221动物细胞培养
动物细胞培养
操作步骤 （1）单细胞悬液接种于96孔培养 板；103-104细胞/孔，每孔培养基总 量200微升（96孔培养板每孔容积 370微升），37℃、5％CO2培养箱 中培养一段时间（根据实验目的决 定培养时间） （2）加入2毫克／毫升的MTT液 （50微升／孔）；继续培养3小时。 （3）吸出孔内培养液后，加入 DMSO液（150微升／孔），将培养 板置于微孔板扳荡器上振荡10分 钟，使结晶物溶解。 （4）酶标仪检测各孔OD值（检测 波长为570 nm）。记录结果，绘制 细胞生长曲线
培养细胞生长的条件
1 细胞的营养需要 2 细胞的生存环境 温度: 37 ℃ O2 CO2: 5% CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3pH: 7.2-7.4 渗透压 3 无污染 4 无毒
实验室
பைடு நூலகம் 实验准备
实验用品：
超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，CO2培养箱
倒置显微镜 酶标仪、微孔板震荡器
液氮罐
自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管
压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广 电热干燥箱：干热消毒（160 ℃ ，2小时）。主要用于玻璃
器皿消毒
滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、
酶液等均采用滤过法除菌
超净工作台：为细胞操作提供无菌环境 紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料
培养皿和培养板等表面消毒
超净台
超净工作台的工作 原理是利用鼓风机 驱动空气遁过高效 滤器除去空气中的 尘埃颗粒，使空气 得到净化。净化空 气徐徐通过工作台 面，使工作台内构 成无菌环境。
滤 器
CO2培养
高一生物动物细胞培养的介绍
高一生物动物细胞培养的介绍高一生物动物细胞培养知识点该知识点包括动物细胞培养的过程､动物细胞培养的条件､动物细胞培养的应用等几个要点知识。
1.动物细胞培养的过程:动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和繁殖。
其基本流程是取动物组织块(动物胚胎或幼龄动物的器官或组织)剪碎用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞制成细胞悬液转入培养瓶中进行原代培养贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。
在培养过程中会出现细胞贴壁生长和接触抑制现象。
悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上,称为细胞贴壁。
细胞数目不断增多,当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时,细胞就会停止分裂增殖,这种现象称为细胞的接触抑制。
2.动物细胞培养的条件:①无菌､无毒的环境:培养液应进行无菌处理。
通常还要在培养液中添加一定量的抗生素,以防培养过程中的污染。
此外,应定期更换培养液,防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。
②营养:合成培养基成分:糖､氨基酸､促生长因子､无机盐､微量元素等。
通常需加入血清､血浆等天然成分。
③温度:适宜温度:哺乳动物多是36.5℃+0.5℃;pH:7.2~7.4。
④气体环境:95%空气+5%CO2。
O2是细胞代谢所必需的,CO2的主要作用是维持培养液的pH。
3.动物细胞培养的应用:①用于基因工程(培养它作受体细胞);②制备病毒疫苗､干扰素､生产单克隆抗体,制皮肤细胞等;③检测有毒物质的毒性､培养医学研究的各种细胞等。
【动物细胞培养考点分析】在平常测试中,该知识点有很大比例,多以选择题或简答题的形式出现。
通常考查动物细胞培养过程､条件等相关知识,出题形式灵活,难度不大。
在高考中,从近几年生物试题看,本部分知识一直是高考命题的热点之一,多以简答题形式考查,多以动物细胞培养过程图解结合其他动物细胞技术进行综合考查。
【动物细胞培养知识点误区】对动物细胞培养原理记忆不清､培养过程中胰蛋白酶的作用不清楚及培养条件模糊都是易错的原因。
动物细胞培养
动物细胞培养
动物细胞培养是一种重要的生物技术手段，广泛应用于医药、生物学研究、食
品工业等领域。
通过细胞培养，可以获取大量同质的细胞群体，为疾病治疗、新药研发提供重要的支持。
动物细胞培养的原理
动物细胞培养是将动物组织或细胞在人工培养基中进行维持、增殖、传代等过程。
培养基通常包括营养物质、生长因子、激素等成分，提供细胞生长所需的营养和环境。
动物细胞培养的步骤
1.细胞来源：从动物体内收集组织样本，获得原代细胞。
2.细胞分离：通过消化酶等手段将组织分离成单个细胞。
3.传代培养：将分离的细胞在培养基中培养，定期传代以增殖细胞数
量。
4.检测与分析：对培养的细胞进行检测、分析，确保其健康状态。
动物细胞培养的应用
1.生物医学研究：细胞培养在癌症、遗传疾病等方面的研究中发挥重
要作用。
2.药物研发：通过细胞培养可以进行药物筛选、毒性测试等工作。
3.食品工业：利用细胞培养技术可以生产细胞培养肉等食品。
动物细胞培养的发展
随着生物技术的不断发展，动物细胞培养技术也在不断创新和提升。
新的培养
基配方、生长因子的发现以及工程技术的应用，使得动物细胞培养在医学和生物学领域有着广阔的应用前景。
动物细胞培养作为一种重要的生物技术手段，将继续在各个领域发挥重要作用，为人类健康和科学研究进步做出贡献。
2-1-1动物细胞培养条件和过程
原理： 细胞增殖
操作原因：将组织块分散成单 个细胞后，细胞所需的营养容 易供应，其代谢废物容易排出。
01 动物细胞培养的条件
2.培养条件：
培养基的构成：合成培养基 + 血清等天然成分
将细胞所需的营养物 质按种类和所需量严 格配制而成的培养基
提示：可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增； 目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用 的人造皮肤。
人造皮肤：人体再生术的秘密
01 动物细胞培养的条件
1.动物细胞培养：
对象： 一般是指动物胚胎或出生不久的幼龄动物组织， 因为这些组织细胞比老龄动物的组织细胞生命力旺盛， 易于培养，同时增殖能力也更强。
培养皿
（2）传代培养：将分瓶后的细胞培养称为传代培养。
（3）细胞贴壁：大多数体外培养的细胞需要贴附于某些基质表 面才能生长增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上，这种现 象称为细胞贴壁。
（4）接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细 胞通常会停止分裂增殖，这种现象称为接触抑制。
培养瓶
【从社会中来】
在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤 进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用 他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。
那么： 怎样才能获得大量的自体健 康皮肤？ 能不能用自体皮肤的单个细 胞培养出可供移植的皮肤？
通过细胞培养构建的人造皮肤
含人类未知、细胞生长增 殖所必需的物质，满足细 胞对未知营养成分的需求。
一般使用液体培养基，也称为培养液
《动物细胞培养技术及其应用》 讲义
《动物细胞培养技术及其应用》讲义一、动物细胞培养技术的概述动物细胞培养是指在体外模拟体内环境，使从动物体内取出的细胞在适宜的条件下生长、繁殖和分化的技术。
这一技术的发展为生物学、医学等领域的研究和应用提供了重要的手段。
细胞培养需要适宜的环境条件，包括温度、pH 值、渗透压等。
通常，培养温度在 37℃左右，pH 值在 72 74 之间，渗透压与细胞内液相当。
此外，还需要提供充足的营养物质，如氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐等，以及血清等生长因子。
动物细胞培养的基本过程包括取材、原代培养、传代培养等步骤。
取材时要选择健康的组织或器官，并进行严格的无菌处理。
原代培养是将获取的细胞直接在体外培养，传代培养则是当细胞生长到一定密度后，将其转移到新的培养容器中继续培养。
二、动物细胞培养的关键技术1、无菌操作技术在细胞培养过程中，防止微生物的污染至关重要。
所有的操作都要在无菌环境下进行，包括实验器具的消毒、培养基的灭菌、操作人员的无菌操作等。
2、细胞培养容器常用的细胞培养容器有培养瓶、培养皿、多孔板等。
不同的容器适用于不同的培养需求，如培养瓶常用于大规模细胞培养，多孔板则适用于细胞筛选和药物测试等。
3、培养基的选择和配制培养基的成分和配方对细胞的生长和分化有着重要影响。
常见的培养基有天然培养基（如血清）和合成培养基（如 DMEM、RPMI-1640 等）。
在实际应用中，常常根据细胞的类型和实验目的选择合适的培养基，并添加一定的补充成分。
4、细胞的冻存与复苏为了长期保存细胞，需要将细胞进行冻存。
在冻存过程中，要添加保护剂（如 DMSO），并采用逐步降温的方法，以减少细胞损伤。
复苏时则要快速解冻，并尽快将细胞转移到适宜的培养环境中。
三、动物细胞培养技术的应用1、生物制品的生产利用动物细胞培养技术可以大规模生产疫苗、抗体、激素等生物制品。
例如，通过培养哺乳动物细胞来生产乙肝疫苗、流感疫苗等，为疾病的预防和控制提供了重要的手段。
动物细胞培养基本操作
实验一动物细胞培养细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养．使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。
细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。
因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的—种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离乐生物机体后的—些变化。
细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。
如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿痛学及病毒学等为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞与传代细胞有一个基本概念。
本实验分两次进行．即清洗与消毒和传代细胞的培养与观察。
Ⅰ清洗与灭菌一、实验目的能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。
二、实验原理清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。
体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。
细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。
清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。
如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。
灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。
假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。
以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。
三、实验材料、用品材料：无臭氧型紫外灯，微孔滤膜(直径25)：孔径为0．22μm，微孔滤膜(直径90)：孔径为0．22 μm，过滤器(直径25)。
药品：70％或75％酒精，0．1％新洁尔灭，煤酚皂溶液(来苏儿水)，0．5％过氧乙酸，乳酸，37％甲醛，高锰酸钾，NaOH，盐酸，重铬酸钾，浓硫酸(工业)，DEPC水[体积分数0．1％的焦炭酸二乙酯(diethylpyroearbonate)]。
课件2：2.2.1 动物细胞培养
二、动物细胞培养的条件
补充资料： 1、血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等， 2、氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动物
细胞本身不能合成（称为必需氨基酸），必须由培养液提供。 3、血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子；血清还含有多种未
2、干细胞分布： 早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中
3、干细胞类型：
胚胎干细胞 （ ES细胞）
成体干细胞
全能干细胞 多能干细胞 专能干细胞
Hale Waihona Puke 三、干细胞培养及其应用4、胚胎干细胞应用： 体外诱导小鼠 成纤维细胞
诱导多能干细胞 iPS
定向诱导分化
多种体细胞
临床治疗人类疾病
如：白血病、帕金森病、阿而茨海默病等
培养基特有成分
蔗糖、植物激素
培养结果
植物体
培养目的
快速繁殖、培育无病毒 植株等
动物细胞培养 细胞增殖
液体培养基 葡萄糖、动物血清 细胞株、细胞系 获得细胞及代谢产物
三、干细胞培养及其应用
1、胚胎干细胞： 存在于早期胚胎中，具有分化成为成年动物体内任何一 种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚 至个体的潜能。
动物胚胎或幼龄动 物的组织、器官
去掉组织 间蛋白
胰蛋白酶 单个细胞
剪碎
加培养液
细胞悬 浮液
分化程度低， 增殖能力强
细胞
少部分突破细胞寿限 “癌变”，无限传代
50代细胞
细 胞 贴 壁
剥离、分瓶
10代细胞
原 代 培 养
出现接触抑制
动物细胞培养不能 最终培养成动物体
《动物细胞培养HXY》课件
动物细胞培养是一个重要的技术，它可以在无菌条件下，让多种细胞在基质 中生长、增殖并分化成各种细胞类型，被广泛应用于药物筛选、细胞学研究、 基因工程和疫苗生产领域。
什么是动物细胞培养？
定义
将动物组织的细胞单元分离，通过营养液、基质及一定环境条件的供给来生长、增殖并分化 成各种细胞类型。
培养箱
提供温度、湿度、气体、点式无菌操作空间等多项控制
培养皿
常用的有T25、T75等规格，可根据培养的细胞数目选择不同的规格
培养基
细胞体外生长所需的营养物质、激素、生长因子和抗生素等，市面上有多种不同配方的基质 可选
动物细胞培养的步骤培养箱准备、培养基配置等
2
细胞分离
取得原代细胞、细胞株或原代细胞的稳定细胞株，需要通过胰酶、蛋白酶等对细胞进行分离
3
细胞培养
将细胞接种到培养皿中，放到培养箱中进行培养，根据细胞类型和实验要求，需选择不同的 培养基；
4
细胞观察和实验
观察细胞形态、活力、增殖、分化等指标，开展实验，如药物筛选、克隆、基因转染等
常见问题及处理方法
1 污染
处理方法很多，如节制制 作培养基的污染、通过使 用无菌器具和无菌条件等 预防性方法、使用抗生素 等
原理
细胞的培养和生长需要营养物质、生长因子和一定的温度、湿度以及氧气浓度等物理条件， 其中培养基是一个关键环节。
为什么要进行动物细胞培养？
应用领域
药物研发、疫苗生产、细胞治疗、基因工程、细胞 学研究等
优势
体外培养条件可以模拟体内环境，对细胞及分子生 物学研究提供了突破性的手段
动物细胞培养的设备和培养基
广泛应用于药理学的研究和药物 筛选中，特别是高通量药物筛选
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二、动物体细胞核移植技术和克隆动物
(一)动物细胞核移植概念
将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉 细胞核的 卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的 胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物 个体。
用核移植的方法得到的动物 称为克隆动物。
分 胚胎细胞核移植：细胞分化程度低，恢复全能性容易 类 体细胞核移植：细胞分化程度高，恢复全能性不容易
接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触 时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞 的接触抑制。
部分细胞突变，获 得不死性，向癌细 胞方向发展，糖蛋 白减少。50代以后 Nhomakorabea接触抑制
失去接触抑制
（三）动物细胞培养条件
1、无菌、无毒的环境 对培养液和培养用具进行无菌处理；
在培养液中添加一定量的抗生素;
2、叙述动物细胞培养的过程。
动物细胞培养过程 1、原代培养：动物组织消化后的初次培养。
2、传代培养：贴满瓶壁的细胞需要重新用胰蛋白酶等处理， 然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖，这样的培养过程通常 称为传代培养。
动物的组织
胰蛋白酶
单个 加培养液 细胞
细胞
悬液
部分细胞无限传代
传代 培养
原代 培养
1. 动物细胞培养对培养的材料有要求吗？ 通常取动物胚胎或幼龄动物的组织、器官
比较项目 原理
培养基性质 取材 过程
植物组织培养
细胞的全能性
动物细胞培养
细胞增殖
固体培养基
液体培养基
植物的器官 和组织
脱分化、再分化
幼龄器官和 组织
原代培养、 传代培养
比较项目
植物组织培养
动物细胞培养
细胞分裂和分 化特点
培养基特有成分
分裂：愈伤组织
分化：形成根、 芽
蔗糖、植物 激素
只分裂不分化 贴壁生长
(二)体细胞核移植的过程
供体细胞培养
减数第二次分裂中期
（ MⅡ卵母细胞）
将供体细胞注入去核卵母细胞
核移植 胚胎移植
对比多莉羊和课本高产奶牛的克隆过程，找出操 作过程的不同点？
核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？用 此细胞作为受体细胞有什么好处？
MⅡ中期卵母细胞
卵母细胞体积大，便于操作；含有营养物质丰富， 提供早期胚胎发育所需的营养；含有激活细胞核 体现全能性的物质。
6.胰蛋白酶的作用是什么呢？细胞间隙主要含有 什么物质成份？
胰蛋白酶将动物组织细胞间隙中的蛋白质分 解，使细胞分散开。 7.为何要定期用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离下 来？
当贴壁细胞生长到表面相互接触时，细胞就会 停止分裂增殖—细胞出现接触抑制。
8.细胞贴壁生长对培养容器有何要求？
培养瓶的内表面要光滑、无毒、易于贴附。
定期更换培养液；
2、营养
葡萄糖、氨基酸、无机盐、促生长因子、微量元素等
动物血清、血浆
3、温度和pH
能否用胃蛋白酶
温度36.5±0.5度，pH7.2～7.4 代替胰蛋白酶？
4、气体环境
O2和CO2（95%空气和5% CO2 ） O2是细胞代谢所必需的。 CO2维持培养液的pH。
植物细胞和动物细胞培养的比较
植物组织培养
在无菌和人工控制的条件下,将离体的植物 器官、组织、细胞，培养在人工控制的培养 基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈 伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。
（二）动物细胞培养的过程 结合图2-16，阅读P44最后一段至P46第一段结束。
1、找出关键词并理解它们的含义。 细胞悬液 细胞贴壁 细胞的接触抑制 原代培养 传代培养
结合图2-21，阅读P47-50
1.卵母细胞从哪来？ 2.如何去除细胞核？ 3.对供体牛有何要求？ 4.克隆动物的过程中实际有哪些技术支持？ 5.克隆牛的性别和主要性状与哪头牛相同？
回忆克隆羊“多莉”的培育过程
Ａ母绵羊 卵细胞
Ｂ母绵羊 乳腺细胞
核移植
融合后的卵细胞
卵裂
早期胚胎
胚胎移植
C母绵羊子宫 妊娠 分娩 多莉羊
会消化细胞膜蛋白，因此必须控制好胰蛋白酶的处理时间。
5.人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？
保存10代以内的细胞。 因为10－50代部分细胞的细胞核型可能发生变化，
有少部分还发生突变向癌细胞方向发展。
动物细胞生长特性：
细胞贴壁—— 悬液中分散的细胞很快就贴附在 瓶壁上，称为细胞贴壁。
要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、 易于贴附。
因为其分化程度低、增殖能力强，更容易培养。 2. 为什么在培养前要将组织分散成单个细胞？ 成块的组织不利于培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养。 3. 用胰蛋白酶处理，组织就会分散成单个细胞，说明了什么？
说明细胞与细胞间的主要物质是蛋白质 4.胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？
胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的作用也
接触抑制 葡萄糖、动 物血清
培养结果
植物体
细胞群体
（四）动物细胞培养技术的应用
阅读P46-47
1、生产生物制品
病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等；
2、作为基因工程中的受体细胞，动物基因工程 离不开动物细胞的培养；
3、用于检测有毒物质及，判断某种物质的毒性
4、培养正常或各种病变的细胞，用于生理、 病理、药理等方面的研究。
2.2 动物细胞工程
提问：
? 植物细胞工程常用的技术手段有哪些？
植物组织培养技术、 植物体细胞杂交技术
动物细胞培养技术、 动物细胞核移植技术、 动物细胞融合技术、 生产单克隆抗体技术
动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。
（一）概念 ? 从动物机体中取出相关的组织,将它分散
成单个细胞，然后, 放在适宜的培养基中, 让这 些细胞生长和增殖。
9.什么是原代培养与传代培养？ 将动物组织消化后的初次培养就是原代培养。
当原代培养的细胞贴满瓶壁后，用胰蛋白酶处理， 制成细胞悬浮液后再次分瓶继续培养就是传代培 养。 10.动物细胞培养液的主要成分是什么？
通常含有葡萄糖、氨基酸、促生长因 子、无机盐、微量元素、动物血清等。
离体的植物组织或细胞在适宜的条 件下可发育成完整的植株，那么我们 是否可以利用类似的方法，使动物细 胞发育成一个完整的个体呢？
1.动物细胞工程的基础是什么？
动物细胞培养技术
2.动物细胞培养的基本原理是什么？
离体的细胞在适宜的条件下可以增殖
3.进行动物细胞培养的材料一般有何特点？
一般取胚胎组织或幼龄动物的组织 .
4.为什么要将组织分散成了单个细胞再进行培养？
5.怎样将动物组织分散成单个的细胞？ 用剪刀剪碎组织，再用胰蛋白酶处理。