慢病毒纯化
慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染
慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染一、包装1.包装细胞Lenti-X™ Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf（P11）; Lenti-X™ shRNA Expression Systems User Manual.pdf(P16)2.病毒载体及包装质粒病毒载体：DNA组构建及中量提取；包装质粒：商品化产品（Lenti-X™ Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf（P12）; Lenti-X™ shRNA Expression Systems User Manual.pdf(P17)）或DNA中量提取（目前唯一使用来源）；3.细胞转染方法一：Lenti-X™ Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf（P12）;Lenti-X™ shRNA Expression Systems User Manual.pdf(P17)；方法二：按照Lipofectamine™LTX & Plus Reagent (Cat.No.15338,invitrogen)进行，简要中文说明如下：a. 转染前24小时，把4–5 x 106个293T细胞传代至10cm培养皿中，加入完全培养基至终体积10ml，培养过夜，转染时，细胞密度为80–90%；b. 293T细胞转染前2小时换上9ml新鲜的完全培养基；c. 用之前充分混匀PLUS Reagent，在EP管中加入15ug的DNA混合物(pLVX-shRNA Plasmid DNA：pMDLg：pRes-Rev：pCMV-VSV-G 的摩尔比为1：1：1：1)，15ul的PLUS Reagent，用Opti-MEM定容到500ul，标记为Tube 1，温和混匀，室温孵育5分钟；d. 充分混匀Mix Lipofectamine LTX，在EP管中加入45ul的Mix LipofectamineLTX和455ul的Opti-MEM，标记为Tube 2，温和混匀；e. 将Tube 1的溶液加到Tube 2中，温和混匀，室温孵育5分钟；Tube 1 (Plasmid DNA) Tube 2 (LTX)15ug DNA MIX(pLVX-shRNA Plasmid DNA：455 µl Opti-MEMpMDLg：pRes-Rev：pCMV-VSV-G=1:1:1:1)15 µl PLUS Reagent 45 µl Mix Lipofectamine LTX Up to 500µl Opti-MEM 500 µl Total V olume500 µl Total Volumef. 将1 ml 转染复合物逐滴加入前一天种好细胞的100mm皿中，边加边摇匀。
高滴度慢病毒的制备和纯化
高滴度慢病毒的制备和纯化Production, Purification of Lentivirus forHigh-titer吴渊 潘建青 罗振 王立平摘 要 基于人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的慢病毒载体是一种广泛用于体外和动物实验的转基因载体。
慢病毒载体可以感染分化和非分化细胞，被感染的细胞长期稳定的表达转基因产物。
最近，慢病毒载体已经被广泛地应用于中枢神经系统的转基因研究。
本文将介绍一种新的慢病毒制备方法。
本方法制备和纯化的慢病毒可直接用于在活体中标记细胞特异性的神经元。
关键词 慢病毒；光感基因调控技术ABSTRACT Lentivirus vector based on the human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) is primarily a research tool to introduce a gene product into in vitro systems or animal models. The advantage of lentivirus vector is the ability for gene transfer and integration into dividing and non-dividing cells. Recently, the lentivirus system is used to transduce heterologous gene efficiently into central neural system. In this paper, we propose a novel protocol for lentivirus production. The highly purified and concentrated viruses can be used in cell-specific and in vivo neural labeling. KEYWORDS Lentivirus; Optogenetics1 引言慢病毒(lentivirus)为一类逆转录病毒的总称, 是基于人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)改建而来的载体系统，以其高效而稳定的特点被作为基因治疗动物实验的常用选择。
慢病毒收毒及纯化 SOP
慢病毒收毒及纯化标准操作细则1. 目的：规范慢病毒收毒及纯化标准操作程序2. 范围：适用于慢病毒收毒及纯化操作工序3. 操作程序3.1器材准备无菌10ml玻璃吸管、电动移液枪、50ml离心管，移液枪、各种枪头，1.5mL EP管、试管架，酒精灯、荧光显微镜、CO2培养箱、生物安全柜, 15ml超滤管、0.22μm滤膜、50mL无菌注射器、1mL无菌注射器,离心机3.2溶液准备OMEM培养基,1640培养基，FBS（gemini）3.3操作步骤3.3.1收集转染后48小时的细胞上清液于一个50ml离心管中，并更换10mL新的1640培养基，72小时（从转染开始计时）后再收集一次，并混合到一起。
3.3.2 4000rpm，离心5分钟，用0.22μm滤膜过滤收集好的上清液到新的50ml离心管中。
3.3.3准备一个15ml的超滤管，将过滤收集的上清液，根据上清液毫升数，分批次加入超滤管中（每次大约加入5ml）进行离心，4000rpm，离心10-15分钟，根据具体情况调整离心时间。
3.3.4每离心完成一次后，把管底部的废液弃掉，再加入新的上清液继续离心，最后一次离心完后，超滤管中保留500ul左右的病毒液，然后用移液器反复吹悬超滤管中病毒液，转移到无菌的EP管中。
3.3.5收集重悬后的慢病毒浓缩液于1.5mL离心管中，并做好标记，以10000rpm离心5min，以进一步去除其他杂质颗粒。
3.3.6用一支2mL注射器收集离心后的上清液，用0.22μm滤膜过滤于另一支干净的1.5mL EP管中，做好标记。
3.3.7根据需要将过滤后的样品进行小体积（50μL或20μL）分装，保留部分样品～20μL用于滴度检测，并做好标记，贴好标签。
填写入库记录，并将分装好的病毒进行入库，保存于-80℃冰箱。
3.4清场3.4.1物品集中在废液桶中灭菌后清洗。
3.4.2操作室台面用75%酒精擦拭消毒后，开启紫外灯进行灭菌。
慢病毒纯化
慢病毒纯化引言慢病毒（Slow virus）是一类具有潜伏期长、传播缓慢的病毒。
它们主要侵害中枢神经系统，引起一系列慢性疾病，如亚急性硬化性全脑炎、破伤风等。
由于慢病毒的潜伏期长、传播缓慢，对患者的治疗和预防带来了极大的困难。
因此，对慢病毒的纯化研究至关重要。
纯化方法慢病毒纯化是将慢病毒分离和提纯出来的过程。
常用的慢病毒纯化方法包括超速离心法、聚合物沉淀法、密度梯度离心法等。
以下将介绍使用密度梯度离心法进行慢病毒纯化的步骤和技术要点。
材料准备•脑组织样本（含有慢病毒）•PBS缓冲液•10% Triton X-100•加碘氯仿•硫酸铂•Sucrose•KBr步骤1.准备慢病毒感染的脑组织样本，并用PBS缓冲液进行冲洗，去除杂质。
2.将脑组织样本加入适量的PBS缓冲液中。
3.加入10% Triton X-100，破解细胞膜并释放病毒。
4.使用高速离心将细胞碎片和杂质从悬浮液中分离出来。
5.收集上清液，加入加碘氯仿，离心使其分离。
6.将上清液转移到新离心管中，然后加入一定浓度的硫酸铂。
7.使用离心机进行高速离心，使病毒与硫酸铂结合。
8.分离上清液，加入Sucrose溶液中。
9.准备密度梯度离心管，将上清液缓慢地加入离心管中。
10.使用超速离心机进行离心，使病毒在密度梯度中分离。
11.分离纯化后的病毒。
技术要点密度梯度离心法密度梯度离心法是一种根据物质密度差异来分离混合物的方法。
在慢病毒纯化中，通过在离心管中制备密度递增的梯度，利用不同物质在梯度中的沉降速度差异来实现病毒的分离和纯化。
脑组织样本处理脑组织样本是进行慢病毒纯化的关键原料。
在收集脑组织样本后，应及时用PBS缓冲液进行冲洗，去除杂质。
通过加入10% Triton X-100等破解细胞膜的方法，可以有效释放慢病毒。
超速离心机超速离心机是进行密度梯度离心的必备设备，具有高速、高精度离心的特点。
合理设置超速离心机的离心参数，如转速、离心时间等，有助于提高慢病毒纯化的效果。
慢病毒实验方法
慢病毒包装、浓缩纯化及滴度测定一、试剂、耗材及仪器1.1试剂1.1.1 商品化试剂及试剂盒名称厂家货号Lenti-X 293T Cell Line clontech632180 DMEM Gibco C11995500BTFetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin LifeTechnologies10099-141Lipofectamine™LTX & Plus Reagent invitrogen15338 QIAGEN Plasmid Midi Kit (25)QIAGEN121431.1.2 试剂配制a. 氨苄青霉素储液称取氨苄青霉素10g，加8ml 超纯水，溶解，定容至10 ml，过滤除菌，分装，-20℃保存。
b. LB液体培养基实用文档称取蛋白胨（tryptone）10g、酵母提取物（yeast extract）5g、NaCl 10 g，加800 ml 超纯水，用10M NaOH调节pH至7.0，定容至1, 000 ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。
c. 完全培养基把DEME培养基与血清按照9:1(V/V)进行混合。
d. 50%PEG6000溶液称取125gPEG6000用超纯水溶解，定容到250ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。
e. 4M NaCl溶液称取46.752gNaCl，加超纯水溶解，定容到200ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。
f. PBS缓冲液称取8gNaCl，0.2gKCl，3.58gNa2HPO4.12H2O，0.27gKH2PO4，加800 ml 超纯水，调节pH至7.4，定容至1, 000 ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。
实用文档1.2 耗材名称厂家货号25cm2 Growth Area Flasks corning430639 75cm2细胞培养瓶corning430641 TC表面细胞培养皿，规格：35mm corning430165 TC表面细胞培养皿，规格：60mm corning430196 TC表面细胞培养皿，规格：100mm corning430293 6孔细胞培养板corning3516外旋盖冻存管corning430659 15ml尖底离心管corning430790 50ml尖底离心管corning4558 3毫升吸管Biologix30-0138A1 1.3 仪器名称仪器厂家仪器型号二氧化碳培养箱Thermo371生物安全柜Thermo Forma Class II，B2倒置荧光显微镜OLYMPUS IX71实用文档台式高速冷冻离心机Thermo LEGND MACH 1.6R小型高速离心机Thermo LEGEND MICRO 17小型冷冻高速离心机Thermo LEGEND MICRO 17R超低温冰箱SANYO MDF-U73V冰箱Haier BCD-290W二、方法2.1．包装细胞准备2.1.1.细胞复苏a. 把完全培养基预热至37℃；用清洗洁净的500ml烧杯盛300ml超纯水，然后放入37℃水浴锅中，预热至37℃（至少需30min）；准备好生物安全柜及所需培养耗材（灭菌处理）；b. 快速从液氮罐中取出装有冻存细胞的冻存管并放置于装有液氮的保温杯中，用洁净镊子取出冻存管，并立即放入上述准备好的水浴中（放入之前快速检查盖子是否拧紧，盖子切勿没入水中），用镊子镊好冻存管，快速沿着烧杯内壁转圈，细胞未冻融时切勿取出观察，细胞冻融时间一般为1-2 min，如果超过2 min仍未冻融，应掉弃该管细胞，细胞冻融后把冻存管放入70%酒精中3s，然后立即放入生物安全柜中；实用文档c. 把冻融的细胞立即转移至装有1ml预热完全培养基的15ml离心管中，混匀，立即加入4ml预热完全培养基，混匀；d. 加入5ml预热完全培养基，混匀，离心（100 g，5 min），小心移除上清；e. 加入6 ml预热完全培养基，吹打重悬细胞，然后把细胞悬液转移至T25培养瓶中，并放入二氧化碳培养箱（5% CO2, 37℃）中培养；f. 24小时观察细胞的贴壁情况，并根据细胞的密度进行换液或细胞传代；2.1.2细胞培养a. 当细胞达到80%融合时，移培养液，用PBS洗涤两次，加入1ml胰酶消化液，把培养皿置于倒置显微镜下观察，如大部分细胞变圆，立即移除胰酶消化液（如大部分细胞飘起，可不移除胰酶消化液），加入6ml 预热DMEM完全完全培养基，用吸管取培养液吹打瓶壁细胞，使其脱离瓶壁形成单细胞悬液，离心（100 g，5 min），小心移除上清，加入10ml预热完全培养基，吹打重悬细胞用细胞计数板在显微镜下计算细胞数，取1*106细胞分装入新T75培养瓶，添加基至总体积为20ml，置于37 ℃、5 %CO2 培养箱中培养；每隔2～3天传代1次，实验用第2～3代细胞。
慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤
资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容一、包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。
所以要在细胞购进时就进行冻存。
2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。
4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。
5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6. 细胞计数。
7.将细胞离心，1000rpm，2min。
8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。
10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
二、293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2. 消化细胞，方法同上。
3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
密度为3×105个/ml。
4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。
三、293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。
2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。
3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。
4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。
5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
慢病毒的浓缩与纯化PEG浓缩法
慢病毒的浓缩与纯化P E G浓缩法
公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]
慢病毒的浓缩与纯化——PEG-8000浓缩法
实验试剂
1. NaCl
2. PEG8000
实验设备
1. 高压灭菌锅
2. μm滤头
3. 高速离心机
4. 低温冰箱
实验步骤
1. 5X PEG8000 NaCl配制称取NaCl g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q 纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃。
2. 使用μm滤头过滤慢病毒上清液；
3. 每30ml过滤后的病毒初始液，加入5X PEG-8000 NaCl母液 ml；
4. 每20～30min混合一次，共进行3-5次；
5. 4度放置过夜；
6. 4度，4000 g，离心 20min；
7. 吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；
8. 加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；
9. 集中后的病毒悬液分装成50 μl每份，保存在成品管中。
用碎干冰速冻后储存在-80 ℃。
一种慢病毒的纯化方法[发明专利]
![一种慢病毒的纯化方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/de3056355e0e7cd184254b35eefdc8d376ee1412.png)
专利名称：一种慢病毒的纯化方法专利类型：发明专利
发明人：龙炎杏,胡清云,刘彩云,许澎申请号：CN202111136995.0
申请日：20210927
公开号：CN113980916A
公开日：
20220128
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种慢病毒的纯化方法，该纯化方法是在纯化的浓缩过程中使用一定浓度的PEG(添加KCl或NaCl)按比例与病毒上清进行混合，离心，得到慢病毒沉淀；用PBS溶解，对获得的慢病毒悬液进行核酸酶Benzonase酶切处理；添加鱼精蛋白进行沉淀慢病毒，添加1mol/LNaCl溶解病毒，离心，得到初纯化的慢病毒悬液；再经过蔗糖密度梯度离心，获得纯化的慢病毒。
本发明制得的慢病毒纯化液无外源因子污染，细胞宿主蛋白、宿主DNA残留度低，安全性好，纯度和滴度高，可达到动物实验及临床要求。
申请人：湖南丰晖生物科技有限公司
地址：410081 湖南省长沙市高新开发区麓云路100号兴工科技园3栋4层402房
国籍：CN
代理机构：长沙大珂知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：伍志祥
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慢病毒纯化
慢病毒纯化是指从慢病毒病毒培养物中分离和纯化出慢病毒颗粒的过程。
这个过程通常包括以下步骤：
1.细胞培养：首先，需要将慢病毒所感染的细胞系培养到适
当的细胞密度和病毒扩增时间，以确保足够的病毒产量。
2.细胞裂解：将培养的细胞收集并经过离心等方法分离，然
后使用裂解缓冲液裂解细胞，释放出细胞内的慢病毒。
3.离心和过滤：经过细胞裂解后，样品需要进行离心，以去
除细胞碎片和核酸残余物。
然后，可以使用过滤器对澄清
的上清液进行过滤以去除大颗粒物质。
4.病毒浓缩：慢病毒通常是低浓度的，因此需要进行浓缩。
可以使用超滤、离心和沉淀等方法，将病毒颗粒从大量液
体中浓缩到较小的容量中。
5.梯度离心：为了进一步纯化病毒，可以使用梯度离心技术，
如葡聚糖梯度离心或离心浓缩。
这个过程可将纯化的病毒
与细胞碎片、蛋白质和其他污染物分离开来。
6.病毒沉淀：经过梯度离心后，可以进行病毒的最终沉淀。
使用离心来将病毒沉淀到盘底或在离心管底端形成浓缩的
沉淀。
7.再悬浮：将病毒沉淀用缓冲液再悬浮，以便进行后续实验
应用。
在整个慢病毒纯化的过程中，必须遵守基本的生物安全措施，
并使用无菌操作、合适的缓冲液和处理设备。
每一步之间的温度、离心速度和离心时间等参数也需要根据具体的实验条件和病毒类型进行优化和调整。