6第六章基因克隆操作过程
第六章 重组DNA导入受体细胞
根据基因转移方法的特性，重组DNA导入受体细胞的 方法有以下几种： •转化：将重组质粒导入受体细菌细胞，使受体细菌遗传 性状发生改变的方法； •转染：将携带外源基因的病毒感染受体细胞的方法（磷 酸钙沉淀法与体外包装法）； •微注射技术：将外源基因直接注射到真核细胞内的方法； •电转化法 •基因枪技术：又称微弹技术或高速离子轰击法； •脂质体介导法 •其他方法：快速冷冻法、碳化硅纤维介导法。
CaCl2使细菌发生休克后，立即进行转化（E.coli X1776
可长期冷藏，并保持其摄取DNA的能力）。 也可以采用Rb+、Mn2+、K+、二甲基亚砜、二流苏糖
醇（DTT）等制备感受态细胞。
CaCl2制备感受态细胞的一般过程：
•E.coli 接种于LB agar培养基，37℃培养一晚；
•挑选3-5个大菌落，接种于50ml LB培养基，37 ℃振摇培 养一晚后，在A550测定，要求细菌繁殖一定量（一般为对 数生长期）；
以病毒（噬菌体）为载体，转染宿主细胞的方法主 要有磷酸钙沉淀法和体外包装转染法。 一、磷酸钙沉淀法
磷酸钙沉淀法（磷酸钙-DNA共沉淀法），它能把外 源基因与λ噬菌体DNA的重组子导入大肠杆菌和哺乳动物 细胞，但转染效率仍不如体外包装法。
细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA（吞噬DNA-磷酸 钙复合颗粒）的能力，几乎所有的双链DNA都可以通过这 种方法导入细胞。
第六章重组dna导入受体细胞????????????外源基因与载体在体外连接成重组体dna分子后需要将其导入受体细胞进行扩增和筛选得到大量单一的重组体分子这就是外源基因的无性繁殖即
第六章 重组DNA导入受体细胞
内容提要
•克隆与导入方法 •转化 •转染 •共转化 •电转化 •基因枪法 •微注射技术 •脂质体导入法 •转化酵母菌 •植物细胞的基因转移方法 •哺乳动物细胞基因导入法 •反转录病毒载体的转染
简述基因克隆主要过程
简述基因克隆主要过程
基因克隆是指将一个特定的基因从一个生物体中复制并插入到另一个
生物体中的过程。
这个过程可以分为以下几个步骤：
1. DNA提取：从源生物体中提取所需基因的DNA。
2. 切割DNA：利用限制性内切酶将DNA切割成多个片段，其中包括所需基因。
3. 载体构建：选择适当的载体（如质粒），并在其上构建所需基因的
复制序列和表达元件。
4. 连接DNA：将切割后的DNA片段与载体连接，形成重组DNA。
5. 转化宿主细胞：将重组DNA转化到宿主细胞中，使其能够表达所
需蛋白质。
6. 筛选克隆：通过筛选，找到含有所需基因的克隆，并进行进一步鉴
定和分析。
在这个过程中，需要注意许多细节问题，如选择合适的限制性内切酶、
优化转化条件、设计合适的筛选方法等等。
同时，在实验过程中也需要遵守相关法规和伦理规范。
基因克隆的顺序
基因克隆的顺序
基因克隆的顺序通常包括以下步骤：
1. 选择目标基因：确定需要克隆的基因，可以是某个特定的基因，也可以是一段DNA序列。
2. 提取DNA：从源生物体中提取目标基因的DNA，通常使用DNA提取试剂盒来提取。
3. 制备质粒：选择一个适当的质粒，将其准备好作为目标基因的载体。
质粒通常是一段环状的DNA分子，可以自复制并在细胞中稳定存在。
4. 执行DNA切割：使用限制性内切酶将目标基因和质粒切割成相应的DNA片段。
内切酶是能够识别特定DNA序列并在其特定的位置进行切割的酶。
5. 连接DNA片段：将目标基因的DNA片段与质粒的DNA片段连接起来。
这可以通过DNA连接酶来实现，DNA连接酶能够催化两个DNA片段的连接。
6. 转化宿主细胞：将连接好的质粒转化到宿主细胞中，通常使用细菌作为宿主细胞。
转化可以通过电穿孔、化学方法或热激转化等方式进行。
7. 筛选重组细胞：利用筛选性培养基或标记基因等方法筛选出含有重组质粒的
细胞。
8. 纯化重组质粒：从筛选出的重组细胞中提取重组质粒。
9. 分析重组质粒：对提取出的重组质粒进行测序、限制性酶切等分析，确认克隆基因的准确性。
10. 表达目标基因：如果希望表达克隆的基因，可以将重组质粒转化到表达宿主细胞中，例如真核细胞或类似细胞。
需要注意的是，基因克隆的具体步骤可能会因实验目的、实验方法和克隆体的复杂性而有所不同。
克隆基因的操作流程
克隆基因的操作流程
克隆基因是一种基因工程技术，它可以将感兴趣的基因从一个生物体中复制到另一个生物体中。
克隆基因的操作流程包括以下几个步骤：
1. 选择目标基因：首先需要确定感兴趣的基因，这个基因可以是任何生物体中的基因，如人类、动物、植物等，也可以是一种人工设计的基因。
2. 剪切DNA：通过限制性内切酶，将目标基因从DNA分子中切割出来。
这些切割出来的DNA片段被称为限制性内切片段。
3. 连接载体：将目标基因插入到载体DNA中。
载体是一种DNA 分子，可以承载基因并将其引入到目标生物体中。
在这个步骤中，需要使用一种酶来将目标基因和载体DNA连接起来。
这个过程被称为“重组”。
4. 转化宿主细胞：将重组后的载体DNA转化到宿主细胞中，使宿主细胞能够表达目标基因。
5. 筛选：筛选出表达目标基因的宿主细胞。
这个步骤可以通过一些特定的实验方法来实现，如PCR、Southern blotting等。
6. 验证：验证目标基因是否被正确地插入到宿主细胞中，并且是否表达出来。
通过这些步骤，就可以成功地克隆基因了。
克隆基因技术在医学、农业、工业等领域中有着广泛的应用，可以用来生产新药、改良农作物品种、生产高效酶等。
基因克隆、假病毒操作步骤
实验名称：基因克隆实验器材:荧光定量PCR仪、摇床、离心机、生工PCR产物纯化试剂盒、恒温加热器、NEB连接体系、灭菌纯水、JM109感受态、冰、LB培养基、酒精灯、涂棒、氨苄、氨苄抗性平板、甘油等；操作步骤：1、可通过PCR进行拼接获得目的基因的，过柱纯化（生工试剂盒根据说明书进行纯化，在最后一步的洗脱可以用预热的灭菌纯水洗脱，在加灭菌纯水洗脱的时候一定要加在纯化柱子的膜中间）；2、选择合适的载体（EZ-T）用连接酶进行连接，NEB体系，16℃过夜连接T4lages 1.010×T4buffer 2.0EZ-T 1.0目的基因8.0DdH2O 8.0＿＿＿＿＿＿＿＿＿20ul3、取100µl摇匀后的JM109感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作），加入10µl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42度水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min；4、加入500µl LB液体培养基，混匀于37℃振荡培养45min使受体菌恢复正常生长状态并使转化体产生抗药性；5、将恢复培养的菌体5000rpm离心3min，移去上层LB培养基，用余下的200µl重悬菌体，并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面（氨苄抗性），37℃倒置培养12~16小时；6、挑取多个单克隆菌落分别接种到1ml含有抗生素（氨苄）的LB液体培养基中，37℃振荡培养3h；7、培养1-2小时即可以利用PCR（定量或定性）进行鉴定；8、选取初步鉴定阳性的菌液送测序，测序正确后甘油保存（甘油的浓度为30%-50%），充分混匀，-80℃保存；实验名称：假病毒的制备实验器材：荧光定量PCR仪、摇床、离心机、生工小剂量抽提试剂盒、生工胶回收试剂盒、恒温加热器、NEB连接体系、灭菌纯水、冰、LB培养基、氨苄、卡那、卡那抗性平板、甘油等；操作步骤：1、选取测序结果正确的菌种以1：100 的比例接种到含氨苄（1：1000）的5ml LB 培养基中过夜培养中，37℃，200r/min；2、收集菌体抽提质粒，用生工小剂量抽提质粒试剂盒跟据说明书进行抽提，在抽提过程中要注意防污染（在最后一步的洗脱可以用预热的洗脱液洗脱，在加洗脱液的时候一定要加在纯化柱子的膜中间）；3、用抽提好的质粒做双酶切用NEB公司的体系，同时做一管PET28-MS2的双酶切20ulBamH 1 2.5ul BamH 1 1.0ul HindIII 2.5ul HindIII 1.0ulBSA 5.0ul BSA 2.0ulBuffer2 5.0ul Buffer2 2.0ul产物20ul PET28-MS2 8.0H2O 15ul H2O 15ul＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿50.0 ul20.0ul37度3小时，4、配置1%的大空胶，将双酶切产物跑胶，割胶（在割胶的时候要注意产物不要在紫外灯光下暴露太久），用生工胶回收试剂盒进行回收根据说明书进行纯化；PET28-MS2直接用生工PCR产物回收试剂盒进行纯化；5、将回收好的酶切产物进行连接用NEB的连接体系，16℃，过夜连接T4lages 1.0ul10×T4buffer 2.0ulPET28-MS2 4.0ul目的片段8.0ulDdH2O 6.0ul＿＿＿＿＿＿＿＿＿20ul6、取100µl摇匀后的BL21感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作），加入10µl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42度水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min；7、加入500µl LB液体培养基，混匀于37℃振荡培养45min使受体菌恢复正常生长状态并使转化体产生抗药性；8、将恢复培养的菌体5000rpm离心3min，移去上层LB培养基，用余下的200µl重悬菌体，并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面（卡那抗性），37℃倒置培养12~16小时；9、挑取多个单克隆菌落分别接种到1ml含有抗生素（卡那）的LB液体培养基中，37℃振荡培养，培养1-2小时即可以利用PCR（定量或定性）进行鉴定；10、选取初步鉴定阳性的菌液送测序，测序正确后甘油保存（甘油的浓度为30%-50%），充分混匀，-80℃保存；11、选取测序结果正确的菌种以1：100 的比例接种到含卡那霉素的5ml LB 培养基中过夜培养，37℃，200r/min；12、将1ml 过夜培养的菌液接种到100ml 含卡那青霉素的LB 培养基中，37℃，200r /min 振荡培养4 -6h 至OD 600值大约在0.6-0.8；13、加入终浓度为1mmol/L (IPTG)，在37℃条件下，200 r /min诱导表达16h；14、10,000 rpm，4℃，离心10min，收集菌体，加入1×超声buffer 5 ml重悬菌体；<摇床一小时>15、超声处理：置于冰上超声，功率300W，超声时间2<5>s，间隔时间3<5>s，全程3min，超声12<10>个循环；16、将破碎完全的表达产物12,000 rpm，4℃，离心30min，沉淀细胞碎片，收集上清到另一干净的离心管中，得到含病毒样颗粒的表达产物，分装保存-80℃保存；17、将得到的病毒样颗粒的双酶消化验证实验分别取4 份用NEB公司的DNaseI、生工的RNaseA 进行消化37℃消化1h-2h18、1.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶消化结果；19、去第1次消化产物进行第2次消化37℃1h-2h（用NEB公司的DNaseI）DNaseI 40ul10×DNaseIBuffer100ul消化产物10ulTE 850ul＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿1ml20、DNaseⅠ消化后，加入终浓度为5mM的EDTA终止反应，然后65度10分钟使DNaseⅠ失活；21、提取RNA标本后上荧光定量，检验病毒颗粒的浓度和质粒的消化情况。
简述基因克隆的基本过程
简述基因克隆的基本过程
基因克隆是指利用生物学技术进行繁殖某一抗原性基因组片段实现基因复制的过程。
主要由下面几个步骤组成：
一、启动物获取：
1. 从细胞中分离出DNA片段；
2. 使用酶切技术将DNA片段的‘钩子’附加到对应的载体上；
二、基因克隆扩增：
1. 把完美结合的细菌进行培养，促进DNA分子的复制；
2. 使用克隆抗体来处理载体以防止它们散发；
三、基因克隆分离：
1. 使用特定的限制酶进行裂解，将前面复制的DNA分离出来；
2. 使用水和石蜡将克隆体分离；
四、基因克隆实验：
1. 实验研究克隆DNA片段表达的基因；
2. 用PCR微量实验研究克隆体的表达水平；
五、基因突变：
1. 对克隆的DNA片段进行诱变；
2. 使用嵌合子技术将变异的片段插入到载体中；
六、基因表达检测：
1. 检测新插入的基因是否有正常表达；
2. 研究新基因对于抗性或者功能的影响；
七、生成抗原性基因组片段：
1. 用PCR实验研究整个新基因的表达水平；
2. 使用基因合成技术进一步改善新基因的特性；
基因克隆技术的应用有很大的广度，能够有效地增强病原体与病毒的抗体力，提升受抗原抗药的抵抗力，为生物科学的发展提供更多的研究材料。
基因克隆的基本原理和流程
基因克隆的基本原理和流程
基因克隆是一种技术，它使用质粒或DNA片段来复制一个特定的基因序列。
这种技术可以被用来产生大量相同的基因，以改变物种的表型特征，也可以用来研究有关基因的功能、结构和表达的有关信息。
基因克隆的基本原理是使用一种叫做酶切的酶，通过限制性内切酶将DNA片段分割成较小的片段，然后使用DNA 聚合酶将它们连接在一起。
这样，就可以生成几乎完全相同的DNA序列。
基因克隆的流程可以分为三个主要步骤：
1. 提取DNA：首先，由于想要克隆的基因位于一个细胞上，所以必须提取该细胞中的DNA。
常见的提取方法有水解法和溶剂提取法，其中水解法主要通过分解细胞壁和细胞质来提取DNA。
2. 克隆：其次，在提取出DNA后，使用限制性内切酶将DNA分割成较小的片段，然后使用DNA聚合酶将它们连接在一起。
3. 将克隆的DNA植入宿主：最后，将克隆的DNA植入一个宿主细胞，使其可以在宿主体内进行表达。
这里，一般会使用一种叫做质粒的DNA载体，它可以将克隆的基因植入宿主细胞中，从而使细胞获得克隆的基因。
基因克隆是一个复杂的流程，其中包括对基因的提取、克隆和植入宿主体等步骤，而且要完成克隆，还需要使用一系列不同的技术和工具，如限制性内切酶、DNA聚合酶和质粒等。
基因克隆技术在生物学、医学和农业等领域都有着重要的应用，它们已经成为研究基因功能、结构和表达的重要工具。
高中生物 第六章基因重组与基因工程
第六章基因重组与基因工程教学大纲要求1.熟悉基因工程、基因文库、载体、限制性核酸内切酶、PCR等概念；2.掌握以质粒为载体进行DNA克隆的基本过程；3.了解重组DNA技术在医学上的应用。
教材内容精要一、自然界的基因转移和重组自然界不同物种或个体之间的基因转移和重组是经常发生的，它是基因变异和物种演变、进化的基础。
基因重组的方式有：接合作用、转化、转导、转座。
1．接合作用(Conjugation) 当细胞(细菌)与细胞(细菌)相互接触时，质粒DNA就可从一个细胞(细菌)转移到另一个细胞(细菌)。
2．转化与转导作用(1)转化作用(Transformation)：由外源性DNA导入宿主细胞，并引起生物类型改变或使宿主细胞获得新的遗传表型的过程，称为转化作用。
(2)转导作用(Transduction)：当病毒从被感染的(供体)细胞释放出来，再次感染另一(受体)细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组称为转导作用。
3．转座(转位)(Transposition) 可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。
故由插入序列和转座子介导的基因转移或重排称转座。
转座是指一个或一组基因从一个位置转到基因组的另一个位置。
可分为插入序列(insertionsequenceIS)转座和转座予(transposons)转座。
4．基因重组不同DNA分子间发生的共价连接称基因重组。
基因重组有两种类型：位点特异的重组(sitespecial recombmatlon)和同源重组(homologous recomblnation)。
二、重组DNA技术’1．重组DNA技术的相关概念(1)DNA克隆：克隆(Clone)就是来自同一个体的相同的集合。
DNA克隆（DNA clone）：应用酶学方法在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的重组DNA分子，通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，提取获得大量同一DNA分子的过程。
第6章目的基因的分离克隆(植物基因工程)课件
12
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14(2) 如何从cDNA中找到所需要的基因？15转录水平上的基因克隆方法
l 差别杂交筛选 l 扣除杂交 l 代表性差别分析 l 差异显示 l cDNA阵列杂交 l 基因表达系列分析 l 抑制差减杂交
筛选目的基因(核酸探针法、免疫结合法)因库应当能包括全部的基因组序 列。如果每一个克隆包括的DNA片段大，则总 克隆数目少，常选择能接受较大片段的载体。 令检测是否包括一个完整的基因组序列的公式：
令例:人类基因组3.0x106kb, 以λEMBL作载体， 插入片段的平均长度为17kb ，p为99%时, 基因 库应有8.1x105 个 重组噬菌体。
21
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n基于EST信息的基因克隆
EST
23
由杨树EST库获得基因序列
PCNA
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克隆的核酸酶
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26
2、基因组水平上的克隆
将ry) ：将某种生物的基因组DNA切割成 一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进 行克隆。这些存在于所有重组
➢差别杂交筛选
含有表达 目的基因
不含有表 达目的基因cDNA 铺平板转膜 转膜提取分离 mRNA
cDNA 探针
提取分离 mRNA
cDNA 探针
比较 分析
用对照样品cDNA作探 针杂交的X光片中没有 而在检测样品cDNA作 探针杂交的X光片中有 的印斑，可对照X光片 从原平板挑出菌落进行 鉴定是否含有目的基因
31
菌落杂交技术寻找目标DNA克隆
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文 库 的 抗 体 筛 选
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(2) T-DNA标签克隆基因
基因克隆 操作步骤原理及注意事项
一：提质粒1：提取ml的菌液放到EP管中，12000r/s 30s离心，去除菌液，加入100微升的TE 振荡混匀后加入200微升裂解液二，轻轻混匀，是使细胞破碎，同时使蛋白变性和保持其高碱性，再加入150裂解液三轻轻混匀是鞋包裂解开（最佳的效果是上层是蛋白，下层是透明的液体），离心10min，将液体转移到另一个EP管中，加入等体积的异丙醇，静置10min或更长（一般以析出的DNA为主蛋白次之），离心10min 12000rpm/s ，除去上清液，加入400微升的70%的乙醇洗（去除里面的有机溶剂，同时使DNA 沉淀），去除乙醇，室温下开口放置5-10min或放到烘箱中使乙醇挥发干，再加入20微升的水，跑胶看浓度溶液I：Tris-Cl控制PH；葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉，抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
溶液II：NaOH裂解细胞的作用；SDS主要是变性蛋白，也有溶解细胞的作用。
溶液III：3 M 醋酸钾钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。
SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，同时大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了；2 M 醋酸中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。
25/50酚+24/50氯仿+1/50异戊醇的作用：酚抽提蛋白的作用；氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。
乙醇---100%沉淀质粒的作用；70%洗质粒去离子的作用；RNase水：消化所提质粒中的RNA。
2：消化补到50微升体系，再加入5微升的RNase 放入37℃ 2-3个小时3：抽提加入150微升的TE补到200微升体系加入100微升的氯仿 100微升的苯酚充分混匀 12000rpm/s 10min 离心将上层液体转到新EP管中再像其中加入200微升的氯仿充分混匀，12000rpm/s 离心，取上层液体到新EP管中，加入1/4体积的5mol/L的NaCl 两倍体积的无水乙醇，放入-20℃ 3小时沉降后离心 12000rpm/s 10min ，70%的乙醇洗干，再晾干或烘干加20微升的水跑胶检测补充：酚氯仿法提取DNA的原理用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。
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2016/7/2
基因克隆操作过程
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试剂的质量
所用的试剂，如CaCl2 等均需是最高纯度的，并用超纯水配制（过滤除 菌，非高压灭菌），最好分装保存于干燥的冷暗处（冰箱4℃）。
防止杂菌和杂DNA的污染
整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿 如离心管、枪头等最好 是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它 试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选和鉴定带来不必要的麻烦。
Takara网站提供的同尾酶信息
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基因克隆操作过程
13
5'
TGATCA ACTAGT
5' 5'
GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
5'
BclI
5' T 5' GATCA ACTAG 5' T
BamHI
5' GATCC G G CCTAG 5'
5'
退火
获得连接方向 不同的两种产物 需要鉴定目的 基因的连接方向 目的产物中对 应位置的序列不 再是原来的酶切 位点
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基因克隆操作过程
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提高转化效率的几个重要因素：
细胞生长状态和密度
不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从-70℃或20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养 液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时，细胞密度 在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同)，这时比较合 适。密度过高或不足均会影响转化效率。
5'
5'
GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC
CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG
5'
23
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基因克隆操作过程
二、重组DNA分子的转化和扩增 ——转与增
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基因克隆操作过程
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1.转化的原理与技术
（1）Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化
基因克隆操作过程
GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG
5' 5'
12
（2）同尾酶生产的粘性末端的连接
• 同尾酶：能切割产生相同末端的限制性内切酶。 • 同尾酶是不同的酶，它们只是切割DNA产生的末端相 同，同尾酶之间的识别序列可以相同也可以不同。 • 基因工程中识别序列不同的同尾酶的应用性最大。
Target gene
酶切
Target gene
连接
转化
筛选
扩增
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基因克隆操作过程
2
目的基因的体外重组——酶切和连接（切、接）
重组DNA分子的转化和扩增（转、增）
目的基因转化子的筛选和鉴定（检）
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基因克隆操作过程
3
本章主要内容
目的基因的体外重组——切与接 重组DNA分子的转化和扩增——转与增 目的基因转化子的筛选和鉴定——检
教学目的及要求
理解基因工程各操作步骤的原理。 掌握基因工程克隆目的基因的基本操作。 重点：目的基因转化子的筛选方法。 应用：能够根据一定的研究目的，确定基因克隆 的策略，并设计其技术路线。
2016/7/2 基因克隆操作过程 4
一、目的基因的体外重组——切与接
In vitro Recombination of Target Gene—— Digestion and Ligation
细菌原生质体的再生：原生质体再生的主要目的是使细 菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行， 内含脯氨酸和微量元素。
2016/7/2 基因克隆操作过程 31
（3）λ噬菌体DNA的转染 感受态细胞的培养：将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含 葡萄糖）和MgCl2的培养基中培养至OD600 = 0.5。 吸附：加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液， 30℃ 保温10分钟。 转染裂解：加入20 倍体积的新鲜培养基，30℃继续培 养2小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加， 然后涂板筛选。
第六章 基因克隆操作过程
Chapter VI The Manipulation Procedure of Gene Cloning
授课教师：王斌
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基因克隆操作过程
1
基因克隆操作过程概述
Restriction endonuclease
Vector
Vector
DNA ligase
Vector
CTGCA G
BamHI
GATCC G
BamHI
GATCC G
PstI
CTGCA G
退火
CTGCA G G ACGTC
T4-DNA ligase CTGCAG GACGTC
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G GATCC CCTAG G
GGATCC CCTAGG
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基因克隆操作过程
（5）平末端的连接
5' G 3' C C 3' G 5'
提高重组率的方法
提高外源DNA片段与载体的分子比：5 : 1 - 10 : 1 载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：防止载体自连
碱性磷酸单酯酶CIP、BAP
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基因克隆操作过程
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提高重组率的方法
加装同聚尾末端
5' GCATG 3' C C 3' GTACG
G 3' ACGTC CTGCA 3' G
加热
CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG
5' 5'
GT CA A
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TTTT T TT T A AAAA A
TG A AC
CA GT T
AAAA A AA A T TTTT T
S1 nuclease
AC T TG
TG AC
14
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（3）不同粘性末端的连接
5' CTGCAG GACGTC
5'
5'
GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
5'
PstI
5' CTGCA 3' G G 3' ACGTC
BamHI
5' GATCC G Klenow G CCTAG 5' 补平
5'
T4-DNA polymerase
5'
TdT
dCTP
TdT
G 3' GGGGGGACGTC
dGTP
CTGCAGGGGGG 3' G
GCATGCCCCCC 3' C C 3' CCCCCCGTACG
退火
5'
GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC
Klenow
CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG
T4-DNA ligase
Pst I
Pvu II
2016/7/2
基因克隆操作过程
7
各种限制酶酶切反应所使 用的buffer（Takara）
双酶联合酶切所使用的buffer（Takara
2016/7/2
基因克隆操作过程
8
单酶切实例
2016/7/2
基因克隆操作过程
9
双酶联合酶切实例
2016/7/2
基因克隆操作过程
10
2. Ligation by DNA ligase（接）
《分子克隆第 三版》
2016/7/2 基因克隆操作过程 26
《分子克隆 第三版》
2016/7/2 基因克隆操作过程 27
Ca2+诱导转化过程中应注意的事项
转化所用DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%； 热击过程中不要摇晃离心管； 检测转化子的Amp抗性时，转化子铺平板时密度应低一些 （104菌落/板）；转化子于37℃培养不要超过20小时。因为 铺板过密或培养时间过久会导致平板上出现卫星菌落。 转化过程中37℃温育菌体使细菌复苏时的转速不可过高， 为得到较高的转化效率，应使转速小于225rpm。 当用于涂板的转化液过多时，应离心浓缩（4100rpm， 5min），并用适量SOC液体培养基重悬菌体沉淀后涂板。 刚进行完转化的菌体比较脆弱，涂板时应轻轻涂布。
5' G CTTAA 5'
5' AATTC G
G CTTAA 5'
5' AATTC G
5'
退火
5' 5' G AATTC CTTAA G G AATTC CTTAA G G AATTC CTTAA G G AATTC CTTAA G
5' 5'
T4-DNA ligase
5' 5'
2016/7/2
GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG
CA GT
19
基因克隆操作过程
（6）粘性末端的更换
5' GGATCC CCTAGG 5'
BamHI
5' G CCTAG 5' 5' GATCC G
5'
Klenow
5'
GGATC CCTAG 5'
补平
5' GATCC CTAGG