计算标准品拷贝数(优选.)

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Taqman定量PCR技术检测转基因大豆中外源基因拷贝数

Taqman定量PCR技术检测转基因大豆中外源基因拷贝数仇有文;张明辉;高学军;曲波;敖金霞;袁肖寒;刘营;霍楠【摘要】[目的[采用Taqman定量PCR技术检测转基因杂交大豆中外源nos终止子基因的拷贝数.[方法]以大豆凝集素基因为内参照基因,以非转基因大豆基因组DNA为内参照基因标准品,通过梯度稀释法分别求取了内参照基因和质粒DNA的Ct值与拷贝数对数值的相关性标准曲线方程,并通过将得到的Ct值代入标准曲线方程求取了样品的拷贝数.[结果]内参照基因标准曲线方程为y=-3.422x+35.201,R2=0.998;外源基因标准曲线方程为y=-3.348x+34.890,R2=0.999.nos终止子基因及其下游边界序列在转基因杂交大豆中为单拷贝.[结论]为确定转基因大豆外源基因拷贝数提供了理论依据.%[ Objective ] It is to adopt Taqman quantitative PCR technique to detect the copies of foreign nos terminator in transgenic hybrid soybean. [ Method ] With endogenous reference gene of soybean lectin, and endogenous reference standard of gene complex DNA in non-GMO soybeans, the method of gradient dilution was used to separately calculate Ct value of endogenous reference gene and plasmid DNA and relevance standard curve equation of logarithm of copies, and then to calculate the copies of samples through substituting thus-obtained Ct into standard curve equation. [ Result ] The standard curve equation of endogenous reference gene isy = - 3.422x + 35. 201 , R2 = 0. 998; and the standard curve equation of foreign gene is y = - 3. 348x + 34. 890, R2 = 0.999. Nos terminator and its lower boundary sequences in transgenic soybean is ofsingle copy. [ Conclusion] The study has provided a theoretical basis for determining foreign gene copies in transgenic soybean.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2011(039)017【总页数】3页(P10150-10152)【关键词】Real-time PCR;转基因杂交大豆;拷贝数;Lectin;nos终止子基因边界序列【作者】仇有文;张明辉;高学军;曲波;敖金霞;袁肖寒;刘营;霍楠【作者单位】东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,黑龙江,哈尔滨,150030【正文语种】中文【中图分类】S188+.1实时荧光定量PCR技术是一种新的DNA定量方法[1]。

实时定量PCR技术(real-time PCR)

样品重复

重复次数请遵循统计学的要求小样本统计，n>6（n>3）未知样品和标准品都要重复所有复管在同样条件下完成PCR

2.2 技术方法及数据

绝对定量与相对定量

绝对定量：绝对标准曲线法

标准品拷贝数的计算待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释倍数样本分子量=碱基数×324 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014

扩增效率扩增效率与标准曲线的斜率相关，计算方程为：扩增效率（E）＝10-1/斜率。理论上，在每个指数扩增循环中，PCR产物的量加倍，即PCR产物2倍增加，反应效率为2，扩增效率就为2，就可得2＝10-1/斜率，标准曲线得斜率就为-3.32，斜率得绝对值与荧光曲线间距相同。如果将扩增效率用百分率来表示，即： E%=(E-1)×100%，对于理想的PCR反应， E=2，即：扩增效率E%=(2-1)×100%=100% 如果E＝1.92，带入方程(1.92-1)×100%=92%，表示每个循环的终点，扩增产物的拷贝数增加 1.92倍，或每次循环有92％的模板被扩增。

TaqMan探针

TaqMan定量原理
荧光共振能量转移(FRET)

当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET),实际相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽。

PCR效率对定量结果的影响

pcr仪校准标准

pcr仪校准标准
一、目的
本标准规定了PCR仪的校准方法、校准项目和校准周期，以确保PCR仪的准确性和可靠性。

二、适用范围
本标准适用于各类PCR仪的校准，包括实时荧光定量PCR仪、普通PCR仪等。

三、校准方法
1.实时荧光定量PCR仪校准方法
（1）选定标准品：选择已知拷贝数的标准品，用于校准PCR仪的荧光定量检测系统。

（2）设置仪器参数：按照仪器说明书设定PCR仪的参数，包括退火温度、延伸时间、循环数等。

（3）运行PCR反应：将标准品DNA加入到PCR反应液中，按照设定的参数进行PCR反应。

（4）数据分析：记录PCR仪生成的荧光信号数据，使用标准曲线法计算标准品的拷贝数。

将计算结果与已知拷贝数进行比较，评估仪器的准确性。

2.普通PCR仪校准方法
（1）温度校准：使用温度计测量PCR仪的加热块温度，观察是否与设定温度一致。

可以参考仪器说明书中的温度校准表进行校准。

（2）灵敏度校准：使用已知浓度的模板DNA进行PCR反应，观
察是否能够正确检测到目标基因。

可以参考仪器说明书中的灵敏度校准表进行校准。

四、校准项目
1.实时荧光定量PCR仪校准项目：荧光信号稳定性、荧光信号准确性、拷贝数计算准确性等。

2.普通PCR仪校准项目：加热块温度准确性、灵敏度检测准确性等。

五、校准周期
1.实时荧光定量PCR仪校准周期：建议每季度进行一次校准。

2.普通PCR仪校准周期：建议每年进行一次校准。

计算copy数

做 qRT-PCR 的时候经常需要计算 DNA 拷贝数(Copy Number)，比较烦，用下面的方法这就方便多了。

其实计算方法是相通的，只不过一个是带有分步推理过程，一个是直接计算而已！一、分步推理如何计算核酸拷贝数1A260吸光度值=dsDNA 50ug/ml=ssDNA 33ug/ml=ssRNA 40ug/ml核酸浓度＝(OD260)×稀释倍数×(33 或 40 或 50)=ng/ulMW 代表克/摩尔，单位 dolton ：1dolton 即表示 1g/mol 1 摩尔=6.02×1023摩尔分子(拷贝数)平均分子量(MW)：dsDNA=碱基数×660 道尔顿/碱基ssDNA=碱基数×330 道尔顿/碱基ssRNA=碱基数×340 道尔顿/碱基得到拷贝数计算公式：mLmol g MW mL g mol mol copies /copies //)/copies 1002.6)/(1002.62323=⨯⨯=⨯⨯）（）浓度（（摩尔数即(6.02×1023)×(g/ml)/(DNA length×660)=copies/ml.或(6.02×1023)×(ng/ul×10-9)/(DNA length×660)=copies/ul.例：3000 碱基质粒，浓度 100 ng/ulMW=3000bp×660dalton/bp=1.98×106daltonS=1.98×106g/mol ，即1mol=(100ng×10-9)g/1.98×106＝摩尔数copy 数＝摩尔数×6.02×1023＝3×1010copies/ul.。

如何确定转基因拷贝数(Southern Blot法和荧光定量PCR方法)

如何确定转基因拷贝数（Southern Blot法和荧光定量PCR方法）发布: 2010-01-22来自: 易生物实验阅读数：5391次鉴定转基因植物的第一步就是要确定被转基因已经稳定的整合到了染色体上。

第二步任务就是评估有多少个转基因拷贝，以及每个转基因的表达水平如何。

一般经过上游表达载体的设计构建以及下游转化体系的建立、转化品系的筛选鉴定等一系列步骤后，即获得T 0 代转基因植物。

在转化过程中，外源DNA 随机插入植物内，插入的拷贝数和位点都不固定。

插入外源基因的拷贝数低（1或2个）能较好的表达，插入的拷贝数多则会导致表达的不稳定甚至基因沉默现象。

因此，检测T0代植物的外源基因的拷贝数是研究其分子特性的基础步骤之一。

1、Southern Blot法Southern Blot是一种常用的DNA定量的分子生物学方法。

其原理是将待测的DNA 样品固定在固相载体（硝酸纤维膜或尼龙膜）上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA 的位置上显示出杂交信号，通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出转入的拷贝数。

Southern法准确性高、特异性强，但存在费时费力的缺点。

另外，由于Southern法检测不经过靶片段的扩增（PCR），一般每个电泳通道需要10-30 μg的DNA ，在实际操作中就需要较大量的植物材料来提取DNA ，而转基因植物的愈伤组织在无菌条件下经过筛选、重新分化后一般都比较细弱，不宜大量取样。

如果外源基因在插入时发生基因重组，造成限制性酶切位点丢失，Southern 法也无法检测到。

这些因素都制约了Southern法在T0代植物中检测外源基因拷贝数的应用。

2、荧光定量PCR方法利用新型、灵敏、高通量的实时荧光定量PCR方法可以用于测定原始品系中转基因的绝对拷贝数。

实时荧光定量PCR技术是一种较新的DNA 定量方法。

其定量的基本原理是在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如：SYBR GREEN I）或特异性的荧光探针（如：Taqman 探针），实时检测荧光量的变化，获得不同样品达到一定的荧光信号（阈值）时所需的循环次数：CT值（Cycle Threshold）；通过将已知浓度标准品的CT值与其浓度的对数绘制标准曲线，就可以准确定量样品的浓度。

牛传染性鼻气管炎病毒SYBR_GreenΙ_实时荧光定量PCR_检测方法的建立与初步应用

·简报·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘要：为了建立牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV ）的快速定量检测方法，本研究针对IBRV 基因组gD 序列保守区域设计特异性扩增引物，扩增的目的片段大小为105 bp ，将其克隆至pMD18-T 载体，构建重组质粒标准品pMD-gD-IBRV ，优化反应体系后，建立了快速检测IBRV 的SYBR Green I 荧光定量PCR 方法。

该方法特异性较强，与牛病毒性腹泻病毒（BVDV ）、牛冠状病毒（BCoV ）、牛副流感病毒3型（BPIV3）、牛呼吸道合胞体病毒（BRSV ）均无交叉反应；敏感性试验结果显示，该方法敏感性高，对重组质粒标准品的最低检出限达4.8×100 copies/μL ，高于常规PCR 方法；批内、批间重复性试验的变异系数均小于2%，表明该方法重复性良好；该方法检测的样本阳性率高于常规PCR 方法，利用该方法检测牛场送检的106份临床样品，结果显示IBRV 的阳性率为36.7%，常规 PCR 检测方法检测显示阳性率为33.0%，二者符合率为96.2%，表明该方法更适用于临床样品检测。

本研究建立的IBRV 的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR 检测方法特异性强、敏感性高、重复性好、快速高效，对于IBRV 的检测和流行病学调查具有重要意义。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒；检测方法；gD 基因；实时荧光定量PCR 中图分类号：S852.65文献标志码： B文章编号：1674-6422（2023）06-0140-06Development and Preliminary Application of the SYBR Green I Real-time Fluorescent Quantitative PCR Method for Detection of I nfectious BovineRhinotracheitis VirusWANG Qianying 1, YANG Sen 1, LIU Kexin 1, WANG Chao 2, SUN Feiyan 1, ZHANG Shuqin 1(1. Institute of Special Economic Animal and Plant Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130112, China; 2. Heilongjiang Journal Press of Agricultural Science and Technology, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086, China)收稿日期：2021-08-31基金项目：吉林省重点研发项目（20220202058NC）；国家自然科学基金（31602093）；基本科研业务费（1610342018004）作者简介：王倩颖，女，硕士研究生，主要从事病毒分子生物学研究通信作者：张淑琴，E-mail：***********************牛传染性鼻气管炎病毒SYBR Green Ι实时荧光定量PCR 检测方法的建立与初步应用王倩颖1，杨森1，刘可欣1，王超2，孙飞雁1，张淑琴1（1.中国农业科学院特产研究所，长春130112；2.黑龙江省农业科学院黑龙江农业科技杂志社，哈尔滨150086）2023,31(6):140-145Abstract: To develop a rapid and quantitative assay for detection of Infectious bovine rhinotracheitis virus (IBRV)in this study, speciﬁ c ampliﬁ cation primers were designed based on the conserved region of gD sequence of IBRV genome and an ampliﬁ ed target fragment of 105 bp in length was ligated into pMD18-T vector ton construct the recombinant plasmid standard pMD-gD-IBRV . Subsequently, the SYBR Green I real-time ﬂ uorescence quantitative PCR method was optimized for its reaction parameters and ready for rapid detection of IBRV . The assay was highly speciﬁ c and had no cross reaction with Bovine viral diarrhea virus (BVDV), Bovine coronavirus (BCoV), Bovine parainﬂ uenza virus type 3 (BPIV3) and bovine respiratory syncytial virus (BRSV). The assay also showed high sensitivity with a minimum detection limit of 4.8×100 copies/μL for the recombinant plasmid standard, which was 100 times more sensitive than that of the conventional PCR method. The coefﬁ cients of variation between intra assay and inter assay were less than 2%, indicating that the method· 141 ·王倩颖等：牛传染性鼻气管炎病毒SYBR GreenΙ实时荧光定量PCR 检测方法的建立与初步应用第31卷第6期牛传染性鼻气管炎（i n f e c t i o u s b o v i n e rhinotracheitis, IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV）引起的一种常见的牛呼吸道传染病，该病呈现出热性、急性、接触性的特点，主要临床症状表现为呼吸道症状如鼻炎、流鼻涕、呼吸困难、发热等，易造成鼻腔及气管上纤毛及粘膜的损伤，严重时可感染肺泡内的巨噬细胞，进而削弱呼吸道的防御机制[1]。

标准品制备

荧光定量PCR之绝对定量分析——标准曲线的绘制1. 绝对定量定义绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。

将标准品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应。

以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，绘制标准曲线，对未知样品进行定量时，根据未知样品的CT值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。

* Log(起始浓度)与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，即得到该扩增反应存在的线性关系* 由样品CT值，就可以计算出样品中所含的模板量2. 绝对定量标准品标准品的一些标准* 必须用与扩增目的基因相同的引物进行扩增，并且扩增效率相同* 标准品必须是经过准确定量的（我们通常用的是ASP-3700紫外光/可见光微量分光光度计）* 标准品必须是标准化的（例如，同一化的细胞数）* 在每组实验时，必须用相同的阈值设定来确定CT值标准品可以是含有目的基因的线性化的质粒DNA，也可以是比扩增片段长的纯化后的PCR产物，当然也可以是基因组DNA，甚至cDNA，但前提是所有的作为标准品的核酸都必须保证稳定。

3. 标准品的制备一般一条标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准确性。

一般一个点重复三至五次，对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。

倍比梯度稀释方法：1v原液（标准品i）+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v依次倍比稀释拷贝数的计算：详见核酸拷贝数的计算4. 实例标准品的制作：将标准品依次进行10倍稀释，ASP-3700 测得其拷贝数1.55×108copy /ul 标准曲线的绘制（1cycle=1min）设置对照：浓度为1.55×107、1.55×106、1.55×105、1.55×104、1.55×103、1.55×102、1.55×101的标准样品各一个，设空白对照PCR反应：以不同浓度标准品作为模板标准品的扩增曲线标准品的溶解曲线标准品的标准曲线图XLog 7 6 5 4 3 2 1Y CT值12.01 14.89 17.92 21.18 24.56 27.89 31.25扩增效率（E）计算E=10-1/斜率=10-1/-3.23=2.04，E%=(2.04-1)×100%=104%若未知样本的CT值为19.11，将CT值代入线性方程：即19.11=34.29-3.23X，所以X=(19.11-34.29)/(-3.23)=4.7Quantityunknow=104.7=50118 copies。

copy值计算方法

MW 代表克摩尔，单位dolto 1dolton即表示1g/mol
(6.02*1023)*( ng / ul*10-9)/ (DNA length*660) = copies/ul. 例子：
DNA浓度测定：我的浓度不是很高，但是也够用了，43ng/ul。
计算：
1、首先根据片断长度算出1ng中有多少个copies的产物：
720bp（片断长度）*2（双链DNA）*330（分子常数）=475200Mol
1*10-9（1ng*6.02*1023 ）/475200=1.26*109copies
所以在1ng我的DED1提纯PCR(720bp)产物中，有1.26*109copies。
2、然后根据刚才的DNA浓度测定结果，计算每1ul的提纯产物中有多少copies。
43ng/ul*1ul*1.26*109copies=5.7*1010copies
所以根据计算结果，我们知道了在1ul提纯产物中有5.7*1010copies
首先根据片断长度算出1ng中有多少个copies的产物
copy值计算方法
核酸浓度及拷贝数计算公式
1A 260 吸光度值
ds DNA 50 ug/ml=ss DNA 33 ug/ml=ss RNA 40 ug/ml
核酸浓度＝（OD260）* (dilution factor)*[33 或40或
Hale Waihona Puke 50]= ng/ul

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计算标准品拷贝数
因为硕士的课题是qRT-PCR，所以至今总有人问我如何计算拷贝数的问题，
特此，转载这篇博文，以备不时之需
做 qRT-PCR 的时候经常需要计算 DNA 拷贝数(Copy Number)，比较烦，用下面的方法这就方便多了。

其实计算方法是相通的，只不过一个是带有分步推理过程，一个是直接计算而已！
一、分步推理如何计算核酸拷贝数
1A260吸光度值=dsDNA 50ug/ml=ssDNA 33ug/ml=ssRNA 40ug/ml
核酸浓度＝(OD260)×稀释倍数×(33 或 40 或 50)=ng/ul
MW 代表克/摩尔，单位 dolton：1dolton 即表示 1g/mo l
1 摩尔=6.02×1023摩尔分子(拷贝数)
平均分子量(MW)：dsDNA=碱基数×660 道尔顿/碱基
ssDNA=碱基数×330 道尔顿/碱基
ssRNA=碱基数×340 道尔顿/碱基
得到拷贝数计算公式：6.02×1023拷贝数/摩尔×(浓度)/(MW g/mol)= copies/ml.
即(6.02×1023)×(g/ml)/(DNA length×660)=copies/ml.
或(6.02×1023)×(ng/ul×10-9)/(DNA length×660)=copies/ul.
例：3000 碱基质粒，浓度 100 ng/ul
MW=3000bp×660dalton/bp=1.98×106daltons，即 1mol=1.98×106g(100ng×10-9)g/1.98×106＝摩尔
数
copy 数＝摩尔数×6.02×1023＝3×1010copies/ul.
如何计算拷贝数？
计算方法：(6.02×1023拷贝数/摩尔)×(浓度 g/ml)/(MW g/mol)=copies/ml
[平均分子量(MW g/mol)：dsDNA=(碱基数)×(660 道尔顿/碱基)；ssDNA=(碱基数)×(330 道尔顿/碱基)；ssRNA=(碱基数)×(340 道尔顿/碱基)]
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