霍乱弧菌实验室检验技术共45页
霍乱弧菌检测演示文稿
特征
羊红细胞溶血
古典生物型
-
El-Tor 生物型
D
鸡红细胞凝集
-
+
V-P试验
-
+
多粘菌素B敏感试验
+
-
IV组噬菌体裂解
+
-
V组噬菌体裂解
-
+
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O1群霍乱弧菌的血清分型及抗原成份
型别
别名
O抗原成份
原型
稻叶型（Inaba）
A、C
异型 中间型
小川型（Ogawa）
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进一步实验
➢ 氧化酶试验 1％盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液
➢ 粘丝试验 ➢ 0.5％去氧胆酸钠水溶液
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进一步实验
➢ 生化鉴定
➢生化鉴定管： 发酵葡萄糖、甘露醇、 蔗糖、产酸不产气 能分解色氨酸
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鞭毛染色
霍乱弧菌涂片、染色
革 兰 染 色
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分群与分型
根据O抗原的特异性，可将霍乱弧菌分成200个血清
群。
根据是否与O1抗血清凝集分两大群， O1群霍乱弧菌：凡能与O1群抗血清发生凝集 非O1群霍乱弧菌：凡不被O1群抗血清凝集的。
型血清发生弱凝集，因此如小川型血清凝集较稻叶型血清凝集有明显优势时应维持小川型的判定。
➢生理盐水不凝集，O139群血清明显凝集的菌落，一般为O139群，但其与O22群及O155群甚至
一些非霍乱弧菌会出现交叉凝集，由上级实验室进行进一步确认。
霍乱弧菌的实验室
霍乱的流行病学
霍乱的病原菌：霍乱弧菌 是我国《传染病防治法》：甲类传染病（又称2号病）， 是国际检疫的烈性传染病 霍乱：七次世界大流行： 1817-1923年 六次大流行 （均从印度恒河三角洲发源地）~古典生物型； 1961年 第七次大流行 ElTor生物型（我国以ElTor生物 型为主） 1992年 在印度， 孟加拉， 泰国发生的霍乱，分离到菌 株不与O1群霍乱血清凝集，定为O139群，被认为下一次 大流行的主角。浙江省94年发现，
疑似病人或急诊病人如何处理
如是高度怀疑的疑似病人或急诊病人可在接种碱性胨水培 养基的同时直接再接种于4号琼脂培养基一个。 标本直接涂片，镜检观察有没有呈鱼群穿梭样或流星状运 动活跃的细菌，如有加一滴霍乱诊断血清后再观察细菌运 动情况（3分钟运动被抑制为制动试验+） 标本直接涂片作革兰氏染色，镜检观察弧状或逗点状，革 兰染色阴性的细菌。 如形态典型，运动活泼，制动试验+，可作出疑似初步报 告，报涂片见到xx形态，xx染色性细菌等。--常见于紧急 情况
℃
- 抗原性
-生化反应：发酵葡萄糖，甘露醇，蔗糖，产酸不产气
霍乱红试验（+） o/129敏感试验（+） 赖氨酸，鸟氨酸脱羧酶（+） 精氨酸双水解酶（-） 氧化酶（+）粘丝试验（+）
-致病性：侵袭力 （鞭毛来自菌毛）霍乱肠毒素 -抵抗力：水中存活20天，怕酸耐碱，庆大霉素耐药 -消毒： 漂白粉
霍乱弧菌常规检验
霍乱弧菌的病原学特点
-形态与染色： 弧状或逗点状 -革兰染色阴性 有一根单鞭毛，细菌运动非常活跃，呈鱼 群穿梭样或流星状 -培养特性：营养要求不高，生长较快，兼性厌氧。 最适生长温度为37 ℃ ， 怕酸嗜碱，最适pH7.2-7.4, PH7.4-9.6快速生长 O抗原：耐热，耐受100℃2h,特异性高，分群 和分型的基础。 H抗原：不耐热，特异性低
传染病学指导：霍乱的实验室检查
霍乱常⽤的实验室检查有：
（1）直接镜检：
①直接涂⽚染⾊：将标本涂⽚，固定后⽤1∶10稀释⽯炭酸复红染⾊和⾰兰⽒染⾊，镜检有⽆典型弧菌。
典型霍乱弧菌互相连接平⾏排列，有如“鱼群”。
②悬滴标本：将标本制成悬滴，镜检细菌动⼒，⽤暗视野显微镜。
霍乱弧菌运动活泼，呈⼩鱼穿梭状。
（2）分离培养：将吐泻物直接或先经碱性胨⽔增菌后，接种于庆⼤霉素琼脂等培养基，容易检出霍乱弧菌。
应⽤荧光抗体检测粪便中霍乱弧菌，可于1～2⼩时内获得结果。
（3）⾎清学检查：可作⾎清凝集试验。
在发病第1～3⽇及第10～15⽇各取1份⾎清，若第2份⾎清的抗体效价⽐第1份增⾼4倍或4倍以上，有诊断参考价值。
（4）制动试验——快速诊断：在急性病⼈的⽔样便中含有⼤量弧菌，如悬滴检查阳性，再滴加不含防腐剂的霍乱多价⾎清（使⽤浓度为1∶64），⼏分钟内细菌运动停⽌，凝集成块即为阳性。
若具备下列条件之⼀者，可确诊为霍乱：
①凡有腹泻、呕吐等症状，⼤便培养霍乱弧菌阳性者；
②霍乱流⾏期间，在疫区有典型霍乱症状，⼤便培养阴性，⽽⽆其他原因可查者；
③有吐泻症状，霍乱弧菌培养阴性，作⾎清凝集试验第2份⾎清抗体效价呈4倍以上增⾼者。
在⾮疫区，凡有典型泻吐症状，在病原学检查未确定时，或在霍乱流⾏期间，曾接触过霍乱患者，有腹泻症状⽽⽆其他原因可查者，均应⾼度怀疑为霍乱，在给予积极处理的同时，应作⼤便培养，隔⽇1次，连续3次阴性者，才可以否定诊断，并作出疫情更正报告。
霍乱弧菌实验室检验技术PPT课件
rhBMP-2的融合率（94％）高于髂骨植骨组（69％）。另
一项研究发现联合应用 “ INFUSE ” + 自体髂骨”可以提
高椎间融合率（> 95％）。65岁以上的老年患者与年轻患
者使用rhBMP-2，二者的并发症发生率并没有太大差异。
+ 椎间盘置换术
在过去的几年内，有2种新型的人工椎间盘装置获得了美国
FDA 的批准，其适应症是单节段脊髓神经根病，还有1种装置同
时适用于单节段或者双节段的病变。这3种人工椎间盘装置的临 床功能预后和安全性和其他已经批准上市的人工椎间盘类似。
+ 椎间盘置换术
已获得上市的人工椎间盘 7-9 年的随访显示其具有较好的预 后，和融合手术相比，其邻近节段退变而导致的再手术率较低。
但是，人工椎间盘也有其潜在的缺点，如边缘撞击造成的椎间盘
装置磨损，由此而形成的磨损碎屑的炎症反应等，目前报道这类
并发症的发生率较少。美国医疗保险数据库的调查发现，使用人
工椎间盘的花费要少于融合手术，可能与术后较少的再手术率和 术后较少的费用相关。
+ 2013 年脊柱生物学研究的焦点在重组人骨形态发生蛋白
+ 过去数十年间，有3种人工椎间盘获得了相关监管机构的批
准，其长期随访取得了较为满意的结果。
+ 脊髓型颈椎病
Fehling 等人报道一项对 222 例脊髓型颈椎病患者进行了术后 1 年随访的多中心观察研究，结果发现术后疼痛、功能、步态、 生活质量等可以获得较好的改善。 作者认为：前后路手术效果无显著差异；多因素分析显示， 临床功能预后较差有关的因素包括：症状持续时间长，术前较差 的基础功能，合并有精神疾病，严重步态障碍，较高的年龄等。
霍乱弧菌实验室检测完整版
中、重型病例 。 临床诊断病例：符合下列任一类病例均为临床诊断病例。 临床表现为轻、中、重型或中毒型病例，并在腹泻病患者日常生活用品或家居环境中
检出O1群或/和O139群霍乱弧菌；
在一起确认的霍乱暴发疫情中，暴露人群中临床表现为轻、中、重型或中毒型病例。 实验室确诊病例： 临床病人并粪便、呕吐物或肛拭子细菌培养分离到O1群或/和O139群霍乱弧菌 ； 在疫源检索中，粪便培养检出O1群或O139群霍乱弧菌前后各5天内有腹泻症状者。
挑可疑菌落、多价血清凝集
胶体金层析 卡检测
胶体金层析 卡检测
核酸提取 荧光PCR检测
血清分型、生化鉴定
问题：实验时间；灵敏度；初筛；等待时间
标本的采集和运输
采集：
病例：粪便、肛拭子、呕吐物 未使用抗生素之前 “健康”人：粪便、肛拭子 其他传播环节的标本：食物、水、操作台、砧板、下水道口……
要求：位置、数量
运输：
C-B运输培养基（pH8.4） 碱性蛋白胨水：不是最佳的，尤其6小时内还不能进行培养时，不要用 运输培养基用前预冷1-2小时，采样后不能立即运至实验室时，需冷藏
特定地区？
感染因素多样化
初级感染因素、衍生的感染因素
确诊 病例 采样检测
就诊
患者
- 临床及时发现病例 - 细致的流行病学调查 - 实验室检测与分析 - 信息整合 - 控制行动
标本-粪便、呕吐物、水体、食品、、、
前处理：运输、调pH
增菌：碱性蛋白胨水（水体：加十倍浓缩液），6h – 过 夜
涂平板，16h ： 4号琼脂、TCBS、庆大霉素
S
SS S
S
霍乱弧菌实验室检验技术20060409
三、霍乱弧菌的形态学
（一）形态与染色
（二）菌细胞结构 1、细胞壁 ：特异性多糖（O抗原） 2、细胞膜 3、细胞浆：质粒 4、核质：双股一环状DNA 5、荚膜 6、鞭毛：长而粗（H抗原），起运动作用。
四.微生物学特性:
（ 一）. 形态、染色:
自病人新分离的霍乱弧菌为革兰氏阴 性短小稍弯曲的杆菌，无芽胞，菌体两端钝 圆或稍平，菌体单端有一根鞭毛，长可达菌 体长度的4～5倍，运动极为活泼。
五、霍乱弧菌的主要抗原和血清分型
（一）鞭毛抗原（H抗原）：特异性低，不耐热， 100℃ 2h 即被破坏。 （二）菌体抗原（O抗原） ：特异性强，耐热， 具有群和型特异性。 根据O抗原的不同霍乱弧菌已有200个以上 的O血清群 1. O1群 （1）根据O抗原成分的不同分群特异性抗原因子 （A抗原因子）和型特异性抗原因子（B和C抗 原因子）
二.霍乱弧菌在弧菌科的分类地位
弧菌科包括5个属
﹙一﹚ 弧菌属 1.霍乱弧菌﹙V.cholerae﹚：与O1群霍乱弧菌具有共 同鞭毛抗原、生化性状类似，仅菌体抗原不同的弧菌 。目 前有O200以上血清群，其中O1和O139群含有相同的毒素基因， 可引 起 霍 乱流行。
2.其它弧菌：副溶血弧菌﹙V. parahaemolyticus﹚、 河弧菌、拟态弧菌、溶藻弧菌等。
不与022群、0155群及01群粗糙型交叉 凝集。
六.霍乱弧菌的抵抗力
（一）对温度的耐受力
1. 无芽胞，对热耐受力不强。零度以下可活14 天左右。 2. 实验室保存菌种时放室温，不放冰箱 （二） 对干燥的耐受力敏感，干燥的玻片上3小 时左右死亡。 （三）对各种常用消毒剂如含氯制剂、碘制剂 均为敏感。
（2）根据型特异性抗原因子的不同可把O1 霍乱弧菌的两个生物型分为三个血清型： 小川 型霍乱弧菌（ A，B， 少量C） 稻叶型霍乱弧菌（ A， C ）
霍乱弧菌实验室检验技术PPT医学课件
快速诊断初步报告
1、快诊断实验阳性者同时涂片染色和悬 滴法观察，如镜检为革兰染色阴性弧菌 或悬滴细菌呈“鱼群穿梭样”运动，氧 化酶试验阳性，可作初诊报告。为开展 疫情处理提供依据；
2024/1/24
制动试验
暗视野/相差显微镜直接镜检，水样便滴 在玻片上，可见流星状动力的细菌；当 加入01/0139免疫血清后，运动停止即凝 集成块，根据这种特殊动力和制动试验， 可提早做出初步诊断。
注意：免疫血清使用浓度1：64，并尽可 能不加防腐剂
2024/1/24
胶体金免疫层析快诊
采用胶体金免疫层析双抗体夹心法， 检测标本中霍乱弧菌。以胶体金作 为标记物，交联抗霍乱弧菌单克隆 抗体，与样品中的霍乱弧菌结合。 形成双抗体夹心一步法，呈现出目 测可见的红色条带，显色程度与抗 原含量成正比。
霍乱实验室检测技术
2024/1/24
内容
一、霍乱概述 二、霍乱病原学 三、霍乱弧菌常规检验 四、霍乱弧菌的快速诊断 五、霍乱弧菌的噬菌体-生物分型 六、霍乱菌株的管理、保存与上送
2024/1/24
一、霍乱概述
霍乱是由01群和0139群霍乱弧菌 （V．cholerae）引起的急性肠道传染 病，发病急、传播速度快、波及范 围广、危害严重的甲类传染病。
增菌/二次增菌分离培养 所有粪便标本都 应接种碱性蛋白胨水培养基，放37℃增 菌6～8h后，从菌膜下表层取一接种环培 养物，划线接种于强选择性碱性琼脂和 TCBS琼脂平板各两个。必要时进行二次 增菌
2024/1/24
疑似菌落初步鉴定：
每个碱性琼脂、TCBS琼脂平板上各挑取 5个以上(少于5个的全部挑取)疑似菌落接 种于营养琼脂平板/营养琼脂斜面或克氏 双糖置37℃18-24h纯培养(即每份样品至 少从2个分离平板上获得约10株可疑菌落 菌株)，取斜面纯培养物进行血清鉴定、 并涂片进行革兰氏染色及氧化酶试验等。
霍乱弧菌检测方法 文档
霍乱弧菌的检测霍乱弧菌相关知识：稻叶型（A、C）古典型小川型（A、B、C少量）O1群霍乱弧菌：彦岛型（A、B、C）稻叶型（A、C）艾尔托型小川型（A、B、C少量）彦岛型（A、B、C）实验室准备：1.培养基：碱性蛋白胨水、TCBS、4号或庆大霉素琼脂、营养平板、半固体菌种保存管。
2.试剂：拉丝实验用试剂（0.5%去氧胆酸钠水溶液）、氧化酶试剂（1%盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸对氨基四甲基苯胺水溶液。
3.诊断血清：O1群霍乱诊断血清、稻叶型霍乱血清、小川型霍乱血清、O139群霍乱血清。
4.快诊试剂：O1群霍乱胶体金标记快诊卡、O139群霍乱胶体金标记快诊卡。
霍乱弧菌检验流程图：标本37度6-8小时TCBS、4号或庆大霉素琼脂小时胶体金快诊卡/制动等试验血清学凝集试验氧化酶实验拉丝实验O/129敏感试验初步报告、菌种保存一、采样（一）水样便采取1-2毫升，成形便采取指甲大小的粪量。
病人呕吐物、沾染粪便的衣物、尸体的肠腔和口腔内容物亦可做为检材；（二）外坏境样本可采取病人的污染衣物、剩饭菜、可疑食品、抹布、污水、坑塘水、井水、公厕粪便、苍蝇等；（三）按1：10比例置入碱性蛋白胨水增菌液中，迅速送往实验室。
二、增菌、培养（一）所有粪便标本都应经过增菌，尤其是恢复期病人、带菌者或用过抗菌药物的病人标本含菌量少，单靠直接分离不易检出。
需经碱胨水37度增菌6-8小时后分离(夏日可将运送时间计算在内)；（二）标本含菌量少时，为提高检出率可实行2次增菌，取第一次碱胨水增菌后的培养物表层液0.1-0.2毫升，接种于8-10毫升的碱胨水中，37度培养6-8小时后再做分离。
（三）霍乱弧菌好氧，易形成菌膜，故在取出增菌管时动作要轻，接种环于菌膜下取一满环，划线接种于TCBS或4号琼脂平板37℃10~14h孵育培养。
三、快速诊断（一）、直接镜检：为争取最快速度作出诊断，采取病人“米泔水样”大便或呕吐物，悬滴法镜检（最好用暗视野），可见具有流星状动力的细菌。