甘油化时滴速对冰冻解冻去甘油红细胞质量影响
冰冻-解冻-去甘油过程红细胞形态变化与损伤相关性的探讨
冰冻-解冻-去甘油过程红细胞形态变化与损伤相关性的探讨林豪;黄文华;江伟梅;林建霞;陈灯锦【期刊名称】《临床输血与检验》【年(卷),期】2018(020)002【摘要】Objective To study the correlation between the changes of RBCs morphology and injury in the process of freezing–thawing–deglycerolizing. Methods The matching design method was employed to prepare frozen RBCs and thawed deglycerolized RBCs. Method 1 : without supernatant glycerol reduction before being frozen. Method 2 : supernatant glycerol reduction by centrifugation before being frozen. Take samples for blood routine test and free hemoglobin (FHb) content detection in the process of freezing–thawing–deglycerolizing, analysis the shape variation of red blood cells and its correlation with injury. Result (1) In the process of freezing–thawing–deglycerolizing, volume of red blood cell increase due to glycerolize ,and then recovery due to deglycerolize. Compare with the method 2 and method 1, mean corpuscular volume (MCV) of glycerolized RBCs (before being frozen) and thawed deglycerolized RBCs increased (P<0.01, P<0.05);(2) The destruction of red blood cells is distributed in three processes, deglycerolizing process (63.20±10.99) %, glycerolizing process (30.78±10.47) %, freezing-thawing process (6.02±4.11) %, no statistical difference between two kinds of preparation methods.(3) the red blood cell damage is moderate negative correlation with volume changerate of glycerolized RBCs ; (4) with the extension of storage time, free hemoglobin content of thawed deglycerolized RBCs gradually increased. In which the 0.9% NaCl suspension thawed deglycerolized RBCs, the content of FHb showed significantly different 12 h and 24 h after preparation as well (P<0.05).In which the MAP suspension thawed deglycerolized RBCs, the content of FHb showed significantly different 21d and 28d after preparation as well (P<0.05).Conclusion In the process of freezing–thawing–deglycerolizing, red blood cell damage is negatively related to its deformation ability, and the damage mainly happens on the deglycerolizing process. The removal of supernatant glycerol by centrifugation caused the red cell membrane skeleton to be damaged by the shear stress, thereby adversely affecting the storage quality of the thawed deglycerolized RBCs.%目的探讨冰冻-解冻-去甘油过程中红细胞形态变化与其损伤的相关性.方法依据配对设计原理,采用冻存前保留红细胞外多余甘油溶液(方法1)和冻存前离心去除红细胞外多余甘油溶液(方法2)的两种常规方法,制备冰冻解冻去甘油红细胞,对冰冻-解冻-去甘油过程各关键制备节点留取的样本,进行血常规及上清游离血红蛋白(FHb)含量的检测,分析红细胞形态变化及其与损伤的关联.结果①冰冻-解冻-去甘油过程红细胞因甘油化而体积增大,后因去甘油化而复原,方法2较之方法1甘油化红细胞(冻存前)和冰冻解冻去甘油红细胞的平均体积(MCV)增高(P<0.01,P<0.05);②冰冻-解冻-去甘油过程中红细胞损伤分布依次为:去甘油化过程(63.20±10.99) %、甘油化过程(30.78±10.47)%、冰冻解冻过程(6.02±4.11)%,两种制备方法间差异无统计学意义;③红细胞破坏与甘油化过程红细胞体积变化率呈中度负相关;④随着贮存时间的延长,冰冻解冻去甘油红细胞上清游离血红蛋白含量逐渐增加,0.9 %氯化钠悬浮冰冻解冻去甘油红细胞储存12 h、24h,MAP悬浮冰冻解冻去甘油红细胞储存21 d、28 d,两种制备方法间差异有统计学意义(P<0.05).结论冰冻-解冻-去甘油过程中红细胞损伤与其变形能力呈负相关,且损伤主要发生在去甘油化过程,冻存前离心去除红细胞外多余甘油溶液导致红细胞膜骨架因剪切力作用而受损,进而对冰冻解冻去甘油红细胞贮存质量产生不利影响.【总页数】4页(P141-144)【作者】林豪;黄文华;江伟梅;林建霞;陈灯锦【作者单位】350004 福州,福建省血液中心血液制备科;350004 福州,福建省血液中心血液制备科;350004 福州,福建省血液中心血液制备科;350004 福州,福建省血液中心血液制备科;350004 福州,福建省血液中心血液制备科【正文语种】中文【中图分类】R331.1+41【相关文献】1.高碘酸钠法检测冰冻解冻去甘油红细胞中甘油残留量方法的探讨 [J], 杨夏;赵磊;白旭华2.应用MAP在4℃条件下保存冰冻解冻去甘油红细胞的质量变化 [J], 王凯;陈新;张网兰;李丽君;周春燕;宋彩萍;旁丽花3.红细胞保存液保存冰冻解冻去甘油红细胞的效果 [J], 王惟;李丹;刘薇4.冰冻解冻去甘油红细胞制备过程质量控制方法 [J], 张雅莉;张贝;靳朝霞;赵晓华;刘建强;黄蕾5.甘油化时滴速对冰冻解冻去甘油红细胞质量影响 [J], 柴婷婷因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
冰冻红细胞的制备与应用分析
冰冻红细胞的制备与应用分析目的研究并探讨冰冻红细胞的制备方法及应用价值。
方法对100份悬浮红细胞（2016年6月～2017年1月本站采集2～6d内的RH（D）阴性红细胞16U）标本在不同条件下进行制备，制备方法为甘油化、去甘油化，分别在不同放置时间、不同离心速度下将其制备成冰冻红细胞，比较加甘油后不同放置时间的甘油残留量、去甘油化过程中不同离心速度的各项冰冻红细胞参数。
结果加甘油后不同放置时间下，放置30min的标本甘油残留量明显低于放置15min的标本（P＜0.05）；不同离心速度下，去甘油化后冰冻解冻红细胞的各项参数均符合国家质检标准，离心速度2600转/min的标本其甘油残留量、体外溶血率、游离血红蛋白均明显低于离心速度3300转/min的标本（P＜0.05），且其红细胞回收率明显高于离心速度3300转/min的标本（P＜0.05）。
结论对红细胞标本进行甘油化、去甘油化制备，可获得优质冰冻红细胞，有利于保证输血的安全性，缓解血液供需矛盾。
[Abstract] Objective To study and explore the preparation method and application value of frozen red blood cells. Methods 100 suspension with white and red cell specimens （RH（D）negative erythrocyte 2-6d（16U）were collected in this station from June 2016 to January 2017）were prepared under different conditions.The frozen red blood cells were preparated by the preparation method of glycerol and glycerol，respectively in different time and different centrifugal speed under，at different times after the addition of glycerol for glycerol residues，red blood cell the parameters of different centrifugal speed in the process of freezing glycerol. Results The time of different placement with glycerol，glycerol residues placed specimens of 30min were significantly lower than that of 15min（P＜0.05）were placed.Different centrifugal speeds，deglycerolizing after the parameters of frozen thawing red blood cell were in line with national quality inspection standards，centrifugal speed 2600rpm /min were the glycerol residue and residual white blood cells in vitro，and free hemoglobin were significantly lower than that of centrifugal speed 3300rpm/min samples （P＜0.05），and the recovery rate of RBC was significantly higher than that of centrifugal speed 3300rpm/min samples （P＜0.05）. Conclusion The red blood cells can be obtained by high quality frozen red blood cells.It is helpful to ensure the safety of blood transfusion and relieve the contradiction between supply and demand of blood.[Key words] Frozen red blood cells；Preparation；De glycerol；Blood transfusion冰凍红细胞是利用冰冻保护剂将红细胞保存于低温环境下，冰冻红细胞的保存时间长，且能够维持红细胞原有的ATP及2，3-dpg水平，可有效解决患者急救输血，同时，自身輸血还可防止输血反应与输血相关疾病的传播。
红细胞保存液保存冰冻解冻去甘油红细胞的效果
红细胞保存液保存冰冻解冻去甘油红细胞的效果王惟;李丹;刘薇【期刊名称】《临床输血与检验》【年(卷),期】2015(017)005【总页数】2页(P465-466)【关键词】冰冻红细胞;冰冻解冻红细胞;红细胞保存液(MAP)【作者】王惟;李丹;刘薇【作者单位】130031 长春,吉林省血液中心;130031 长春,吉林省血液中心;130031 长春,吉林省血液中心【正文语种】中文【中图分类】R331.1+41冰冻解冻去甘油红细胞为RH(－)血，是用于临床的主要血液成分，自20 世纪70 年代Mery man 将甘油保存红细胞用于人体输血首获成功以来，冷冻血逐渐在临床输血治疗中得到推广［1］。
冷冻血经过洗涤去除了大部分白细胞、血小板、血浆蛋白，能降低不良输血反应的发生率并能随时储备，使临床患者输注更加方便，争取了抢救时间，本中心血站日常用生理盐水保存有效期仅为24 h，为使临床更方便用血避免血液浪费，现用红细胞保存液(MAP)保存冰冻解冻去甘油红细胞，观察是否可以延长其保存期，结果如下。
材料与方法1 用血液保存液Ⅲ保存6 d 内的去白细胞红细胞的悬液均为400 ml(2 U)，20袋复方甘油溶液(北京博得桑特)，9%浓氯化钠(北京博得桑特)，0.9%氯化钠(山东威高集团)，红细胞保存液(MAP)(广州费森尤斯)。
全自动红细胞处理仪(美技)，6000i 贺利式离心机(德国)，－80℃低温冰箱(日本三洋)，水浴箱(余姚)，振荡器(金坛)。
2 制备方法2.1 红细胞甘油化:分A、B 两组，各组10 袋，按常规操作离心2 200 r/min 25 min 去除上清，滴加57%复方甘油，每单位160 ml，振荡器60 次/min，每袋15～20 min 滴加完毕，室温静止30 min 后，置－80℃低温冰箱速冻保存1 个月后待用。
2.2 复融去甘油化:将冰冻红细胞从－80℃低温冰箱中取出迅速侵入37℃～42℃恒温水浴箱内融化，动作要轻柔，每袋融化5～6 min 并检查有无渗漏，用全自动红细胞处理仪P215 进行洗脱甘油后，A 组10 袋用0.9%氯化钠保存，B 组10 袋用红细胞保存液(MAP)保存并无菌分装各10袋，分别保存10 d 和25 d。
甘油保护剂对冷冻干燥保存红细胞作用的实验研究
上海理工大学学报 第28卷 第5期J.University of Shanghai for Science and Technology Vol.28 No.5 2006 文章编号:1007-6735(2006)05-0413-05甘油保护剂对冷冻干燥保存红细胞作用的实验研究何 晖1, 刘宝林1, 华泽钊1, 沈 敏2, 陈 颖2(1.上海理工大学动力工程学院,上海 200093;2.上海安图医院血液检验科,上海 200093)摘要:应用甘油作红细胞冷冻干燥保存的保护剂,研究甘油对红细胞的保护机制.红细胞用不同质量分数(0,20%,40%)的甘油前处理后,冻干保存前后分别检查红细胞的相关指标.结果显示,40%甘油前处理的红细胞冻干保存效果最佳,红细胞回收率和血红蛋白回收率分别达到55.3%和63.4%;红细胞渗透脆性和超氧化物歧化酶(SOD)活力与冻干保存前无明显差别.该研究为使用甘油作红细胞冻干保存的保护剂提供了实验基础.关键词:冷冻干燥;红细胞;甘油;前处理中图分类号:TS205.7 文献标识码:AG lycerol pretreatment improves the preservation qu alityof red blood cells by freeze dryingHE Hui1, LIU Bao2lin1, HUA Ze2zhao1, Shen Min2, Chen Y ing2(1.College of Power Engineering,U niversity of S hanghai f or Science and Technology,S hanghai200093,China;2.Institute of Blood Test,S hanghai A ntu Hospital,S hanghai200093,China)Abstract:Successful storage of red blood cells(RBCs)by freeze drying technique has important impli2 cations in blood transfusion and clinical medicine.G lycerol is a type of permeable intracellular lyopro2 tective agents,which can increase the concentration of cytoplasm of the red blood cells and then en2 hance the possibility of glass transition during freeze drying process.The effects of glycerol on the preservation of freeze dried human red blood cells are investigated,0%,20%and40%glycerol solu2 tions are used.The results demonstrate that glycerol has remarkable effects on the cell viability.The maximum viability of red blood cells is55.3%after pretreatment with40%glycerol solution.The re2 covery of hemoglobin is63.4%.The results provide fundamental information for long term preserva2 tion of RBCs by freeze drying.Osmotic fragility data show that glycerol exerts osmotic protection on RBCs during freeze drying.The levels of superoxide dismutase(SOD)are of no significant difference from that of fresh RBCs.K ey w ords:f reeze dryi ng;red blood cells;glycerol;pre t reat ment 收稿日期:2005-12-20 基金项目:国家自然科学基金资助项目(50376040,50576059);上海市重点学科建设资助项目(P0502);上海市引进海外高层次留学人员专项博士点资金资助项目(20050252002) 作者简介:何 晖(1977-),男,博士研究生. 红细胞保存方法有两种[1]:a.4℃冰箱保存,保存期42d以内.由于保存温度相对较高,该法存在因细菌繁殖导致血液污染的危险以及运输震荡引起溶血的问题;b.-80℃冰冻保存或-196℃深低温保存,保存期3～10a.该方法不便于运输,需要低温冰箱、液氮与杜瓦瓶等容器,操作复杂,使用前需要复温与繁琐的保护剂洗涤,难以满足大规模急救和战时的需要.这些保存方法均未解决目前红细胞保存期限或运输困难等问题,迫切需要寻找一种不受细菌与病毒污染、方便运输的长期保存方法.由于冻干制品在常温下性能稳定、便于运输,冻干保存技术已广泛地应用于生物制品、药品及食品等材料的长期保存[2].作为一种理想的保存方法,红细胞的冻干保存备受人们的关注,但该技术目前仍处于实验阶段.目前的文献大多数是从低温保存的角度研究红细胞冷冻干燥保存,这些研究使用一些常见的低温保护剂,如羟乙基淀粉、海藻糖、蔗糖及葡萄糖等进行初步实验[3～6],同时也观察了冷却速率及玻璃化的作用、干燥条件及残余含水量等对细胞膜的稳定性、蛋白质的活性的影响[7～9].但是,这些实验可重复性差,红细胞回收率均低于50%.红细胞膜是由磷脂双层、镶嵌蛋白及支撑于膜内侧的膜骨架蛋白构成,常用的冻干保护剂,如海藻糖、蔗糖不容易进入细胞膜内对细胞内物质提供保护,这是红细胞冻干保存目前无法成功的主要原因之一.甘油属于渗透型保护剂,已临床应用于红细胞的冰冻保存,而以甘油作红细胞冻干保存的保护剂尚未见成功的报道.对新鲜人体红细胞,本文初步研究了不同浓度甘油条件下红细胞回收率、血红蛋白回收率、红细胞渗透脆性以及超氧化物歧化酶(SOD)活力的变化规律,为红细胞的冻干保存研究提供必需的实验基础.1 实验方法1.1 实验装置冻干保存过程分为预冻结和真空冷冻干燥过程(升华干燥和解吸干燥).预冻结过程在液氮杜瓦瓶中进行;真空冷冻干燥过程则在经改造的冻干机(Freezone2.5型,美国Labconc公司)中进行.如图1所示.该机由真空泵、干燥箱、制冷机和冷阱4大部分组成,采用复叠式制冷循环系统,冷阱温度达到-84℃,抽真空后,冻干样品可以直接在冷阱中进行干燥脱水过程,满足红细胞在一定低温下升华干燥的要求.图1 冻干机装置图Fig.1 Schematic of freeze dryer1.膨胀容器2.低温压缩机3.高温压缩机4.冷凝器5.冷凝蒸发器6.节流阀7.回热器8.真空泵9.冷阱 10.干燥箱1.2 实验材料全血取自健康志愿者静脉血(上海市血液中心提供).于4℃、1500r/min离心10min,弃上清液和白膜层;用4℃的0.9%NaCl溶液洗涤3次,收集红细胞置于4℃冰箱保存备用.使用前用等渗PBS 缓冲液(p H7.2)配制红细胞悬液(压积比40%～50%),计数,遵守无菌操作规则.1.3 主要试剂主要试剂包括聚乙烯毗咯烷酮、海藻糖、胎牛血清、柠檬酸钠(中国医药集团上海化学试剂公司)、复方甘油溶液(包含甘油57.1%、Na2HPO40.2%和KCl0.03%,上海市血液中心提供)和磷酸盐缓冲液(PBS,包含NaCl154mmol/L、KH2PO41.06mmol/ L、Na2HPO445.6mmol/L,p H7.2),实验用水采用二次蒸馏水.1.4 甘油前处理甘油前处理分为添加甘油和去除甘油两个步骤.根据甘油的质量分数w将实验分为3组. a. 0%甘油组(对照组);b.20%甘油组;c.40%甘油组.取红细胞2mL(压积比45%),缓慢滴入复方甘油液(3mL/min),滴至1/2甘油时平衡5min;甘油添加完毕后,于28℃、5%CO2培养箱(Heraeus BB K622型,美国)中平衡30min,离心去除上清液,计数.414 上海理工大学学报2006年第28卷 1.5 预冻结以超滤(使用0.22μm滤膜)过的PBS缓冲液(p H7.2)配制保护液,取前处理后的红细胞与保护液按体积比3∶7混合,保护剂终质量分数为:30%聚乙烯毗咯烷酮、20%海藻糖、15%胎牛血清和10%柠檬酸三钠),充分均匀.各取1mL样品加入安瓿瓶(2.5mL)中,计数(作为冻干前细胞数),检测血红蛋白浓度及相关指标;4℃下平衡20min后,快速置入升降式程序降温仪(本所自制)的样品盘中,以-5℃/min的速率降温至-70℃,在此温度下保持1.5h后快速置入冻干机中.每组实验重复5次.1.6 冻干实验升华干燥依次控制搁板温度-60℃和-35℃,各持续12h;解吸干燥控制搁板温度+20℃,持续10h,真空度低于10Pa.冻干过程结束后,剩余含水量低于3%.将样品放入真空密封袋,并置入干燥皿中保存.1.7 复水红细胞冻干保存后直接用等渗溶液复水,对红细胞有很大的损伤,溶血率高达85%[4],可以采用分步复水使红细胞渗透压逐步恢复至等渗.采用6%NaCl、3%NaCl和0.8%NaCl加2%葡萄糖溶液分步复水后,制备成与冻干保存前同体积的红细胞悬液,计数(作为复水细胞数),检测复水后血红蛋白浓度及相关指标.1.8 检测指标与方法1.8.1 红细胞回收率红细胞冻干保存前后,用自动血细胞分析仪(Beckman Coulter Ac T5diff,美国)计数[5],红细胞回收率a(%)为a=bc×100%(1)式中 b———复水细胞数 c———冻干前细胞数1.8.2 血红蛋白回收率用自动血细胞分析仪检测冻干保存前后血红蛋白浓度,血红蛋白回收率d(%)为d=ef×100%(2)式中 e———复水后细胞血红蛋白浓度 f———冻干前细胞血红蛋白浓度1.8.3 红细胞渗透脆性试验[10]配制不同渗透压的低渗NaCl溶液,在6个盛有4.5mL NaCl溶液试管中分别加入20μL红细胞,静置30min后,2000r/min离心20min,使用分光光度计(UV9100型,日本岛津)在540nm测上清液的光吸收度.以对照样加入0.9%NaCl管的上清液为空白对照(光吸收度为A0),以对照样加入蒸馏水管的上清液为全溶血对照(光吸收度为A100),根据各管上清液的光吸收度A,按式(3)计算红细胞的溶血率H(%),并由此作出冻干前后红细胞溶血率氯化钠质量浓度关系的曲线.H=A-A0A100-A0×100%(3)1.8.4 超氧化物歧化酶(SOD)活力检测用黄嘌呤氧化酶法检测红细胞超氧化物岐化酶(SOD)的活力,按试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)的说明书方法操作,酶活力单位用U/g Hb (Hemoglobin,Hb)表示.1.9 统计分析统计学分析实验数据以平均值±标准偏差表示,以Windows Excel2003软件采用t检验比较各组差异.图2 复水后红细胞形态(×400)Fig.2 Micrograph of freeze dried RBCs after rehydration 2 结 果2.1 光学显微镜检查冻干保存过程红细胞一般受到冰晶损伤、溶质损伤和干燥脱水损伤,同时在复水过程中,干燥红细胞也容易受到复水液渗透压的冲击,使细胞膜结构受到损伤.将干燥红细胞依次在不同渗透压的溶液中平衡后,逐渐恢复到等渗状态,可以减小渗透压变化对细胞膜的损伤.从图2可以看出,干燥红细胞复水后经光学显微镜观察,发现红细胞的体积变化不大,结构保持完整,表面均呈凹状,与新鲜红细胞的514 第5期何 晖,等:甘油保护剂对冷冻干燥保存红细胞作用的实验研究 外观特征一致.2.2 不同浓度甘油红细胞回收率的变化不同浓度甘油对红细胞回收率的影响,如图3所示.对照组的红细胞回收率低于35%,与20%甘油组无明显差别(统计误差P>0.05),而40%甘油组的红细胞回收率达到55.3%,明显高于前两组(P<0.01).图3 甘油前处理质量分数与红细胞回收率的关系(0%表示对照组)Fig.3 E ffect of concentrations of glycerol on the viabilityof freeze dried RBCs after rehydration2.3 不同浓度甘油血红蛋白回收率的变化不同浓度甘油对血红蛋白回收率的影响,如图4所示.对照组与20%甘油组无明显差别,而40%甘油组的血红蛋白回收率明显高于20%甘油组(P<0.01),达到63.4%.图4 甘油前处理质量分数与血红蛋白回收率的关系(0%表示对照组)Fig.4 E ffect of concentrations of glycerol on the recoveryof hemoglobin in freeze dried RBCs afterrehydration2.4 不同浓度甘油红细胞渗透脆性的变化复水前后红细胞溶血率氯化钠质量浓度的变化曲线如图5所示.曲线右移,说明某一氯化钠质量浓度ρ下红细胞(RBC)的溶血率上升,RBC的抗渗透破碎能力下降,渗透脆性增加.由图可见,新鲜红细胞与40%甘油组的曲线基本重合,说明40%甘油组的红细胞渗透脆性与新鲜红细胞相比变化不大;对照组与20%甘油组的曲线明显右移,各氯化钠浓度下的溶血率与新鲜红细胞比较有明显差别(P<0.05),说明红细胞渗透脆性增大.图5 甘油前处理浓度对红细胞渗透脆性的影响Fig.5 The osmotic fragility curve of freeze driedRBCs after rehydration2.5 不同浓度甘油超氧化物歧化酶(SOD)活力的变化 不同浓度甘油对超氧化物歧化酶(SOD)活力γ影响,如图6所示.对照组与20%甘油组无明显差别;40%甘油组超氧化物歧化酶(SOD)活力与新鲜红细胞相比无明显差别(P>0.05),明显高于20%甘油组与对照组(P<0.01).图6 甘油对超氧化物歧化酶(SOD)活力的影响(0%表示对照组)Fig.6 E ffect of concentrations of glycerol on activityof SOD in freeze dried RBCs after rehydration3 讨 论自20世纪90年代初,人们开展具有重要现实意义的红细胞冻干保存研究.1999年,Rindler等[7] 614 上海理工大学学报2006年第28卷 报道使用200℃/min以上的冷却速率对红细胞冷冻后于-80℃下真空冷冻干燥,复水后红细胞回收率不超过30%.目的使红细胞溶液形成玻璃态,降低冰晶形成和溶质浓缩对红细胞的损伤,但无法避免快速冷却过程中胞内冰形成对红细胞的损伤.此后的研究认为,红细胞的冻干保存与其低温保存一样,需要在细胞内添加合适的保护剂[11].2001年, Willem等[12]报道用人工方法将海藻糖载入血小板中,冻干保存后血小板的回收率达到85%.2004年,Gyana等[13]研究海藻糖载入红细胞的方法与载入效果,认为海藻糖是适合红细胞冻干保存的胞内保护剂.但由于海藻糖分子量大,不容易透过细胞膜,因此,其应用受到限制.甘油系细胞内冷冻保护剂,分子量小,易于透过细胞膜进入红细胞内.甘油作为冷冻保护剂已广泛应用于红细胞的低温保存,使用40%甘油对红细胞进行冰冻保存取得较好效果[14],本文对甘油作红细胞冻干保存的保护剂进行尝试有一定意义.研究初期尝试直接使用高质量分数(40%)甘油作保护剂,结果解吸干燥阶段出现起泡、融解等不正常现象,复水后大量溶血.此后在预冻结前用甘油对红细胞前处理,以期增加细胞内甘油浓度并降低胞外甘油浓度,有利于冻干过程的正常进行.本文对冻干保存红细胞不仅检测红细胞回收率指标,而且检测了血红蛋白回收率、红细胞渗透脆性与超氧化物歧化酶(SOD)活力3项指标,以期更全面地探讨甘油对冻干保存红细胞功能变化的影响.结果发现,经40%甘油前处理后,红细胞回收率明显提高,达到55.3%,高于目前文献报道的红细胞回收率[7,8],血红蛋白回收率达到63.4%,渗透脆性、超氧化物歧化酶(SOD)活力与新鲜红细胞之间无明显差别.其中,渗透脆性是反映红细胞骨架系统稳定性的重要参数,这一结果表明甘油在冻干过程中对红细胞膜有明显的保护作用.甘油对红细胞的冷冻和干燥保护机制可能为:甘油本身具有较强的亲水特性及氢键形成能力,在细胞内部,甘油可以羟基与水分子结合,减少游离水而抑制冰晶分子的形成,从而减少冰晶分子对细胞的机械性损伤和渗透压改变对细胞的化学损伤[1];同时增加了胞内溶液浓度,在干燥脱水过程中易形成玻璃态的程度;其次利用它们的羟基与水分子结合,在细胞膜外形成一个稳定的水分子层,使细胞膜内的水分在冷冻过程迅速进入过冷状态而不结冰,干燥过程又不易向外转移,保护了细胞的结构.但今后仍需进一步研究其对红细胞的干燥脱水保护机制以及复水过程中红细胞的损伤防护机制,逐步建立一套有效和操作简便的红细胞冻干保存方法,为进一步的红细胞冻干保存研究提供依据.参考文献:[1] 华泽钊,任禾盛.低温生物医学技术[M].北京:科学出版社,1994.[2] 华泽钊.冷冻干燥新技术[M].北京:科学出版社,2005.[3] G OODRICH R P.Lyophilization of red blood cells[P].United States Patent:4874690,1989.[4] TOMETSKO N M.Method and composition forlyophilizing red blood cells[P].United States Patent,5750330,1998.[5] SPIEL ES G,HESCHEL I,RAU G.An attempt to re2cover viable human red blood cells after freeze drying[J].Cryo Letter,1996,17:43-52.[6] WEINSTEIN R,SOWEMIMO CO KER S O,G OODRICH R P.Survival of lyophilized and reconsiti2tuted human red blood cells in vivo[J].Transfus ClinBiology,1995,2(6):427-432.[7] RINDL ER V,LΒN EBER GER S,SCHWIND KE P.Freeze drying of red blood cells at ultra low tempera2tures[J].Cryobiology,1999,38(1):2-15.[8] RINDL ER V,HESCHEL I.Freeze drying of redblood cells:how useful are freeze/thaw experiments foroptimization of the cooling rate?[J].Cryobiology,1999,39(3):228-235.[9] DUNCAN Q M,CRAIG P,RO Y ALL G,et al.Therelevance of the amorphous state to pharmaceuticaldosage forms:glassy drugs and freeze dried systems[J].International Journal of Pharmaceutics,1999,179(2):179-207.[10] 柏乃庆.血液保存[M].上海:上海科技出版社,1984.[11] CHEN T,ACKER J P,ERO G LU A,et al.Beneficialeffect of intracellular trehalose on the membrane integri2ty of dried mammalian cells[J].Cryobiology,2001,43(2):168-181.[12] WOL KERS W F,WAL KER N J,TABL IN F,et al.Human platelets loaded with trehalose survive freezedrying[J].Cryobiology,2001,42(2):79-87. [13] SA TPA THY G R,ZSOL T T,RACHNA B,et al.Load2ing red blood cells with trehalose:a step towards biostabi2lization[J].Cry obiology,2004,49(2):123-136. [14] MER YMAN H T.Cryoprotective Agents[J].Cryobiol2ogy,1971,8(2):173-183.714 第5期何 晖,等:甘油保护剂对冷冻干燥保存红细胞作用的实验研究 。
冰冻解冻红细胞的制备、保存及临床应用
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实验研究 ・ ５ ７
冰 冻解 冻红细胞 的制备 、保存 及ｌ 临床应用
郝 晶茹
（ 吉林市红十字 中心血站 ，吉林 吉林 １ ３ ２ ０ ０ ０ ）
【 摘 要 】 目的 通 过 探 讨 ｌ ０ 份一 ６ ５ 。 Ｃ以 下保 存 冰 冻 红细 胞 制 备 解 冻 红 细 胞 的 方 法 ，并 对 其 影 响 质 量 的相 关 因素 进 行将 红细胞悬液 或全血离 心去上清 ，将浓缩 少 白细 胞 红细胞移 至８ ０ ０ ｍ Ｌ 转 移袋 中，使用Ａ Ｃ Ｐ ２ １ ５ 血 液处理机 ，设定 甘油 化 程序 ，使 滴 速先 慢后 快 ，加 入复 方甘 油溶 液 ，边 加边 振荡 ，１ 单 位 红细胞加 甘油 １ ６ ０ ｍ Ｌ（ ２ 单 位红细胞 加甘油３ ２ ０ ｍＬ ）。在室温静 止 ３ ０ ｍ ｉ ｎ ，使甘 油充分与 红细胞混 合 ，轻离心 去除多余 的甘油溶 液 ，排 气 并摇匀。将甘油化 的红细胞装盒 ，使袋 体保持平整 ，打印冰冻红细 胞标签粘贴在袋体上做 好标识 ，送－ ６ ５ Ｕ以下低温 冰箱速 冻保存 。
１ ． ３流程 图
１ ． １ ． １试 剂、耗材及主要设备 ①试剂及 耗材 ：红细胞悬 液或全血 ｌ 袋、 复方甘油溶液 （ 北京博 德桑 特输 采血器 材科 技开 发 中心 ）、９ ％氯化 钠溶液 （ 四川南格 尔生 物 医学公 司 ）、８ ０ ０ 毫升 转移 袋 （ 四川南格 尔生物 医学 公司 ）、加甘 油管路 （ 美 国血 液技术公 司）、去甘油 管路 （ 美 国血液技术 公司 ）、 ０ ． ９ ％生理盐 水 （ 山东威高集 团 ）。②主要 设备 ：Ａ Ｃ Ｐ ２ １ ５ 全 自动血 液
冰冻解冻去甘油红细胞的制备方法及效果评价
【 要 】 目 的 用 ＡＣＰ １ 摘 ２ ５全 自动 细胞 洗涤 仪 制 备 冰 冻 红 细 胞 和 冰 冻 解 冻 去 甘 油 红 细 胞 ， 察 冰 观
冻 解 冻去 甘 油 红 细 胞 的 质 控 指 标 ， 价 制 备 方 法 和 制 备 效 果 。 方 法 随 机 取 ２ ６ 保 存 第 ６天 的 红 细 评 — ℃
ｃ ｌ ｗａ ８ ． ６ ． ７ ，ｔ ｅｃ ｎ ｅ ｔａｉｎｏ ｒｅｈ ｍｏ ｌｂｎ ｗａ Ｏ ４ 士０ １ ）ｇ Ｌ，ｔ ｅｒｔ ｆｖｔｏ ｅｌ ｓ（ ４ ０ 士２ ０ ） ｈ ｏ ｃｎ ｒ ｔ ｆ ｅ ｅ ｇｏ ｉ ｓ（ ． ９ ． １ ／ ｏ ｆ ｈ ａｉ ｏ ｉｒ ｏ ｈ ｍｏｙ ｉ ｅｔｗａ １ ． ９士２ ６ ） ，ｔ ｅｃ ｎ ｅ ｔａｉｎｏ ｅ ａ ｔｇｙ ｅ ｏ ｓ ３ ５ 士 １ ２ ）ｇ Ｌ，ｔ ｅ ｅ ｌｓｓｔｓ ｓ（ １ ５ ． ９ ｈ ｏ ｃｎ ｒ ｔ ｆ ｍｎ ｎ ｌｃｒ ｌｗａ （ ． １ ． ７ ／ ｏ ｒ ｈ
ｐｅ ａ ｉｇ ｆｏ ｅ ａ ｄＤｅ ｌｃ ｒ ｌ ｅ ｅ ｌｏ ｅ１ ｒ ｐ ｒｎ ｒｚ ｎＴｈ ｗｅ ｇｙ ｅｏ ｉ ｄ ｒｄ ｂｏ ｄｃ ｌ ｚ ．Ｒｅｕｔ Ｔｈ ｖ ｒｇ ｅ ｏ ｅｙ ｒｔｏｏ ｅ ｌｏ ｓｌ ｓ ｅａ ｅａ ｅｒｃ ｖ ｒ ａｉ ｆｒ ｄＢｏ ｄ
胞 悬 液 ， ＡＣＰ １ 用 ２ ５甘 油 化 红 细胞 悬液 ， ６ 一 ５℃ 以 下 深 低 温保 存 后 取 出 ， 速 放 入 ３ ℃ 水 浴 箱 中 融 化 ， 快 ８
再 用 ＡＣ ２ ５洗 涤 去 甘 油 制 备 冰 冻 解 冻 去 甘 油红 细胞 。结 果 冰 冻 解 冻 去 甘 油红 细胞 平 均 红 细 胞 回 收 Ｐ１
【 键 词 】 冰 冻 红 细 胞 甘 油 制 备 方 法 质 量 效 果 评 价 关
梯度浓度添加甘油提高冻融红细胞回收率的研究
梯度浓度添加甘油提高冻融红细胞回收率的研究林彬;杨宜承;康炜;马莉【摘要】目的针对传统冰冻红细胞技术的缺点进行改良,建立一种快速、简便、高回收率的红细胞冰冻方法并形成由低到高的浓度.方法采用从低到高的浓度顺序快速添加法,将甘油保护剂分成3份,总体积不变.比较改良方法与传统方法冷冻前及解冻后的红细胞回收率、游离血红蛋白和甘油残留量等指标.结果改良方法的红细胞回收率(87.44±3.4)％,游离血红蛋白(0.65±0.31)g/L,甘油残留量(4.20±0.75)g/L;传统方法的检测结果相应为(81.77±3.2)％,(0.58±0.23) g/L和(2.50±0.34) g/L.两种方法红细胞回收率的差异具有统计学意义(P＜0.05).结论改良方法制备的红细胞,其各项指标均符合国家标准,且红细胞回收率比传统方法更高,红细胞质量得到进一步提高,对于保障输血安全、改善输血效果具有重要意义.【期刊名称】《临床输血与检验》【年(卷),期】2018(020)004【总页数】4页(P371-374)【关键词】冰冻解冻红细胞;甘油;回收率【作者】林彬;杨宜承;康炜;马莉【作者单位】116001 辽宁省大连市血液中心;116001 辽宁省大连市血液中心;116001 辽宁省大连市血液中心;116001 辽宁省大连市血液中心【正文语种】中文【中图分类】R711.75;R446.11冰冻红细胞技术是将红细胞保存在–80℃温度下，使红细胞代谢活动降低或完全停止，是目前长期保存红细胞的一种有效方法[1]。
但是传统方法问题明显，由于每单位红细胞是直接定量加入高浓度甘油保护剂（57%甘油试剂，160 mL/单位），一方面由于渗透压变化巨大，导致甘油化过程中红细胞溶血，另一方面甘油终浓度无法达到最佳冰冻浓度（40%）[2]，从而导致红细胞回收率降低，且操作繁复，耗时较长。
手工制备冰冻解冻红细胞方法与操作要点
手工制备冰冻解冻红细胞方法与操作要点【摘要】目的提高标准化操作冰冻红细胞制备程序，保证临床供血。
方法利用不同条件制备成品冰冻红细胞，测定回收率、血细胞残留量、甘油残留量、溶血率、上清游离血红蛋白。
结果在有效条件下，制备成品冰冻解冻红细胞，其红细胞回收率、溶血率、上清游离血红蛋白及体外溶血试验均无显著性差异。
结论掌握制备冰冻解冻红细胞操作要点，可以提高冰冻解冻红细胞质量。
【关键词】冰冻红细胞；离心力；甘油；上清游离血红蛋白随着成分输血的开展，冰冻解冻去甘油红细胞是用甘油作为冷冻剂低温冰冻保存红细胞制剂的一种方法，是在紧急情况下，能够及时抢救Rh阴性的患者，近年来临床应用受到重视，它是一种低温保存红细胞很有效的方法[1]。
早在60年代，就已建立了冰冻红细胞低温保存技术，因为温度较低的状态下，红细胞代谢会逐渐降低，或者细胞代谢活动停止。
这样红细胞能量的消耗也降低，红细胞的一些代谢产物也会随之降低，使红细胞处在休眠状态。
冷冻血是其它制剂所不能替代的制剂，长达十年的保存期[2]。
使Rh阴性血的来源得到保障。
为患者抢救争取了保贵时间。
目前红细胞冷冻保护剂应用的是复方甘油溶液。
由于甘油渗透压较高，人体输入过量甘油会造成细胞溶血，给患者造成极大损害。
所以为了更好提高冰冻解冻去甘油红细胞的质量，作者在制备时采用手洗梯度洗涤法来制备，在红细胞制备、保存、解冻洗涤过程中积累一些经验，现和大家分享一下。
1 材料与方法1.1 试剂与耗材57%复方甘油溶液、9%氯化钠溶液、三珠冷冻袋、无菌四联袋（北京博德桑特输采血器材科技开发中心）、羟乙基淀粉溶液（济南三九益民制药公司）、0.9%生理盐水（吉林康乃尔公司）、振荡器（HY-4金坛市）、无菌接驳机（SC-203A泰尔）、恒温水浴箱（余姚市东方电工仪器厂）、-80℃速冻冰箱（三洋）、离心机（贺利氏6000I）。
1.2 冰冻红细胞制备方法加入甘油，将保存期6d内的全血或红细胞悬液离心，2200 r/min，25 min，去除上清后，将红细胞用无菌接驳机与三珠袋相接，并转移至三珠袋中加甘油，动作一定要轻柔，避免对红细胞造成人为损伤。
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甘油化时滴速对冰冻解冻去甘油红细胞质量影响
【摘要】目的对本站制备冰冻解冻去甘油红细胞方法进行探索，并对其质量进行分析评价。
方法随机抽取本站红细胞悬液4℃保存9 d以内20u，随机分成甲组10u，加甘油速度40滴/分和乙组10U加甘油速度120滴/min，分别进行甘油化，-80℃冰冻及用ACP215全自动血细胞处理仪解冻。
甘油化处理，进行质量检测：甲组游离血红蛋白（0.14±0.05）g/L；乙组游离血红蛋白（1.01±0.02）g/L，两组差异有统计学意义，（P＜0.01），甲乙两组其他指标符合国家标准，差异均无统计学意义。
结论本站制备冰冻解冻去甘油红细胞的方法高效高质，值得推广。
【关键词】冰冻红细胞；冰冻解冻去甘油红细胞；全自动血细胞处理仪
成分输血在我国已经广泛开展，其中Rh（D）阴性血的用量逐年增加，Rh （D）阴性血比例在我国汉族人群仅占（0.3～0.5%）[1]，超低温甘油化冰冻保存红细胞作为血站平时贮备，一旦临床急需可立即进行解冻洗涤，即极大方便了临床用血，又保证抢救生命时间，而甘油化制备冰冻解冻红细胞是长期保存Rh（D）阴性血最理想方法，作者按加甘油时不同滴速分成甲、乙两组，检测洗涤后质控指标，对冰冻解冻去甘油红细胞制备方法进行探索，并对其质量进行评价。
1 材料与方法
1. 1 试剂与耗材复方甘油试剂（北京博德桑特）、三珠袋（北京博德桑特）、ACP215红细胞洗涤耗材（美国血技）、9%氯化钠（北京博德桑特）、0.9%氯化钠（山东威高）、输血器（江西洪达）、贺利氏6000I离心机（德国）、三洋-80℃速冻冰箱（MDF-U32V型、日本）、调速多用振荡器（HY-4型、金坛市）、电热恒温水浴箱（HHW21-600型、天津）、无菌接驳机（SC-201型、日本）、钨酸钠（天津化学试剂四厂）、氢氧化钠（天津博迪化工）、乙二醇（天津富宇精细化工）、无水乙醇（沈阳华东试剂厂）、稀释液（希森美康医用电子有限公司）、酚酞（沈阳华东试剂厂）、高碘酸钠（天津福晨化学试剂厂）、血浆游离血红蛋白试剂盒（北京瑞尔达生物科技）、溶血剂（希森美康医用电子有限公司）。
1. 2 取样用本站检测红细胞悬液4℃保存9 d以内20 U，随机分成甲组10 U，乙组10 U。
1. 3 冰冻红细胞制备取9 d内红细胞悬液各20 U，经2200转，25 min 离心后，分出上清，转移至三珠袋，通过无菌接驳机与输血器相连接，加入57%复方甘油溶液，振荡器60次/min，（甲组滴速40滴/min，加5min后静止5min再继续加入，仍是40滴/min，至加甘油完毕；乙组滴速120滴/min，匀速加完，不需静止）排尽空气，室温平衡放置30min，纸盒装入后放在-80℃保存一个月后待用。
1. 4 冰冻解冻去甘油红细胞制备保存一个月后，冰冻红细胞从-80℃冰箱取出立即放入37～42℃恒温水浴箱中溶化，4～6 min/（袋·U），启动ACP215全自动血细胞处理仪，应用去甘油化程序洗涤，用9%氯化钠80ml、0.9%生理盐水2000 ml，解冻洗涤过程大约60 min。
1. 5 质量标准红细胞回收率≥80%，白细胞残留率≤1%，血小板残留率≤1%，甘油含量＜10g/L，血浆游离血红蛋白含量≤1g/L，体外溶血≤50%。
1. 6 统计学方法计数资料以（x±s）表示，两组采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
见表1。
2 结果
3 讨论
冰冻解冻去甘油红细胞在制备过程中，冰冻红细胞制备是质量的前提，冰冻与解冻洗涤过程操作必须严格按照操作规程进行，减少红细胞损失[2]。
甘油的加入能使红细胞膜受到很大冲击，渗透压逐步达到平衡很重要，如果在加入甘油时先40滴/分，加5 min后静止5 min再继续加入40滴/min，使红细胞膜渗透压能得到很好的平衡，甲组以可间歇再加入方式每次为40滴/min，是本站经过实践检验后确立的操作方法；乙组为设立对照组加入甘油滴速120滴/min，其余条件相同，甲组游离血红蛋白（g/L）为0.14±0.05，乙组游离血红蛋白为（1.02±0.04）g/L，两组差异具有统计学意义，（P＜0.01），实验证明，过快的加入甘油，使红细胞膜受到强烈刺激，血与甘油混合后渗透压得不到很快平衡，很容易产生溶血，使血液制备质量得不到保证，所以作者认为加甘油时滴速的保证起到关键作用。
参考文献
[1] 邱艳.全血成分血质量要求与血液标准化.北京：中国标准出版社，2002.
[2] 安万新，于卫建.输血技术学.北京：科学技术文献出版社，2010：152.。