸合成途径中唯一的反馈调节点。 （4）赖氨酸亮氨酸的生物合成之间存在着代谢互锁，赖氨酸分支途径的初始酶二氢吡啶二
聚赖氨酸 许可证执行标准批文
关于批准ε-聚赖氨酸等4种食品添加剂新品种等的公告（2014年第5 号） 50
附录 A 检验方法 A.1 安全警示 试验方法规定的一些试验过程可能导致危险情况。操作者应采取适当的安全和防护措施。 A.2 一般规定 本标准所用试剂和水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T 6682—2008中规定的三级水。试验中所用标准滴定溶液、杂质测定用标准溶液、制剂及制品，在没有注明其他要求时，均按GB/T 601、GB/T 602、GB/T 603的规定制备。试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时，均指水溶液。 A.3 鉴别试验 易溶于水，略带苦味。 A.4 ε-聚赖氨酸含量的测定 A.4.1 试剂和材料 A.4.1.1 硫酸钠溶液：0.30 mol/L。称取42.6 g硫酸钠溶解并定容至1000 mL，用乙酸调pH为4.0。 A.4.1.2 ε-聚赖氨酸标准贮备溶液：10.0 mg/mL。称取1.0 g ε-聚赖氨酸标准样品，溶解并定容至100 mL。 A.4.1.3 ε-聚赖氨酸标准溶液：1.0 mg/mL。移取10.0 mL ε-聚赖氨酸标准贮备溶液于100 mL容量瓶中，定容至100 mL。 A.4.2 仪器和设备 凝胶渗透色谱仪：配有紫外检测器。 A.4.3参考色谱条件 A.4.3.1凝胶柱：水相凝胶过滤色谱（7.8 mm ×300 mm）。 A.4.3.2检测温度：30 ℃。 A.4.3.3检测波长：210 nm。 A.4.3.4流速：0.5 mL/min。 A.4.3.5进样量：20 μL。 A.4.3 分析步骤 A.4.3.1 标准曲线的绘制 分别移取0.00 mL、5.00 mL、10.00 mL、15.00 mL、20.00 mL、25.00 mL ε-聚赖氨酸标准溶液至25 mL容量瓶中并定容，溶液经0.22 μm微孔滤膜过滤。打开色谱仪，并调至工作状态，待基线平稳后，依次将上述ε-聚赖氨酸标准溶液注入凝胶柱中，进样量为20 μL，记录峰面积，以标准溶液中ε-聚赖氨酸的质量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。 A.4.3.2 试样测定 准确称取0.1 g试样，溶解定容至100 mL。配好的试样溶液经0.22 μm微孔滤膜过滤，进样量为20 μL，进行凝胶渗透色谱检测，记录峰面积，并根据标准曲线查得试样中ε-聚赖氨酸的质量。 A.4.4 结果计算
多聚赖氨酸包被方法
Poly-lysine-coated tissue culture surfaces 1. To coat coverslips: Prepare a stock solution by dissolving 25 mg/ml polylysine in 4.73 ml water (both poly-L-lysine and poly-D-lysine are used to coat tissue culture surfaces; check specific protocol for choice of isomer) and filter sterilize through a 0.22-μm filter. Store in 100-μl aliquots at -20°C. When ready to use, dilute one aliquot in 40 ml water to prepare 13 μg/ml working solution. Sterilize coverslips by autoclaving prior to coating. Dip coverslips in the working solution, then incubate 15 min to several hours in a humidified 37°C, 5% CO2 incubator. Allow surface to dry. 2. To coat culture dishes: 多聚赖氨酸包被培养皿/板 Prepare a stock solution by dissolving 100 mg poly-lysine in 100 ml water (both poly-L-lysine and poly-D-lysine are used to coat tissue culture surfaces; check specific protocol for choice of isomer) and filter sterilize through a 0.22-μm fil ter. 配制1mg/ml储存液 Store in 5-ml aliquots at -20°C. 分装保存在-20度 When ready to use, dilute 1 part stock solution with 9 parts water to prepare 100 μg/ml working solution. 使用前按1：10稀释成100μg/ml工作浓度。用5-10ml一次性无菌注射器和0.22μm 滤器过滤除菌，备用。 Fill tissue culture dishes or slide wells with the working solution and incubate 1 hr in a humidified 37°C, 5% CO2 incubator, then remove solution by vacuum aspiration and allow surface to dry.
多聚赖氨酸的配置、保存、使用
多聚赖氨酸的配置、保存、使用 一、常用的多聚赖氨酸包被可以用三蒸水，或者PBS，浓度一般为用 0.1 mg/ml进行包被。 二、其他常用包被方法比较(以各种免疫分析为例)： .snap 三、我配成1mg/ml的储存液，用Mini-Q(超纯水)配制，放在－20℃储存，使用时稀释10倍（也用超纯水），即终浓度100ug/ml，过滤后使用。工作液过滤使用，如一次用不完，放在4℃储存。 多聚赖氨酸在水溶液中易分解，所以一次不要配太多工作液。 四、我现在要配多聚赖氨酸,书上写的用PBS配,但没写PH,浓度，向各位请教。 答： PH应该在 7.0~ 7.4，PBS： 取氯化钠 7.650 g，无水磷酸氢二钠 0.724 g，磷酸二氢钾 0.210g溶于蒸馏水1000 mL中，以1N氢氧化钠溶液调pH值为 7.0~ 7.4，经121℃灭菌15分钟
五、我准备用多聚赖氨酸涂片培养细胞,不知道多聚赖氨酸涂过的玻片如何灭菌？能否干烤灭菌？ 答： Sigma的产品说明书上写的很xx的。 另外，有本书上是这么写的，供参考： Poly-lysine-coated tissue culture surfaces To coat coverslips: Prepare a stock solution by dissolving 25 mg/ml polysine in 4.73 ml water (both poly-L-lysine and poly-D-lysine are used to coat tissue culture surfaces; check specific protocol for choice of isomer) and filter sterilize through a 0.22-μmfilter. Store in 100-μlaliquots at?20° C. When ready to use, dilute one aliquot in 40 ml water to prepare 13μg/mlworking solution.Sterilize coverslips by autoclaving prior to coating. Dip coverslips in the working solution, then incubate 15 min to several hours in a humidified 37°C, 5% CO2 incubator. Allow surface to dry.To coat culture dishes or 8-well chamber slides: Prepare a stock solution by dissolving 100 mg poly-lysine in 100 ml water (both poly-L-lysine and poly-D-lysine are used to coat tissue culturesurfaces; check specific protocol for choice of isomer) and filter sterilize through a 0.22-μmfilter.Store in 5-ml aliquots at ?20° C. When ready to use, dilute 1 part stock solution with 9 parts waterto prepare 100μg/mlworking solution. Fill tissue culture dishes or slide wells with the working solution and incubate 1 hr in a humidified 37°C, 5% CO2 incubator, then remove solution by vacuum aspiration and allow surface to dry. Store coated tissue culture ware up to 3 months at 4°
聚赖氨酸的研究进展
聚赖氨酸的研究进展 食品的腐败变质主要是指由于微生物的作用而导致食品质量下降或失去食用价值的一切变化，它直接影响食品的品质和消费者的健康。全世界每年约有10％～20％的农副产品、水产品、果蔬会腐败变质，经济损失巨大。如何防止食品的腐败变质越来越引起人们的重视，有关食品防腐剂的研究也日趋完善。 目前使用的防腐剂品种很多，美国有50多种，日本有43种，中国香港特区27种，主要为丙酸及盐类、山梨酸及钾盐、苯甲酸类、噻菌灵、对羟基苯甲酸酯类、以及新型生物防腐剂聚赖氨酸、鱼精蛋白、乳酸、链球菌素等。我国允许使用的约18种，主要品种有：苯甲酸钠、山梨酸及其钾盐、丙酸钙等，生物防腐剂的开发和应用尚处于起步阶段。苯甲酸系列、山梨酸系列、丙酸盐等这些防腐剂均为化学合成的防腐剂，对人体健康有一定影响。随着人们生活水平的日益提高，迫切需要更安全的防腐剂。日本开始使用聚赖氨酸、Nisin等以微生物发酵法生产的天然防腐剂替代传统的化学合成的防腐剂。 作为新型的天然防腐剂，ε-聚赖氨酸已于2003年10月被FDA批准为安全食品保鲜剂。迄今为止，ε-聚赖氨酸的微生物发酵在日本已实现工业化，年产千吨ε-聚赖氨酸的现代化工业装置已建成投产。但该技术在国内还处于实验室阶段，ε-聚赖氨酸生物防腐剂的开发和生产还处于起步阶段，如果能重点扶持这一技术，将会在未来几年创造出可观的经济效益。 1聚赖氨酸的性质 1977年日本学者S．Shima和H．Sakai在从微生物中筛选Dragendo~Positive(简写为DP)物质的过程中，发现一株放线菌No．346能产生大量而稳定的DP物质，通过对酸水解产物的分析及结构分析，证实该DP物质是一种含有25—30个赖氨酸残基的同型单体聚合物，称为ε-多聚赖氨酸(8一 PL)。研究证明由于ε-PL比α-PL有更强的抑菌活性，而且仅一多聚赖氨酸有一定毒性，目前在国际市场上ε-多聚赖氨酸作为食品防腐剂已经取代了α-多聚赖氨酸。其分子式如下： 1．1 ε-聚赖氨酸的理化性质 ε-聚赖氨酸为淡黄色粉末、吸湿性强，略有苦味，是赖氨酸的直链状聚合物。它不受pH值影响，对热稳定(120℃，20min)，能抑制耐热菌，故加入后可热处理。但遇酸性多糖类、盐酸盐类、磷酸盐类、铜离子等可能因结合而使活性降低。与盐酸、柠檬酸、苹果酸、甘氨酸和高级脂肪甘油酯等合用又有增效作用。分子量在3600—4300之间的ε-聚赖氨酸其抑菌活性最好，当分子量低于1300时，ε-聚赖氨酸失去抑菌活性。由于聚赖氨酸是混合物，所以没有固定的熔点，250℃以上开始软化分解。￡一聚赖氨酸溶于水，微溶于乙醇。对其表征进行红外光谱分析表明：在1680～1640cm -1和1580—1520cm-1有强吸收峰。 1．2 ε-聚赖氨酸的生物学性质 ε-聚赖氨酸是一种具有抑菌功效的多肽，这种生物防腐剂在80年代初由日本学者腾井正弘，平木纯首次应用于食品防腐。ε-聚赖氨酸能在人体内分解为赖氨酸，而赖氨酸是人体必需的8种氨基酸之一，也是世界各国允许在食品中强化的氨基酸。因此8一聚赖氨酸是一种营养型抑菌剂，安全性高于其他化学防腐剂，其急性口服毒性为5g/kg。 ε-聚赖氨酸抑菌谱广，对于酵母属的尖锐假丝酵母菌、法红酵母菌、产膜毕氏酵母、玫瑰掷孢酵母；革兰氏阳性菌中的耐热脂肪芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌；革兰氏阴性菌中的产气节杆菌、大肠杆菌等引起食物中毒与腐败的菌有强烈的抑制作用。刘慧等研究也表明：ε-聚赖氨酸对革兰氏阳性的微球菌，保加利亚乳杆菌，热链球菌，革兰氏阴性的大肠杆菌，沙门氏菌以及酵母菌的生长有明显抑制效果，聚赖氨酸与醋酸复合试剂对枯草芽胞杆菌有明显抑制作用。
赖氨酸的生产工艺
1TPM赖氨酸分离提取工艺设计 学生姓名： 学号： 指导教师： 专业名称：生物工程 完成时间： 2011年11月
目录 目录 (1) 第一章项目总论 (3) 1.1赖氨酸的简介 (3) 1.2赖氨酸的性质 (3) 1.3赖氨酸的作用 (3) 1.4赖氨酸的生产方法 (4) 1.4.1二步发酵法 (4) 1.4.2直接发酵法 (4) 1.5赖氨酸的提取精制 (4) 1.6生物工业下游技术的一般工艺过程 (5) 1.7离子交换原理 (5) 第二章技术方案 (1) 2.1产品方案 (1) 2.2发酵工艺流程示意图 (1) 2.3发酵过程工艺流程 (1) 2.3.1发酵法 (1) 2.3.2发酵液的预处理 (2) 2.3.3赖氨酸的提取 (2) 2.3.4浓缩和结晶 (2) 2.4工艺技术指标及基础数据 (2) 2.4.1主要技术指标如下表： (2) 2.4.2主要原材料质量指标 (3) 2.4.3二级种子培养基 (3) 2.4.4发酵培养基 (3) 2.5赖氨酸发酵车间的物料衡算 (3) 2.6热量衡算 (1) 2.6.1发酵过程中的冷却水耗量计算 (1) 2.6.2发酵过程中的无菌空气耗用量的计算 (1) 第三章发酵车间设备设计与选型 (1) 3.1发酵罐的选型 (1) 3.1.1发酵罐容积和台数的确定 (1) 3.1.2主要尺寸的计算 (1) 3.1.3发酵罐冷却面积的计算 (1) 3.1.4发酵罐搅拌器的设计 (1) 3.2电机的确定 (1)
3.2.1 计算Re m (1) 3.2.2计算不通气时的搅拌轴功率P O (1) 3.2.3计算通风时的轴功率Pg (1) 3.2.4求电机功率P电 (1) 3.3发酵罐设备结构的工艺设计 (1) 3.3.1空气分布器 (1) 3.3.2档板 (1) 3.3.3密封方式 (1) 3.3.4 冷却管布置 (1) 3.3.5发酵罐设备材料的选择 (1) 3.4种子罐的选型 (1) 3.4.1种子罐容积和数量的确定 (1) 3.4.2种子罐主要尺寸确定 (1) 3.4.3种子罐型号确定 (1) 3.5赖氨酸提取的树脂设计 (1) 第四章防污措施 (1) 4.1废水的处理 (1) 4.3废渣的处理 (1) 第五章结语 (1) 参考文献 (1)
用多聚赖氨酸作载体制备IVM人工抗原的研究
兽医科技 收稿日期:2008-12-21;修回日期:2008-10-31 基金项目:中国农科院兰州畜牧与兽药研究所基金项目(MY JJ05-3) 作者简介:魏小娟(1976-),女,助理研究员,硕士. 用多聚赖氨酸作载体制备I VM 人工抗原的研究 魏小娟,张继瑜,张 梅,李剑勇,周绪正,李金善,牛建荣 (中国农业科学研究院兰州畜牧与兽药研究所中国农业科学院新兽药重点开放实验室,甘肃兰州730050)中图分类号:S852.4+ 3 文献标识码:B 文章编号:1004-7034(2009)01-0065-02 关键词:伊维菌素;人工抗原;多聚-L-赖氨酸 摘 要:采用N -羟基琥珀酰亚胺活性酯法和混合酸酐法,将伊维菌素(I V M )分别与多聚-L-赖氨酸(PLL)和卵清蛋白(OVA )连接制备人工免疫原5-O -(单)琥珀酰I V M -PLL 和包被原5-O -(单)琥珀酰I VM -OVA,经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析证实人工抗原合成成功。 伊维菌素(Lver m ecti n ,I V M )是大环内酯类杀虫、杀螨剂,由于其具有杀菌活性强以及杀菌谱广等特点已被广泛地应用于畜禽及水产养殖业,也是农业生产上广泛使用的一种杀虫剂。但此类药物在动物性产品中的残留严重影响到我国农产品的国际竞争力,同时也对人及环境存在潜在的威胁。 随着人们对I VM 残留的毒性及环境风险的日益关注,迫切需要简单、快速、高效的I V M 残留检测方法,但目前常用的H PLC 法检测的灵敏度较低,无法满足农产品中I V M 及其有毒代谢物的残留分析要求。为此,笔者根据I V M 的结构特点,采用N -羟基琥珀酰亚胺活性酯法和混合酸酐法将伊维菌素与载体蛋白偶联,成功地制备了伊维菌素完全抗原,为畜禽产品中伊维菌素残留的ELISA 检测奠定了基础。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 伊维菌素 白色粉末,有效成分含量>98%(其中B 1a 含量约为92%,B 1b 含量约为18%),浙江海正药业有限公司提供。1.1.2 主要试剂 牛血清白蛋白(BSA )、卵清蛋白(OVA )、多聚-L -赖氨酸(PLL)、乙基二甲氨基碳化二亚胺盐酸盐(EDC ),Sig m a 公司产品;二甲基甲酰胺(DMF )、咪唑、琥珀酸酐、吡啶,北京化工厂生产;N -羟基琥珀酰亚胺(NH S)、叔丁基二甲基氯硅烷(t-Bu M e 2S i-C l),天津化学试剂公司生产;硅胶GF254(200~400目),青岛海洋化工厂生产;羊抗兔I gG-HRP ,北京鼎国生物公司生产。1.1.3 主要仪器 透析膜(Sig m a)、Sartorious 电子天平、95-1型磁力恒温搅拌器、DDY -6B 型电泳 仪、凝胶成像系统及分析软件(Syngene 公司)。1.1.4 试验动物 新西兰成年白兔,体重1.7~2.0kg ,购自中牧集团兰州生物制药厂。1.2 试验方法1.2.1 半抗原5-O -(单)琥珀酰I V M 的合成 以C 5-OH 为反应位点,在无水吡啶的催化下进行反应。取0.1g I VM 加2.0m L 无水吡啶溶解,加入0.05g 琥珀酸酐,45e 、磁力搅拌下避光反应12h ,反应物在3.6%HC l 和乙酸乙酯间分配,收集酯层减压浓缩;用二氯甲烷复溶残留物,TLC 分离产物(GF 254,展开剂C H 2C 12B TH F B HAC (90B 9.5B 0.5),共有4个条带,Rf 分别为1.0,0.5,0.3,0.2;分别刮取4条带,以乙酸乙酯淋洗,收集洗脱液,减压浓缩,真空干燥。1.2.2 人工抗原的合成 免疫抗原5-O -(单)琥珀酰I V M -PLL 的合成(NH S 法):取12m g 半抗原5-O-(单)琥珀酰I V M,加0.4mL D M F 溶解,再依次加入2.7m g NH S 和4.7m g EDC -HC l 混合,20e 避光搅拌10h ,将上述反应液逐滴加至6mL 含20m g PLL 的硼酸盐缓冲液(0.2mm ol/L ,p H 值为9.4)-10%DM F ;溶液开始略显混浊,最后有少量沉淀出现,继续搅拌1h ,再转至4e 条件下搅拌12h,产物经PBS (0.01m o l/L ,p H 值为7.2)透析72h,Sephdex G -200纯化。 包被原5-O -(单)琥珀酰I V M -OVA 的合成(混合酸酐法):取10m g 5-O-(单)琥珀酰I V M,用1mL D M F 溶解,加入15L L 氯甲酸异丁酯,20e 搅拌45m i n ,制成A 液;称取30m g 的OVA 溶于10m L 0.2m ol/mL 硼酸盐缓冲液(pH 值为9.4)中制成B 液。将A 液逐滴加入B 液,边加边搅拌,之后在4e 搅拌反应12h ,然后将混合物装入事先处理并在0.01m o l/m L PBS(p H 值为7.4)中浸泡过夜的透析袋中,在4e 、0.01m o l/mL PBS(p H 值7.4)中透析3d ,每天换2次透析液。1.2.3 半抗原和人工抗原的结构鉴定 半抗原的结 65 5黑龙江畜牧兽医62009年第1期
ε-聚赖氨酸等4种食品添加剂新品种
附件1 ε-聚赖氨酸等4种食品添加剂新品种 一、ε-聚赖氨酸 英文名称：ε-polylysine 功能：防腐剂 （二）质量规格要求 1.生产工艺 由小白链霉菌( Streptomyces. Albulus)PD-1经过液体深层有氧发酵制得的食品添加剂ε-聚赖氨酸。 2.技术要求 2.1感官要求：应符合表1的规定。
附录 A 检验方法 A.1 安全警示 试验方法规定的一些试验过程可能导致危险情况。操作者应采取适当的安全和防护措施。 A.2 一般规定 本标准所用试剂和水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T 6682—2008中规定的三级水。试验中所用标准滴定溶液、杂质测定用标准溶液、制剂及制品，在没有注明其他要求时，均按GB/T 601、GB/T 602、GB/T 603的规定制备。试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时，均指水溶液。 A.3 鉴别试验 易溶于水，略带苦味。 A.4 ε-聚赖氨酸含量的测定 A.4.1 试剂和材料 A.4.1.1 硫酸钠溶液：0.30 mol/L。称取42.6 g硫酸钠溶解并定容至1000 mL，用乙酸调pH为4.0。 A.4.1.2 ε-聚赖氨酸标准贮备溶液：10.0 mg/mL。称取1.0 g ε-聚赖氨酸标准样品，溶解并定容至100 mL。 A.4.1.3 ε-聚赖氨酸标准溶液：1.0 mg/mL。移取10.0 mL ε-聚赖氨酸标准贮备溶液于100 mL容量瓶中，定容至100 mL。 A.4.2 仪器和设备 凝胶渗透色谱仪：配有紫外检测器。 A.4.3参考色谱条件 A.4.3.1凝胶柱：水相凝胶过滤色谱（7.8 mm ×300 mm）。 A.4.3.2检测温度：30 ℃。 A.4.3.3检测波长：210 nm。 A.4.3.4流速：0.5 mL/min。 A.4.3.5进样量：20 μL。 A.4.3 分析步骤 A.4.3.1 标准曲线的绘制 分别移取0.00 mL、5.00 mL、10.00 mL、15.00 mL、20.00 mL、25.00 mL ε-聚赖氨酸标准溶液至25 mL容量瓶中并定容，溶液经0.22 μm微孔滤膜过滤。打开色谱仪，并调至工作状态，待基线平稳后，依次将上述ε-聚赖氨酸标准溶液注 入凝胶柱中，进样量为20 μL，记录峰面积，以标准溶液中ε-聚赖氨酸的质量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。 A.4.3.2 试样测定 准确称取0.1 g试样，溶解定容至100 mL。配好的试样溶液经0.22 μm微孔滤膜过滤，进样量为20 μL，进行凝胶渗透色谱检测，记录峰面积，并根据标准曲线查得试样中ε-聚赖氨酸的质量。 A.4.4 结果计算 ε-聚赖氨酸含量的质量分数w，按公式（A.1）计算：
多聚赖氨酸溶液(10×PLL,1mgml)
多聚赖氨酸溶液(10×PLL,1mg/ml) 简介： 多聚赖氨酸溶液英文名为Poly-L-lysine Solution 简称PLL 。Leagene Poly-L-lysine 为Poly-L-lysine hydrobromide ，分子式为L-Lys-(L-Lys)n-L-Lys ?xHBr ，分子量为150,000～300,000，CAS Number 25988-63-0。 PLL 是一种粘附剂，常用于载玻片的包被,可以直接稀释后用于细胞或组织培养方面的实验。分子量大于70,000的多聚赖氨酸可以促进细胞贴壁生长，本产品可以用于促进细胞的贴壁生长和核酸杂交，制备好的载玻片可4℃保存半年。 组成: 操作步骤(仅供参考)： 1、 用于细胞培养 ①_x0001_ 根据实验需要Poly-L-lysine Solution 稀释至适当浓度溶液后即可使用。不同的细胞，Poly-L-lysine Solution 包被(Coating)的时间和浓度，甚至稀释液的选择有所不同，请自行参考相关文献进行适当的包被。 ②Poly-L-lysine Solution 用于细胞培养时，包被至少5min ，有些实验需要包被1～2h ，有些情况则需要包被过夜。 ③包被完成后，吸Poly-L-lysine Solution ，自然干燥培养器皿，至肉眼观察完全干燥。通风橱内吹风数分钟即可完成干燥，对于有些实验则需要干燥2h 或更长时间。干燥时间较长通常会更加有利于后续的细胞粘附。 ④进行细胞培养，也可以用水、PBS 或培养液等适当溶液润洗后再进行细胞培养。 2、 用于核酸杂交 ①_x0001_ 方法一：取事先准备好的载玻片或盖玻片经160℃冷却至室温，在Poly-L-lysine Solution 上下浸蘸几下，自然干燥，4℃备用，亦可室温保存1个月。 ②_x0001_ 方法二：Poly-L-lysine Solution 涂于玻片上，自然干燥后即可使用，可用于细胞涂片和切片。 ③_x0001_ 方法三：滴加5～10μl Poly-L-lysine Solution 至玻片上，用另一盖玻片以血涂片方法推片或用另一玻片紧贴于其上，相互摩擦以使两玻片相对的一面涂布上明胶包被溶液。 编号 名称 IH0091 IH0091 Storage Poly-L-lysine Solution(1mg/ml) 10ml 50ml -20℃ 避光 使用说明书
聚赖氨酸
聚赖氨酸说明 宁波北仑雅旭化工有限公司优质生产商，聚赖氨酸的厂家电话，聚赖氨酸的CAS号，聚赖氨酸的详细说明，聚赖氨酸最新报价，聚赖氨酸的价格，聚赖氨酸的作用，聚赖氨酸厂家总代理，聚赖氨酸厂家最新报价，聚赖氨酸的添加量，聚赖氨酸的分子式、聚赖氨酸的分子量。英文：polylysineCAS:25104-18-1。 聚赖氨酸是80年代发现的一种新型食品抑菌剂，它具有广谱抑菌性，能够抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和一些耐热性芽孢杆菌等，并且，安全性能高，可以用于多种食品的保鲜。聚赖氨酸在食品中多用于肉制品、高盐食品、快餐、色拉、蛋糕等食品的保鲜，而且保鲜效果较好，聚赖氨酸由于可以抑制酵母菌的增殖，并在中性和微酸性的PH值范围内，还能够很好地抑制其它微生物的生长，使其越来越多地用来改善食品的保存期，关于这方面的研究正在广泛进行。 性状：白色淡黄色粉末，吸湿性强，是赖氨酸的直接链状聚合物，能在人体内分解为赖氨酸，可以完全被人体消化吸收，不但没有任何毒副作用，而且可以作为一种赖氨酸的来源。它易溶于水，微溶于乙醇，但不溶于乙酸乙酯等有机溶剂。 应用范围：聚赖氨酸已于2003年10月被FDA批准为安全食品保鲜剂，被广泛应用于食品保鲜。在食品应用中，聚赖氨酸多与其它物质配合使用，如酒精、有机酸、甘油酯等。可用于米饭、糕点、面点、酱类、饮料、酒类、肉制品、罐头等的防腐保鲜。 主要用于各种蛋制品。醋酸制剂：添加体积分数O．5%～5．0%的醋酸，主要用于米饭，色拉等食品；甘油制剂：添加量为体积分数O．01%～5%，主要用于含有动物性蛋白乳蛋白较多的食品；甘氨酸制剂：添加量为质量分数0．01%一10%，和聚赖氨酸复合使用，协同抑菌效果更佳。
赖氨酸发酵工艺研究指导书
赖氨酸的发酵调控研究 一、实验目的 1、了解赖氨酸发酵常用的发酵菌种。 2、掌握L-赖氨酸发酵的工艺控制过程和方法。 3、能熟练运用发酵过程的基本原理，根据实验的不同要求，正确的设计实验方 案，并按照实验方案进行实验研究 二、实验原理 赖氨酸的生产方法有水解法(已淘汰)、合成法、酶法和直接发酵法。直接发酵法合成的赖氨酸是一种次级代谢产物。微生物合成赖氨酸是诱导物的诱导调节、自身产物的反馈调节、自身产物的分解调节、以及细胞膜透性的调节等次级代谢调节综合作用的结果。谷氨酸棒杆菌合成赖氨酸的自身产物调节作用如图1所示。 图1 谷氨酸棒杆菌合成赖氨酸的自身产物调节作用
三、材料与分析方法 1、菌种 谷氨酸棒杆菌（编号10065，中国微生物菌种保藏管理中心）。 2、培养基 （1）斜面培养基：牛肉膏1.1%，蛋白胨1.0%，葡萄糖0.5%，NaCl 0.5%，琼脂0.2%，pH7.0，在0.1Mpa压力下灭菌20min。 （2）种子培养基：糖蜜2.0%，豆饼水解液0.5%，(NH4)2SO4 0.4%，CaCO3 0.5%，K2HPO4 0.1%，MgSO4 0.04%，pH7.0,，于250mL三角瓶内装25mL种子培养基, 在0.1Mpa压力下灭菌20min。 （3）发酵培养基：糖蜜20%，豆饼水解液1.0%，玉米浆（氮源）0.6%，(NH4)2 SO4 2%，K2HPO4 0.1%，MgSO4 0.05%，FeSO4 0.2%，MnSO4 0.2%，pH7.0，于250mL三角瓶装液25mL发酵液，在0.1Mpa压力灭菌20min。 3、分析方法 （1）丝氨酸的测定 采用变色酸-分光光度法测定（见附录1）。 （2）赖氨酸的测定 发酵液中赖氨酸含量的测定采用茚三酮比色法，并加以改进。吸取发酵液4mL, 6000r/min离心10min去菌体及杂质。取上清液2mL，加茚三酮试剂（A液：茚三酮1.25g溶于94mL乙二醇甲醚中；B液：CuCl2·2H2O 1.97g溶于32mL 0.1mol/L柠檬酸溶液中；将A、B两液混合，用蒸馏水定容到250mL）4mL，混合，在沸水浴加热20min，冷却后测定475nm处的吸光度值，通过查赖氨酸标准曲线得知发酵液中赖氨酸的浓度。 （3）菌体形态观察、菌种培养特性和菌种主要生理生化特性检查 参照《工业微生物试验技术手册》的方法.。 （4）高丝氨酸脱氢酶活力的测定 从图1 可知，天冬氨酸半醛在高丝氨酸脱氢酶的作用下可以转化为丝氨酸，因此，本实验以一定反应条件下，单位时间内生成的丝氨酸的量所需的酶作为一个酶活力单位（U）1U=1ug/min。 ①粗酶液的制备 取5ml发酵液5500g离心15min，用pH 7.5的0.25mmol的Tris-HCL缓冲液洗涤两次，超声波破碎10min，10000g离心15min得上清液即为粗酶提取液；
多聚赖氨酸包被方法定稿版
多聚赖氨酸包被方法 HUA system office room 【HUA16H-TTMS2A-HUAS8Q8-HUAH1688】
Poly-lysine-coated tissue culture surfaces 1.To coat coverslips: Prepare a stock solution by dissolving 25 mg/ml polylysine in 4.73 ml water (both poly-L-lysine and poly-D-lysine are used to coat tissue culture surfaces; check specific protocol for choice of isomer) and filter sterilize through a 0.22-μm filter. Store in 100-μl aliquots at -20°C. When ready to use, dilute one aliquot in 40 ml water to prepare 13 μg/ml working solution. Sterilize coverslips by autoclaving prior to coating. Dip coverslips in the working solution, then incubate 15 min to several hours i n a humidified 37°C, 5% CO2 incubator. Allow surface to dry. 2.To coat culture dishes: 多聚赖氨酸包被培养皿/板 Prepare a stock solution by dissolving 100 mg poly-lysine in 100 ml water (both poly-L-lysine and poly-D-lysine are used to coat tissue culture surfaces; check specific protocol for choice of isomer) and filter sterilize through a 0.22-μm fil ter.
ε-聚赖氨酸的用途及研究进展
ε-聚赖氨酸的用途及研究进展 摘要：本文从ε-聚赖氨酸的发现、性质和用途、ε-聚赖氨酸产生菌的筛选和生物合成机理的研究、改造以及发酵生产做了简单介绍，让读者从以上几方面综合了解了ε-聚赖氨酸的各个用途和国内研究发展现状。 关键字：ε-聚赖氨酸、生物合成、用途、食品防腐、研究进展 1 引言 ε-聚赖氨酸的用途很广泛，例如可以作为广谱食品防腐剂，作为药物载体、作为细胞融合中的促融剂、作为人工合成抗原的载体、化妆品中的增白剂等。ε-聚赖氨酸作为食品防腐剂，具有广谱、高效、无毒、受pH值影响小等特点,这些特点是目前普遍使用的各种防腐剂所欠缺的,符合食品防腐剂的发展要求。 目前使用的食品防腐剂主要是人工合成防腐剂，找到一种抗菌谱广、高效、无毒、不受pH值影响的防腐剂是食品工业迫切需要解决的一个问题。 2 ε-聚赖氨酸的发现 1977年日本学者S.Shima和H．Sakai在从微生物中筛选Dragendo~Positive(简写为DP)物质的过程中，发现一株放线菌No．346能产生大量而稳定的DP物质，通过对酸水解产物的分析及结构分析，证实该DP物质是一种含有25—30个赖氨酸残基的同型单体聚合物，称为ε-多聚赖氨酸(ε- PL)。 ε-聚赖氨酸由赖氨酸单体组成，进入人体后可以完全被消化吸，不但没有任何毒副作用，而且可以作为一种赖氨酸的来源；另外，ε-聚赖氨酸的抗菌谱广，对革兰阳性和革兰阴性细菌、酵母、霉菌&、病毒等都有明显的杀灭作用；抑菌效率高，在浓度很低时就起作用；它还不受食品pH值的影响。ε-聚赖氨酸在日本已经作为食品防腐剂广泛使用，而在世界范围内也只有日本才有这种产品。 研究开发这种新型食品防腐剂具有十分重要的理论意义和应用价值。但是，从1977年发现ε-聚赖氨酸开始直到2002年为止对于菌种的筛选和生物合成机理的研究一直没有取得突破，尽管通过对菌种的诱变以及控制发酵条件，目前已经可以获得较高的ε-聚赖氨酸产量，但是这些研究都不是定向的。直到2002年以后，有关ε-聚赖氨酸产生菌的筛选，以及生物合成机理的研究才取得突破。
新型生物防腐剂——聚赖氨酸
新型生物防腐剂——聚赖氨酸 随着人们对食品安全性的认识和要求的逐步提高，化学防腐剂受到严峻挑战，食品防霉防腐剂的天然化已成为今后的发展趋势。天然防霉防腐剂是近年来国内外倡导、开发和寻求的新型产品，开发抗菌性强、安全无毒的天然防霉防腐剂已成为各国科技工作者的研究热点。它不但对人体健康无害，有的还具有一定的营养价值，是今后开发的方向。 ε-多聚赖氨酸是目前天然防腐剂中具有优良防腐性能和巨大商 业潜力的微生物类食品防腐剂。它是日本酒井平一和岛昭二两位博士在大量筛选有价值的放线菌时发现的一种新型聚合物，用由25～30赖氨酸残基聚合而成，经过进一步研究发现其具有强烈的抑菌能力，可以作为防腐剂用于食品的保鲜。 ε-多聚赖氨酸抑菌谱广，在酸性和微酸性环境中对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌均有一定的抑菌效果，ε-多聚赖氨酸对其他天然防腐剂不易抑制的革兰氏阴性的大肠杆菌、沙门氏菌抑菌效果非常好，而且其对耐热性芽孢杆菌和一些病毒也有抑制作用。 2003年HirakiJ等使用了ADME(最近几年，美国热电集团研制的新药毒性检测设备，集吸收、分布、代谢和排泄、毒性为一体)研究方法证实ε-多聚赖氨酸作为食品防腐剂的安全性。他们在老鼠体内对ε-多聚赖氨酸进行了一系列药物动力学和代谢途径的研究，以了解在老鼠的食物中添加高达50000mg/kgε-多聚赖氨酸的亚慢性及慢性饲养的生物检测中，没有毒理学影响的原因。对老鼠进行急性口服毒
性实验，发现ε-多聚赖氨酸实际是无毒的，口服量高达5g/kg时死亡率为0。 ε-多聚赖氨酸添加于食品中仅需微量就能奏效，且不会影响食品口味感，可做食品的天然保存剂。它天然安全，符合消费者的健康需求。在日本，利用ε-多聚赖氨酸作为食品保存剂的生产规模发展迅速，市场规模达数十亿日元。ε-多聚赖氨酸应用于糕点、面包食品中，能有效的抑制耐热性芽孢杆菌的增殖，延长保存期;应用于低糖低热量食品，如乳蛋白冰淇淋、奶油制品等，可改善其保存性;在低温软罐头食品中加微量ε-多聚赖氨酸可防止杀菌后产生异味;在冷藏食品中添加ε-多聚赖氨酸能起到保证质量的效果。 多聚赖氨酸作为抑菌剂在食品中使用时，通常与其它物质配合使用，以达到增效和经济的目的。常用的配合物质可分为五类：1、酒精，使用量为30～70%，主要应用于各种蛋制品。2、有机酸，常常使用的有机酸一般有：醋酸、苹果酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸等，使用量在0.5～50%之间，主要应用于米饭、饮料、色拉、酱类等食品;3、甘油酯，甘油酯多为低级脂肪酸酯，用量在0.01～5%之间，主要用于动物性蛋白，乳蛋白较多的食品。4、甘氨酸，用量为0.01～10%;主要应用于牛奶防腐。5、其它天然抑菌剂，如：鱼精蛋白、茶多酚等。 1989年日本窒素公司首先用生物技术方法工业生产聚赖氨酸，并允许在日本使用，以后韩国也允许作为食品添加剂使用。在美国和欧洲，主要是使用山梨酸作为防腐剂，最近，FDA已正式批准ε-多