分光光度法测定红发夫酵母中虾青素含量
一种从红法夫酵母提取虾青素的方法[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011052257.3(22)申请日 2020.09.29(71)申请人 自然资源部第三海洋研究所地址 361000 福建省厦门市思明区大学路178号申请人 厦门市科环海洋生物科技有限公司(72)发明人 单大鹏 邵宗泽 李旭 常有民 姜秋岺 阮斓 (74)专利代理机构 北京天盾知识产权代理有限公司 11421代理人 周东呈(51)Int.Cl.C12P 23/00(2006.01)C12N 1/06(2006.01)C12R 1/645(2006.01)(54)发明名称一种从红法夫酵母提取虾青素的方法(57)摘要本发明公开了一种从红法夫酵母提取虾青素的方法，具体步骤如下：摇瓶培养；发酵培养；红法夫酵母处理；提取虾青素粗液；重复提取；提纯虾青素。
本发明中通过在红法夫酵母培养的过程中添加前体物质和培养液，使酵母中含有的虾青素含量增加，从而使最终提取的虾青素增多，同时使用环状芽孢杆菌细胞壁溶解酶的方法对酵母进行虾青素的释放，能最大限度的将酵母的中虾青素提取出来，且在提取的过程中添加抗氧化剂，能提高虾青素的稳定性，同时该方法操作简单，产量高，实用价值很大。
权利要求书1页 说明书3页CN 112266945 A 2021.01.26C N 112266945A1.一种从红法夫酵母提取虾青素的方法，其特征在于，具体步骤如下：一、摇瓶培养：A.将活化后的红法夫酵母使用摇瓶培养的方法培养，进行扩大培养，得到种子培养液；B.所述摇瓶培养使用的摇瓶培养基由以下成分组成：葡萄糖8-10g/L、蛋白胨4-6g/L、麦芽汁2-4g/L、磷酸二氢钾1-3g/L、琼脂4-6g/L、硫酸镁0.5-1g/L；C.摇瓶培养环境为：温度保持在20-22℃，转速为120-180rpm，培养时间为1-2D；二、发酵培养：A.将步骤一中得到的种子培养液接种至发酵罐中进行发酵培养，得到大量酵母菌体；B.在发酵培养过程中加入培养液提供氮源；C.在发酵培养的过程中每隔5-10H加入定量的前体物质；D.发酵培养中使用的发酵培养基由以下成分组成：葡萄糖7-10g/L、酵母膏3-5g/L、蔗糖2-5g/L、磷酸钾0.5-1g/L、硫酸锌0.3-1g/L、硫酸镁0.2-0.8g/L、胡萝卜素2-5g/L、尿素2-4g/L、甘油0.5-1.5g/L和乙醇1-2g/L；E.发酵培养的环境：温度保持在22℃，转速为100-300rpm，培养时间3-4D；三、红法夫酵母处理：A.将发酵罐中的发酵液通过离心的方法收集发酵液中的菌体；B.将收集到的菌体中添加溶解酶，对其破壁处理；C.再将菌体混合液中加入有机溶剂和抗氧化剂，并使用离心法实现固液分离，液体即为虾青素粗液，收集；四、重复提取：重复步骤三中的操作，直至菌体混合液为透明为止，将收集的液体集中存储；五、提纯虾青素：将虾青素粗液喷雾干燥，使其内部的有机溶液和水挥发，得到虾青素粉。
天然虾青素分析方法的研究进展
天然虾青素分析方法的研究进展虾青素是一种特殊生理活性的物质，具有超强的抗氧化、抗衰老、抗癌、提高免疫力等作用。
近些年国内外在天然虾青素的分析方法上有了一定的进展，本文对薄层层析法、紫外光谱法，液相色谱法等分析方法进行了综述。
标签：虾青素；薄层分析；比光谱导数法；光镊拉曼光谱法；高效液相色谱法1前言虾青素是一种端基为酮基的类胡萝卜素色素，化学名称为3，3’-二羟基-4，4’-二酮基-β，β’-胡萝卜素，分子式为C40H52O4，又名虾黄素，虾黄质，龙虾壳色素，是一种非维生素A源类胡萝卜素。
虾青素不仅具有很强的抗氧化性、抗肿瘤及增强免疫的生理功能，而且拥有艳丽的红色及极强的色素沉积能力，国外已成功用于高档水产养殖[1]。
基于虾青素特殊的结构，分别在两端的环结构上存在手性中心，每个手性中心有两种构象，因此存在三种立体异构体，分别是左旋、右旋和消旋体[2]。
虾青素色泽为粉红色，具脂溶性，不溶于水，易溶于氯仿、丙酮、苯和二硫化碳等有机溶剂[3]。
动物实验表明，虾青素可以清除二氧化氮、硫化物、二硫化物，也可降低脂质过氧化作用，有效的抑制自由基引发的脂质过氧化。
另外，虾青素还具有很强的抑制肿瘤发生、增强免疫功能等生理作用[4]。
因而在食品添加剂、水产养殖、化妆品、保健品和医药工业方面有广阔的应用前景。
目前虾青素的主要来源是从水产品废弃物中提取、利用藻类和酵母生产[5]，因此研究快速、简便、准确的虾青素含量测定方法是十分必要的。
本文论述了薄层层析法、比光谱导数法、分光光度法、光镊拉曼光谱法、高效液相色谱法五种检测方法。
2虾青素的分析方法2.1薄层层析法薄层层析以其简单、廉价、快速、适用范围广的优点而成为天然藥物提取、分离过程中常用的检测、分析手段。
样品溶液用毛细管点在薄层板的一端，置密闭槽中，加入适宜溶剂为流动相。
由于毛细管原理，溶剂被吸上，沿板移动，并带动样品中各组分向前移动，这个过程称为展开。
由于各组分性质不同，移动距离不同，展开一定距离后，即得互相分离的组分斑点。
标准 虾青素 测定
虾青素的测定主要有分光光度法和高效液相色谱法两种方法。
分光光度法：这种方法主要是利用虾青素的最高吸收峰为478，因此在波长为478下进行比色即可测定虾青素的含量。
由于该种方法比较简单，可能存在的误差也较大，所以高效液相色谱法是检测虾青素的主流方法。
高效液相色谱法：这是一种分离效果好、灵敏度高、检测速度快的方法，是最为常见的虾青素检测方式。
例如，GB/T 31520-2015就规定了用液相色谱法检测红球藻中虾青素。
请注意，虾青素的测定方法具有一定的复杂性，需要专业的技术人员进行操作。
分光光度法测定红发夫酵母中虾青素含量
分光光度法测定红发夫酵母中虾青素含量
许培雅， 郑裕国， 沈寅初
（浙江工业大学 生物与环境工程学院， 浙江 杭州 & ） ! " " & ’
摘要： 建立了测定红发夫酵母胞内虾青素含量的前处理工艺及分光光度分析方法。其前处 理工艺一次提取率达+ 提取液在% 建立的分光光度法加标回收 # , ’ -， * ". / 处有最大吸收， 率为! 标准偏差为 " 表明该分析方法准确性高， 重复性 " " , ’ -! ! " % , ! -， , ’ ! - !" , % & -， 好， 且简便、 快速， 可以作为菌种筛选、 发酵条件优化过程中快速测定菌体中虾青素含量的 方法。 关键词： 分光光度法；红发夫酵母；虾青素 中图分类号： ； 0 * ! 1 2 # 1 ) , & 文献标识码： 3
：3N ! / & * # 2 * 7 E F . 8 A 7C IN M 7 : N / 7 . NT 7 I C M 7: P P : . U: .: . : H N 8 E : H: P P : I: P N : V : N F 8 .W 7 M 7 S 9: 9 9C U 7 P 8 . 7 U I M C /! " # % # & " ’ ( ’ ) + #T P 7 E N M C F C N C / 7 N M , Q F 7 7 M E 7 . N : 7 C I 7 V N M : E N 8 C . M 7 : E F 7 U B 9 X X 9 X B $ $ * + # , ’ -8 . N F 7 N 7 E F . 8 A 7 C I N M 7 : N / 7 . N T 7 I C M 7 : P P : , Q F 7/ : V 8 / A /: T P C M N 8 C . C I N F 7 P C H A N 8 C . H : S 9 X 9 ； " % , ! - : . UN F 7P N : . U : M UU 7 L 8 : N 8 C .8 P" , ’ ! - !" , 8 P % * " . /,Q F 7M 7 E C L 7 M P! " " , ’ - !! 98 % & -, Q F 7/ 7 N F 7 U 8 P P 8 / H 7 : . U: H 8 E : T H 7 N C: . : H P 8 P C I : P N : V : N F 8 . I M C /! " # % #& " ’ ( ’ ) + # X X X 9 $ $ * 8 . N F 7 I 8 H N M : N 8 C .C I/ A N : . N P N M : 8 .: . U N F 7 C N 8 / 8 R : N 8 C .C I I 7 M / 7 . N : N 8 C .E C . U 8 N 8 C . , X ： ； 3 1 ( 5 & P 7 E N M C F C N C / 7 N M " # % #& " ’ ( ’ ) + #； : P N : V : N F 8 . X X 9 ! $ $ * %4
虾青素分析测定方法的研究
虾青素分析测定方法的研究【摘要】选择分光光度法及高效液相色谱法对测定虾青素的分析条件进行研究，从而得出最佳的测定条件。
用分光光度法和高效液相色谱法测定虾青素，标准曲线的回归方程的r2都超过了0.99。
用分光光度法测定虾青素，回收率范围为99.3-101%，相对标准偏差rsd值为0.78-1.3%；用液相色谱法测定虾青素，回收率范围为100-102% ，相对标准偏差rsd为0.62-1.4%。
这些值都在定量分析所要求的阈值范围内，可以用于定量分析。
【关键词】分光光度法；高效液相色谱法；虾青素abstract： choice two based on the spectrophotometry and high performance liquid chromatography (hplc) were developed for determination the astaxanthin. and the optimum conditions was investigated in detail. the total amount of astaxanthin was measured by spectrophotometry, the recoveries were in the range of 99.3-101%, and rsd were in the range of 0.78 %-1.3 %. also the astaxanthin was determined by hplc, and the recoveries were in the range of 100% -102%, rsd were in the range of 0.62%-1.4%. all these values were within the range of permissive threshold value on quantitative analysis, which showed that it’s feasible for measuring the content of astaxanthin by these two methods.key words: spectrophotometry；hplc；astaxanthin从动植物及菌类中提取虾青素目前还处于实验研究的基础阶段，要实现产业化生产虾青素，还必须对其提取工艺进行广泛深入的研究。
实验二 法夫酵母细胞中虾青素的提取及含量的测定
实验二、法夫酵母细胞中虾青素的提取及含量的测定一、实验目的与要求1．学习细胞破碎的原理与方法；2．学习与掌握有机溶剂萃取的原理与方法。
二、实验材料与试剂1．供试菌株法夫酵母菌液。
2．实验材料50mL塑料离心管，Φ5mm玻璃珠，离心管架。
3．实验仪器振荡器，水浴锅，离心机，分光光度计。
4．类胡萝卜素总量的分析方法酵母细胞经过破壁后得到的细胞碎片用丙酮提取，测定其OD475（A）。
并转化成色素含量。
计算公式如下：发酵液总类胡萝卜素质量浓度(μg/mL)=(A*V)/(E*V0 )细胞总类胡萝卜素含量(μg/gCDW)=(A*V)/(E*G)式中： A —吸光度读数；V —萃取液体积数，mL；E —消光系数，0. 16；V o—吸取的酵母定容液的体积，mL；G —发酵液的细胞干重（CDW），g。
5．菌体生物量的测定方法：吸取4mL的发酵液，3000rpm离心10min，等量蒸馏水洗涤一次，80℃烘干至恒重。
6．HPLC测定虾青素的含量准确称取经冷冻干燥的25mg法夫酵母细胞，加入56℃二甲亚砜（DMSO）6mL振荡10min，加6mL丙酮振荡2min，加入6mL 20%NaCl溶液，然后加入18mL混合萃取溶剂正己烷/乙醚(1: 1)振荡1min后，5000rpm离心5min，旋转蒸发浓缩上层红色液体至溶剂消失后，先用少量氯仿溶解颗粒物，移至25mL的容量瓶中并用流动相定容。
精密称取5mg 虾青素（Sigma公司）标准品，少量氯仿溶解后用流动相制成0. 02 mg/mL的标准溶液进行进样。
按外标法计算。
色谱条件：色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18：5μm，4.6×250mm；流动相：甲醇:乙腈= 9:1；流速0.8mL/min；检测波长475nm；柱温为室温，进样量为20μL。
三、实验内容1．自溶法：准确吸取4mL菌液，3000r/min离心3min后弃上清，水洗一次，沉淀加入4%的NaCl 4mL，作为质壁分离剂，水浴控制温度为55℃，自溶1h后，3000rpm离心3min，即得破壁的酵母细胞，再加入8mL丙酮萃取色素，振荡2min，3000rpm离心3min，上清以丙酮作空白测OD475。
高产虾青素的红发夫酵母菌株进化工程研究的开题报告
高产虾青素的红发夫酵母菌株进化工程研究的开题报告一、研究背景和意义虾青素是一种天然的色素，属于类胡萝卜素，并且具有很高的生理活性。
在医学、保健品、美容美发、化妆品等领域有广泛的应用。
目前，虾青素主要来源于虾、龙虾等海洋生物或合成。
其中合成方法的成本相对较高，且存在部分半合成过程，导致纯度和产量无法完全满足市场需求。
相比之下，从天然来源中提取虾青素的方法生产成本较低，但是其受到时间、环境的限制，产量不可控。
红发夫酵母菌属于一种产生类胡萝卜素的微生物，可以在发酵过程中产生大量的虾青素。
其在发酵过程中的高产静态水平、灵敏性广、培养条件简单、无需繁琐操作，因此被广泛地研究。
通过进化改良可以提高微生物的虾青素生产能力，因此，对红发夫酵母菌株的进化改良研究有着重要的意义。
本研究旨在利用红发夫酵母菌株进行虾青素的高产，探究其进化改良的途径，以期能够获得更高的虾青素产量。
二、研究内容和方法1. 红发夫酵母菌株的筛选：从自然环境中分离出不同来源的红发夫酵母菌株，对其进行初步的鉴定和对比试验，并选择其中虾青素产量较高的菌株作为后续研究对象。
2. 进化改良方法的建立：通过体外化学诱变技术和自然筛选技术建立进化改良体系。
在此基础上，对产量较高的红发夫酵母菌株进行细胞物质组分分析，进一步明确其关键代谢途径及调控机制。
3. 进化改良的实验设计：通过在不同培养条件（如温度、pH值、碳源、氮源等）下，定期对红发夫酵母菌株进行连续发酵和间歇发酵的实验，对虾青素产量进行监测，以寻找最适合产量的培养条件。
4. 虾青素的提取和分离：对红发夫酵母菌株进行优选，并分离取得纯度较高的虾青素，通过超高效液相色谱仪、紫外可见分光光度计、红外线光谱仪等对虾青素进行鉴定和定量。
三、研究预期结果通过对红发夫酵母菌株进行进化改良，筛选出高产虾青素的菌株，并优化培养条件，进一步提高虾青素产量，达到较高程度的工业化生产。
本研究对虾青素的生产与应用领域具有重要的研究价值和应用价值。
红酵母色素的初步分离与鉴定
中图分类号： TS202.3;文献标识码：A; 文章编号: 1007-2764(2003)04-0036-12红酵母色素的初步分离与鉴定吕晓玲 张亮 张坤生 姚秀玲（天津科技大学食品科学与生物工程学院，天津300222）摘 要：本文利用薄层层析法、分光光度法以及HPLC 法对红酵母中的色素成分进行分离和初步鉴定，共分离出的四种组分，其中组分4可能是β-胡萝卜素，2和3可能是类胡萝卜素中的紫菌红素和γ-胡萝卜素，组分1属于非类胡萝卜素。
关键词：红酵母色素;薄层层析（TLC ）;分光光度法;高效液相色谱法（HPLC ）酵母菌是以芽植为主，形态结构比较简单的一类真菌。
红酵母属(Rhodotorula Harrison)属于半知菌亚门[1], 红酵母可产生类胡萝卜素、圆酵母素（torulene ）、红酵母红素（torularhodin ）及少量的β-胡萝卜素[2]。
其中酵母红素为可与蛋白质结合的类胡萝卜素，其结构与β-胡萝卜素极其相似。
目前发现产类胡萝卜素的酵母有两个属：普法夫酵母属（Phaffia ）和红酵母属（Rhodotorula ），前者以产虾青素为主（Phaff ，1976）；后者产β-胡萝卜素、酵母红素等多种类胡萝卜素。
类胡萝卜素是一类有广泛应用价值的天然色素。
细菌、霉菌和酵母菌形成类胡萝卜素都有报道，但其中酵母菌生产类胡萝卜素有许多其他工业微生物无法比拟的优点，它发酵周期短，产量高，菌体含有丰富的蛋白质、氨基酸和维生素等，色素提取后其菌体下脚料还可作为饵料、饲料加以综合利用。
因此，许多国家都在竞相开发研究。
国内外很多文献都报道了利用红酵母生产β-胡萝卜素以及红酵母中色素的提取方法，关于色素组成分析，至今未见报道，本文采用薄层层析、分光光度法以及HPLC 法对其色素成分进行了分析。
1 材料和方法实验原料红酵母发酵液（由天津科技大学食品科学与生物工程学院现代酿造技术研究室I 提供） 主要试剂和仪器β-胡萝卜素（Merk ）；其余试剂均为国产分析纯。
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分光光度法测定红发夫酵母中虾青素含量
许培雅;郑裕国;沈寅初
【期刊名称】《浙江工业大学学报》
【年(卷),期】2001(029)002
【摘要】建立了测定红发夫酵母胞内虾青素含量的前处理工艺及分光光度分析方法。
其前处理工艺一次提取率达96.2%，提取液在480nm处有最大吸收，建立的分光光度法加标回收率为100.2%～104.1%，标准偏差为0.21%～0.43%，表明该分析方法准确性高，重复性好，且简便、快速，可以作为菌种筛选、发酵条件优化过程中快速测定菌体中虾青素含量的方法。
【总页数】5页(P120-123,135)
【作者】许培雅;郑裕国;沈寅初
【作者单位】浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江杭州 310032;浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江杭州 310032;浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江杭州 310032
【正文语种】中文
【中图分类】Q815;O657.3
【相关文献】
1.50L和500L反应器培养红发夫酵母产虾青素的研究 [J], 朱晓立;梁世中
2.红发夫酵母中3R,3'R-虾青素的分离纯化和结构鉴定 [J], 孙伟红;林洪;翟毓秀;冷凯良;邢丽红
3.溶氧及植物激素对红发夫酵母生长与虾青素合成的影响 [J], 潘雪珊;戴凌玫;卢英华;凌雪萍
4.生物素对红发夫酵母生长和虾青素积累的影响 [J], 朱明军;梁世中
5.红发夫酵母生成的虾青素对北京鸭生长、抗氧化性能及肉质的影响 [J], 黄靓(译);朱勇文(校)
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