4.冬枣花药愈伤组织的诱导及原生质体分离

中国农学通报
2009,25(02):100-104
Chinese Agricultural Science Bulletin
冬枣花药愈伤组织的诱导及原生质体分离
刘晓光 1， 刘孟军 1， 宁 强 2， 彭艳芳 3， 苗利军 4， 秦子禹 5
2 （ 河北农业大学园艺学院， 河北保定 071001； 河北政法职业学院园林系， 石家庄 050061； 1 3 4 河北承德民族师范高等专科学校生物系， 河北承德 067000； 中国环境管理干部学院， 河北秦皇岛 066004； 5
基金项目 ： 河北农业大学科技资助和河北农业大学科研发展基金资助， 为国家科技攻关项目 （2001BA502B09-04 ） 。 第 一 作 者 简 介： 刘晓光， 女， 1980 年出生， 河北石家庄人， 河北农业大学中国枣研究中心， 博士在读， 从事干果种质资源与分子辅助育种研究 。
通信地址： 071001 河北农业大学中国枣研究中心， 河北保定市灵雨寺街 38 号， Tel： 0312-7521882， E-mail:zaosy@。
河北科技师范学院园艺园林系， 河北昌黎 066600 ）
摘 要 ：【 研究目的 】 研究冬枣花药愈伤组织的诱导 ， 悬浮系的建立和培养及愈伤悬浮系原生质体的分离 。 【 方法 】 以冬枣花药为试材 ， 通过选择愈伤诱导培养基和原生质体分离所用酶的浓度找到最佳诱导和分 离条件 。【 结论 】 使用 1/2MS 基本培养基附加 TDZ 0.2 mg/L、NAA 0.5 mg/L 和 PVP 2.0 g/L， 对诱导冬枣花 药愈伤组织有较好效果 ； 愈伤组织增殖采用培养基 1/2MS+TDZ 0.4 mg/L+NAA0.2 mg/L； 悬浮细胞系培 养采用 1/2MS+TDZ 0.4 mg/L+NAA0.2 mg/L 液体培养基 ； 冬枣花药愈伤组织悬浮系原生质体分离时以
(1College of Horticulture, Agricultural Universitiy of Hebei, Baoding Hebei 071001;
2 3
1பைடு நூலகம்
Vocation College of Political Science and Law of Hebei, Shijiazhuang 050061;
4
Department of Biology, Chengde Teachers College for Nationlities Chengde Hebei 067000 Environmental Managemental College, Qinhuangdao Hebei 066004;
5
Hebei Normal University of Science and Technology, Department of Life Science , Changli Hebei 066600)
表 1 冬枣花药愈伤组织诱导培养基成分
111111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 111 1111 1111111111 1111 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11111111111 11 1111 1111 1111 1111 11 11 1111 1111 1111 1111 1111 1111 1111 1111 1111111111111 1111 11 11 11 11 1111 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11111111111 11 1111 1111 1111 1111 1111 1111 11 1111 1111 1111 11111 11 1111 11 1111111111 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11111111111 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11
· 102 ·
中国农学通报
ｈｔ ｔ ｐ： ／ ／ ｗｗｗ． ｃａｓｂ． ｏｒｇ． ｃｎ （３）原生质体活力测定 使用 Ｅ ｖａｎｓ ｂｌ ｕｅ 染色法进行原生质体活力测定 。 每个样品重复观测 ３ 次， 按下式计算原生质体活力， 最 后取其均值。 原生质体活力 ＝ （被染上蓝色的原生质体数÷观 察的原生质体总数 ） ×１００％ １． ２． ５ 数据处理 调查不同材料诱导愈伤的情况，在各 基因型间，不同酶液处理及预处理等条件下的原生质 体产量及活力，比较不同处理水平下原生质体产量及 活力的差异。试验数据采用 Ｄ ＰＳ 软件， 新复极差法进 行显著性分析， 分析水平为 ０． ０５。 2 结果与分析 ２． １ 花药愈伤组织的诱导 以盛花期的黄蕾期花蕾的花药为外植体诱导愈伤 组织， 结果表明 （见表 ３ ） ， Ｙ ９ 号培养基的增殖量最多， 并且诱导出的愈伤组织质地好， ２０ 天左右即在花药部 位见到愈伤组织形成。Ｈ ３、 Ｈ ４ 号培养基也能较好的诱 导出愈伤组织， 但增殖量较小， 愈伤组织颜色稍显微褐 色褐化。１５ 种培养基中， 在 Ｙ ９ 号上的出愈率最大， 为 ５０． ８８％ ， 其次为 Ｈ ４ 号培养基、 Ｈ ６ 号培养基。
１． ２． ２ 愈伤悬浮细胞系的建立 继代培养两周后， 选取生 长较快的松散颗粒状愈伤组织，转入 １／ ２Ｍ ｓ 液体培养 基中， 在 １２０ ｒ／ ｍｉ ｎ 的摇床上悬浮培养， 温度 ２６±１ ℃， 光 照 １２ ｈ／天， 每 ７ 天更换一次培养液。添加方法为将瓶 中悬浮培养物静放 ０． ５ ｈ， 然后吸去 １／ ３ 上清液， 再添加 新鲜培养基至原刻度，经 ７ 天悬浮培养即可得到细胞 团的悬浮培养物。 １． ２． ３ 原生质体的分离 （１）悬浮细胞培养物的收集与预处理 选取分离前 ７ 天隔天继代培养的悬浮细胞。快速 收集悬浮细胞培养物的方法是将培养液倒入 ５０ ｍ ｌ离 心管中， 以 １０００ ｒ／ ｌ ｍｉ ｎ 离心 ５ ｍ ｉ ｎ， 使细胞团以及悬浮 单细胞沉淀。 将待分离材料转入 ２０ ｍ ｌ混合酶液中进行酶解。
通讯作者 ： 刘孟军， 男， 1966 年出生， 河北望都人， 博士， 教授， 从事干果种质资源与分子辅助育种研究。 收稿日期 ： 2008-05-14， 修回日期： 2008-10-28。
刘晓光等： 冬枣花药愈伤组织的诱导及原生质体分离
· 101 ·
胞的不亲和障碍， 进行远缘体细胞杂交， 从而获得远缘 杂种；原生质体可直接摄取外源的 Ｄ Ｎ Ａ 、细胞器、 病 毒、 质粒等， 是进行遗传转化研究的理想受体； 原生质 体培养再生植株过程中， 往往会产生无性系变异， 同时 原生质体也可以通过理化因素诱变得到突变体等。因 此，利用原生质体培养途径进行枣树的种质资源创新 不失为一种可行且有效的途径。 该试验以冬枣的花药为试材，研究了冬枣花药愈 伤组织的诱导， 愈伤组织悬浮系的建立和培养， 及花药 的原生质体分离的条件，以期能为冬枣的育种及品种 改良提供可借鉴的参考。 1 材料与方法 １． １ 材料 于 ２００５ 年， 在河北农业大学西校区枣品种标本园
ｇｍ ａ 公司生产的纤维素酶 采集冬枣花药。所用酶为 Ｓｉ Ｒ －１０ 和离析酶 Ｒ －１０。 甘露醇为上海沪试公司生产； Ｍ Ｅ Ｓ 购自北京欣经科公司。 １． ２ 方法 １． ２． １ 花 丝 愈 伤 组 织 的 诱 导 ２００５ 年于盛花期采集冬 枣的黄蕾期花蕾，流水冲洗 ３０￣４０ ｍ ｉ ｎ， ７５％ 酒精中消 毒 ４０ ｓ， ０． １％ 升汞处理 １０ ｍ ｉ ｎ 剥取完整的花药接种于 设计好的培养基 （见表 １ ） 中诱导愈伤组织， 基本培养 基均为 １／ ２ Ｍ Ｓ 。培养期 ２８ 天， 黑暗条件， 每个处理接 种 ３０ 个花药， ３０ 天后统计愈伤组织颜色、 质地及诱导 率。 诱导期结束后， 挑取鲜黄色松散颗粒状生长旺盛的 愈伤组织接种至 １／ ２Ｍ Ｓ＋Ｔ Ｄ Ｚ０． ４＋Ｎ Ａ Ａ ０． ２ 培养基中继 代培养。
（２）混合酶液的制备 将 Ｍ Ｅ Ｓ（２－Ｎ － 吗啉乙烷磺酸）溶解于 Ｃ ＰＷ 盐 ＋ 甘 露醇组成的溶液中， 再将纤维素酶 （Ｃ ｅｌ ｌ ｕｌ ａｓｅ Ｏ ｎｏｚｕｋａ Ｒ －１０ ） 和离析酶 （Ｍ ａｃｅｒｏｚｙｍ ｅ Ｒ －１０ ） 溶解于其中， 用 Ｃ ＰＷ 盐 ＋ 甘露醇溶液定容。 在超净工作台上将上清液 经 ０． ２２ μｍ 硝酸纤维素微孔滤膜过滤灭菌后即可用于 原生质体的分离。 试验设计了 ７ 个纤维素酶浓度，分别为 ０、 ５、 １０、 １５、 ２０、 ２５、 ３０ ｇ／ Ｌ 。５ 个混合酶液的处理 （见表 ２ ） 。 １． ２． ４ 原生质体的纯化及活性测定 （１）原生质体的纯化 将预分离的悬浮培养细胞放在直径 ６ ｃｍ 的小培 养皿中， 加入不同种类及不同配比的酶液， 用 Ｐａｒａｆｉ ｌ ｍ 封口， 于黑暗中 ２６ ℃， ５０ ｒ／ ｍｉ ｎ 的摇床上振荡酶解。酶
0.6M 甘露醇 +0.1%MES+20~25 g/L 纤维素酶 ，酶解时间为 16h 时得到的原生质体产量和活力较高 。
关键词 ： 冬枣 ； 花药 ； 愈伤组织悬浮系 ； 原生质体 ； 分离 中图分类号 ：S665.1 文献标识码 ：A
Studies on Callus Induction and Protoplast Isolation on Ziziphus jujuba Mill. cv. Dongzao Liu Xiaoguang , Liu Mengjun1, Ning Qiang2, Peng Yanfang3, Miao Lijun4, Qin Ziyu5
Abstract: 【OBJECTIVE】 :the paper was studied the callus induction, the foundation and culture of the sus－ pension, and isolatation of the protoplast of anther of dongzao. 【METHODS】the anther of dongzao was used as material to find the best culture medium of foundation and cultivation of the suspension and the protoplast isolation conditions. 【RESULTS】 it is good to indicate callus when the culture medium which was added TDZ0.2mg/L、 NAA0.5 mg/L and PVP2.0g/L was used. The better culture medium of callus multiplication was 1/2MS +TDZ0.4 mg/L +NAA0.2 mg/L. The liquid culture medium that was 1/2MS +TDZ0.4 mg/L +NAA0.2 mg/L was used to the suspension. When the the suspension was used to isolation, the optimal condition was 0.6M Mannital +0.1%MES+20~25 g/L Cellulase“onozuka”R-10， the isolation time was 16h. Key words: Ziziphus jujuba Mill.cv. dongzao, anther, suspension, protoplast, isolation 冬枣口感鲜嫩多汁， 风味酸甜适口， 是鲜食品种中 的佼佼者。同时冬枣也有树体易感病， 枣果果个不大， 不易储存等缺陷，生产上迫切需要培育出综合性状优 良的新品种。 但是， 枣树利用杂交育种难度很大。原生 质体具备以下特点：每个细胞的原生质体都含有该个 体的全部遗传信息，在适当的培养条件下具有再生成 与其亲本相似个体的全能性，在同一时间内获得的大 量原生质体在遗传上是同质的；原生质体能克服性细