神经生物学实验讲义

神经生物学实验讲义2013版

实验一鼠脑灌注固定和取材

一、原理

固定是用人为的方法尽可能使组织细胞的形态结构和化学成分保持生活状态，防止组织细胞的溶解和腐败，并保持其原来的细微结构及原位保持生物活性物质的活性；能使细胞内蛋白质、脂肪、糖、等各种成分沉淀而凝固，尽量保持它原有的结构；使细胞内的成分产生不同的折射率，造成光学上的差异，使得原本在生活情况下看不清楚的结构，变得清晰可见；使得组织细胞各部经媒染作用容易染色；经过固定，使组织硬化，以利于以后切片时切薄片。

体循环：左心室→升主动脉→主动脉的各级分支→毛细血管

→各级静脉→上下腔静脉→右心房，完成体循环的整个循环。

二、实验步骤

1、正常Sprague-Dawley大鼠，150～250g，或昆明小鼠，20g左右，雌雄不拘；

2、动物麻醉后，用左手持镊子夹起腹部皮肤，右手持剪刀自胸骨剑突下腹部剪一小口，由此沿腹中线和胸骨剑突中线向上将皮肤剪至下颌，分离皮下组织，将皮肤翻向两侧，再沿腹中线和胸骨中线向上剪开胸骨，沿膈肌向两侧剪开，并用止血钳将胸骨和胸部的皮肤钳紧，将止血钳翻向外侧以充分暴露心脏，小心用镊子将心包膜打开；

3、将灌注针（大鼠12#，小鼠7#）插入左心室并送至升主动脉内，用

止血钳把灌注针固定在心脏上，打开灌注泵开关，同时剪开右心耳，使血液排出。先快速灌注0.9%NaCl（大鼠 80-120ml，小鼠30ml），至肝脏逐渐变白色或右心耳流出清亮液体为止，再灌注4℃预冷的固定液（大鼠200ml，小鼠50ml，根据动物体重定量），其中前1/3量快速灌注，后2/3量慢灌注，共在30分钟内灌注完；

4、固定液进入血管后，大鼠四肢和尾巴开始抽动，表明灌注液进入大鼠大脑，待抽动完全停止，全身组织器官变硬后即可停止灌注；

5、断头后，剥离颅骨、剪断脑神经、离断脑于脊髓，取出整脑。

6、后固定（post-fixed）：剥出鼠脑后，切取含目的区域的脑段，放入相同固定液4～12h，4℃。

附 4%多聚甲醛的配制：40g多聚甲醛用0.1mol/L PB（pH7.4）溶解后定容至1L，过滤后置于4℃保存。

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