高产蛋白酶菌株的选育

课堂报告名称：高产蛋白酶菌株的选育方法武汉轻工大学食品学院王宏勋一、课堂报告依据的知识背景1、遗传变异的物质基础遗传变异有无物质基础以及何种物质可承担遗传变异功能的问题，是生物学中的一个重大理论问题。

利用微生物这一实验对象进行了三个著名的实验，才以确凿的事实证实了核酸尤其是 DNA 才是遗传变异的真正物质基础。

三个经典实验是: 一是1928年进行的转化实验。

二是美国人1952年开展的噬菌体感染实验。

三是1956年创立的植物病毒的重建实验。

朊病毒的发现和思考。

无论是 DNA 还是 RNA 作为遗传物质的基础已是无可辨驳的事实。

但朊病毒的发现对“蛋白质不是遗传物质的定论也带来一些疑云。

PrP 是具有传染性的蛋白质致病因子，迄今未发现蛋白内有核酸，但已知的传染性疾病的传播必须有核酸组成的遗传物质，才能感染宿主并在宿主体内自然繁殖。

那么这是生命界的又一特例呢？还是因为目前人们的认识和技术所限而尚未揭示的生命之谜呢？还有待于生命科学家去认识和探索。

2、遗传物质在细胞内的存在形式除部分病毒的遗传物质是 RNA 外，其余病毒及全部具有典型细胞结构的生物体的遗传物质都是 DNA 。

按其在细胞中存在形式可分成染色体 DNA 和染色体外 DNA 。

原核细胞和真核细胞中的 DNA 存在形式不完全相同。

1）DNA 在原核细胞中的存在方式原核细胞最大的细胞学特点就是无核膜与核仁的分化，只有一个核区称拟核。

其染色体 DNA 处于拟核区，无组蛋白，近年来发现与非组蛋白结合。

结构上为双链环状 DNA 。

几种微生物染色体的物理特性见表。

原核细胞的染色体外DNA 主要指质粒（如 F 因子、 R 因子、 Col 因子）。

2）DNA 在真核细胞中的存在方式真核细胞 DNA分为核 DNA和核外 DNA。

核 DNA即染色体 DNA ，它与组蛋白结合构成具有复杂结构的染色体。

核外DNA是指线粒体和叶绿体等DNA ，其结构与原核细胞的 DNA相似，亦能编码结构蛋白。

3、基因和性状1）基因的概念基因是由丹麦生物学家 W ． Johansen 于 1909 年提出来的，他用“基因”这个述语来代替孟德尔的“遗传因子”。

直到本纪世 50 年代以后，“基因”才有一个较明确的概念。

概括地说：“基因”是一个具有遗传因子效应的 DNA 片段，它是遗传物质的最小功能单位。

2）性状的决定——基因表达性状是构成一个生物个体的有关结构、形态、物质和功能等各方面特征的总称。

基因表达是遗传信息表现为生物性状的过程，这一过程是通过基因产物的生物学功能来完成的。

基因决定性状，而性状则是基因表达的最终结果。

基因依其功能的差别可分成调节基因、操纵基因和结构基因 3 大类。

结构基因是为细胞结构、组成( 如细胞生化反应所需的酶 )及完成细胞功能所需的蛋白质等进行编码的基因。

调节基因：用于编码组成型调节蛋白的基因。

操纵基因：是位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能与调节蛋白相结合，以此来决定结构基因的转录是否能进行。

蛋白的表达不仅受结构基因控制，同时也受调节基因和操纵基因的调控。

生物体的遗传信息通过“中心法则” ( 少数生物以“逆转录”方式 ) 来完成世代间的传递，从而保证世世代代性状的相似性。

3）基因突变突变是生物的基本属性，在广义上，突变是指染色体数量、结构及组成等遗传物质发生多种变化，包括基因突变和染色体畸变。

一个基因内部遗传结构或 DNA 序列的任何改变，而导致的遗传变化称为基因突变。

其发生变化的范围很小，所以又称点突变。

染色体的畸变是指由染色体的大段损伤引起的。

包括大段染色体的缺失、重复、倒位等。

基因突变是重要的生物学现象，它是一切生物变化的根源。

连同基因转移、重组一起提供了推动生物进化的遗传多变性。

（1）遗传信息的改变。

不同的碱基变化对遗传信息的改变是不同的，可分为四种类型：①同义突变；②错义突变；③无义突变；④移码突变（2）表型变化。

包括以下几种类型：①营养缺陷型；②抗性突变型。

③条件致死突变型。

④形态突变型。

另外还有抗原突变型、产量突变型等。

（3）突变率和基因符号每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率，称突变率。

例如，突变率为 10-8的，即指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。

突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株的数目来表示。

例如，一个含 108个细胞的群体，当其分裂为2×10 8个细胞时，即可平均发生一次突变的突变率也是 10-8。

常用的基因突变符号：每个基因座位用其英文单词的头3 个英文字母的小写来表示，如组氨酸：his；其座位上的不同基因突变则在 3 个英文小写字母后加一个大写字母表示，如 hisA、hisB 代表组氨酸的A 基因和B 基因；在 3 个字母的右上方可用不同符号表示微生物的突变型，如 his+、his-分别表示组氨酸原养型和缺陷型，gal+、gal-分别表示能发酵半乳糖和不能发酵半乳糖，str s、str r，分别表示对链霉素敏感和具抗性。

（4）突变的特点①不对应性。

指突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。

这是突变的一个重要特点，也是容易引起争论的问题。

②自发性。

各种性状的突变，可以在没有人为的诱变因素处理下自发地产生。

③稀有性。

自发突变虽可随时发生，但其突变率却是极低和稳定的，一般在 10 -6 -10 -9 之间。

④独立性。

突变的发生一般是独立的，即在某一群体中，既可发生抗青霉素的突变型，也可发生抗链霉素或任何其他药物的突变型，而且还可发生其他任何性状的突变型。

某一基因的突变，既不提高也不降低其他任何基因的突变率。

⑤诱变性。

通过诱变剂的作用，可以提高上述自发突变的几率，一般可提高 10-10 5 倍。

不论是通过自发突变或诱发突变 ( 诱变 ) 所获得的突变株，其间并无本质上的差别，这是因为，诱变剂仅起着提高诱变率的作用。

⑥稳定性。

由于突变的根源是遗传物质结构上发生了稳定的变化，所以产生的新的变异性状也是稳定的、可遗传的。

、⑦可逆性。

由原始的野生型基因变异为突变型基因的过程，称为正向突变，相反的过程则称为回复突变或回变实验证明，任何性状都可发生正向突变，也都可发生回复突变。

（5）诱变机制。

自发突变的频率是很低的，许多理化学、物理和生物因子能提高其突变的频率。

凡能提高突变率的任何理化因子，都可称为诱变剂。

所谓诱变剂并非是用诱变剂产生新的突变，而是通过不同的方式提高突变率。

主要包括碱基的置换、移码突变、染色体畸变等。

4）DNA 损伤的修复微生物能以多种方式去修复损伤后的 DNA ，主要有以下两种：(1) 光复活作用。

把经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用。

光复活由 phr基因编码的光解酶 PHr 进行。

PHr 在黑暗是专一性地识别嘧啶二聚体，并与之结合，形成酶 -DNA 复合物，当给予光照时，酶利用光能（ PHr 本身无发色基团，与损伤的 DNA 结合后才能吸收光，起光解作用）将二聚体拆开，恢复原状，酶再释放出来。

由于在一般的微生物中都存在着光复活作用，所以在进行紫外线诱变育种时，只能在红光下进行照射及处理照射后的菌液。

(2) 暗修复作用，又称切除修复。

该修复系统除了碱基错误配对和单核苷酸插入不能修复外，几乎所有其他 DNA 损伤均可修复，是细胞内的主要修复系统，涉及到 UvrA 、 UvrB 、 UvrC 和 UvrD 四种蛋白质的联合作用。

另外还有重组修复、 SOS 修复等方式。

4、突变与育种1）自发突变与育种（1）从生产中选育。

在日常的大生产过程中，微生物也会以一定频率发生自发突变。

富于实际经验和善于细致观察的人们就可以及时抓住这类良机来选育优良的生产菌种。

例如，从污染噬菌体的发酵液中有可能分离到抗噬菌体的自发突变株。

（2）定向培育优良品种是指在某一特定条件下，长期培养某一微生物菌群，通过不断转接传代以积累其自发突变，并最终获得优良菌株的过程。

由于自发突变的频率较低，变异程度较轻微，故用此法育种十分缓慢。

2）诱变育种诱变育种是通过人工方法处理微生物，使之发生突变，并运用合理的筛选程序和方法，把适合人类需要的优良菌株选育出来的过程。

人工诱变与自发突变相比可大大提高微生物的突变率，使人们可以简便、快速地筛选出各种类型的突变株，作生产和研究之用。

（1）诱变育种一般性原则①挑选优良的出发菌株。

出发菌株是指用于育种的起始菌株。

有利性状：高产、生长速度快、营养要求粗放、产孢子早而多的菌株等。

②选择简便有效的诱变剂。

在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果下，应选用最方便的因素；而在同样方便的情况下，则应选择最高效的因素。

在物理诱变剂中，尤以紫外线为最方便，而化学诱变剂中，以 NTG 最为有效。

③处理单孢子（细胞）菌悬液。

在诱变育种中，所处理的细胞必须是单孢子或单细胞悬液状态。

其目的是：一方面分散状态的细胞可以均匀接触诱变剂；另一方面又可避免长出不纯菌落。

在某些微生物中，即使用这种单细胞悬液来处理，还是很容易出现不纯菌落，这是由于在许多微生物的细胞内同时含有几个核的原故。

④选用最适剂量。

各种诱变剂有不同的剂量表示方式。

剂量一般指强度与作用时间的乘积。

化学诱变剂常以一定温度下诱变剂的浓度和处理时间来表示。

⑤充分利用复合处理的协同效应。

⑥设计或采用高效筛选方案或方法。

筛选方案：在实际工作中，一般认为应采用把筛选过程分为初筛与复筛两个阶段的筛选方案为好。

前者以量（选留菌株的数量）为主，后者以质（测定数据的精确度）为主。

筛选方法：初筛可在平板上进行，也可在摇瓶中进行，两者各有利弊，复筛必须在摇瓶中进行，并作精确测定。

5、基因重组凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新重组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组。

重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。

基因重组是杂交育种的理论基础。

由于杂交育种选用已知性状的供体菌和受体菌作为亲本。

因此比诱变育种前进了一大步。

同时也可消除某一菌株长期诱变导致产量上升缓慢现象。

因此它是一种重要的育种手段。

1）原核微生物的基因重组。

主要包括转化、转导（普遍性转导、局限性转导）、接合、原生质体融合。

2）真核微生物基因重组。

在真核微生物中，基因重组主要有有性杂交、准性杂交、原生质体融合和转化等形式。

6、基因工程基因工程是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生物表现出新的性状。

基因工程是在 20 世纪 70 年代开始出现的，三项关键技术的建立为基因工程奠定了基础，这三项技术是： DNA 的特异切割、 DNA 的分子克隆和DNA 的快速测序。

这项技术使人类能定向改造基因，编码特定蛋白，从此人类获得了主动改造生命的能力。