PCR产物的胶回收分离纯化
1.4 胶回收PCR产物(纯化)
一、目的基因的扩增
（四）、PCR产物的提纯
实验目的：
回收得到纯的目的DNA，去除影响DNA连接酶活性的物质及其它DNA片段。
纯化产物用于酶切和连接反应。
主要实验仪器：
冰箱，为试剂、样品或菌种提供冷冻、冷藏的保存环境制冰机，用于制备碎冰块
微量移液器，用于吸取微量试剂及样品
超净工作台，提供无菌工作台面
常温离心机，用于样品的常温离心分离
核酸电泳仪，用于核酸的电泳分离分析
主要实验室剂：
酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇、70％乙醇、TE。
实验步骤：
将PCR反应液转入1.5ml离心管中，加入50ulTE和100ul 酚/氯仿/异戊醇，盖好离心管盖子，上下颠倒混匀。
将管置于离心机中，12000rpm离心5min。
取上清，加入1/10体积3mol醋酸钠和2.5倍体积预冷的无水乙醇，上下颠倒混匀，室温放置20min沉淀DNA。
将管置于离心机中，12000rpm离心10min。
离心后现象：（图片）。
弃上清，加入1ml70％乙醇，12000rpm离心5min。
离心后现象：（图片）。
弃上清。
将管口打开，倒置于纸巾上数秒，使液体尽可能流尽，再平放于纸巾上室温干燥10min。
加30ulTE溶解沉淀，取5ul样品跑电泳。
电泳图谱为：（图片）。
确认回收到PCR产物后，剩余样品置于-20℃冰箱中备用，用于酶切。
END。
PCR产物的纯化
注：把水加热至60℃，使用时有利于提高 把水加热至60℃ 洗脱液效率。 洗脱液效率。
13、 12.000 rpm离心1分钟，洗脱DNA。 13、 rpm离心1分钟，洗脱DNA。
实验操作流程图
切胶示意图
凝纯化结果示意图
【思考题】 思考题】 1、如何有效提高凝胶纯化PCR产物的效率？ 、如何有效提高凝胶纯化PCR产物的效率？
5、均匀混和后，75℃加热融化胶块。间断振荡混 、均匀混和后，75℃ 和，使胶块充分融化（约6 10分钟）。 和，使胶块充分融化（约6～10分钟）。
注：胶块一定要充分融化，否则将会严重影响 胶块一定要充分融化， DNA的回收率 DNA的回收率。
6、向上述胶块融化液中加入DR－II Buffer（体积 、向上述胶块融化液中加入DR－ Buffer（体积 DR－ Buffer的1/2），均匀混和。 为DR－I Buffer的1/2），均匀混和。 7、将试剂盒中的Spin Column按置于Collection 、将试剂盒中的Spin Column按置于Collection Tube上。 Tube上。 8、将上述操作6.的溶液转移至Spin Column中， 、将上述操作6.的溶液转移至Spin Column中， 3600 rpm离心1分钟，弃滤液。 rpm离心1 注：如将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以 提高DNA的回收率。
【实验步骤】 1、使用1×TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶， 、使用1 TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶， 然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。 然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。 2、在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂 、在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂 糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。
此时应注意尽量切除不含目的DNA部分 此时应注意尽量切除不含目的DNA部分 的凝胶，尽量减少凝胶体积，提高DNA 的凝胶，尽量减少凝胶体积，提高DNA 回收率。 回收率。 注：切胶时请注意不要将DNA长时间暴 切胶时请注意不要将DNA长时间暴 露于紫外灯下，以防止DNA损伤。 露于紫外灯下，以防止DNA损伤
PCR-RFLP实验设计经典方案(1)
【思考题】 1、如何有效提高凝胶纯化PCR产物的效率？
实验六 PCR产物的胶回收分离纯化
满朝来
哈尔滨师范大学生命科学与技术学院 生化与分子生物学教研室
一、实验目的
1、了解分离纯化DNA片段中的污染物方法和原理。
2、掌握PCБайду номын сангаас产物纯化的实验技术，为后续的连接 反应和转化反应打下良好的基础。
二、实验原理
首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段， 分离目的条带DNA，然后紫外光下切割含目 的DNA条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收 纯化DNA片段。试剂盒的胶回收柱采用特殊 硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效、 专一地吸附DNA、RNA的原理，配备设计独 特的离心吸附柱式结构，使用常规台式高速 离心机，在几分钟之内即可以高效回收核酸 片段。
【仪器与试剂】 一、实验仪器 1、琼脂糖凝胶电泳系统 2、紫外观察分析仪 3、离心机 4、单面刀片 5、恒温水浴锅
二、试剂
1、 DNA回收试剂盒 2、50×TAE 3、ddH2O
三、实验步骤
1）在紫外灯下切分含DNA的琼脂糖块，尽可能除去多余的琼脂糖．放入1.5ml 离心管中。 2） 按每100mg琼脂糖加入300—600μl 溶胶液的比例加入溶胶液（本实验加 500ul），置55℃水浴10分钟，使琼脂糖块完全溶化，期间每2分钟颠例混匀一 次促溶。 3）将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，12000rpm 室温离心1分钟，倒掉收集管 中的液体．再将吸附柱放入同一个收集管中。 4）在吸附杜中加入500uI漂洗液，室温静置1分钟后， 12000rpm 室温离心30 秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 5）再在吸附柱中加入500uI漂洗液， 12000rpm 室温离心15秒，倒掉收集管中 的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 6） 12000rpm 室温空离心1分钟。 7）将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30ul洗脱缓 冲液，室温静置2分钟后， 12000rpm 室温离心1分钟（为提高回收效率可再洗 脱一次），将1.5ml离心管(DNA)贮存于-20℃。 8）琼脂糖凝胶电泳检测回收产物。
实验三_琼脂糖凝胶电泳及PCR产物的回收纯化
PCR产物的克隆(DNA的胶回收和连接)技术方案及实验原理
PCR产物的克隆(DNA的胶回收和连接)技术方案及实验原理【实验原理】1.DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。
切下带有所需DNA 片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。
2.利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。
商品化的T载体有很多。
本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。
这个载体以pUC19载体为基础，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoRⅤ酶切后在两侧的3＇端添上“T”制备而成（见附录1）。
由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。
【试剂与器材】（一）试剂1.pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara公司）。
2.TAE电泳缓冲液3.琼脂糖（Agarose）4.6×电泳加样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。
2 / 95.溴化乙锭(EB)溶液母液：配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。
6.70%乙醇7.胶回收试剂盒（Omega公司）（二）器材水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 凝胶成像系统或其它照相设备。
【操作方法】（一）胶回收试剂盒回收PCR产物（以Omega公司Gel Extraction Kit为例）1.当目的片段DNA完全分离时，转移凝胶至紫外灯上尽可能快地切下目的片段。
2.凝胶块转移至1.5ml离心管(离心管已经称重了)中，称重得出凝胶块的重量。
PCR产物的TA克隆(DNA的胶回收和连接) PCR实验技术
PCR产物的TA克隆(DNA的胶回收和连接)
【实验原理】
1.DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。
切下带有所需DNA片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。
2.利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。
商品化的T载体有很多。
本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。
这个载体以pUC19载体为基础，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoRⅤ酶切后在两侧的3＇端添上“T”制备而成（见附录1）。
由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。
【试剂与器材】
（一）试剂
1.pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara公司）。
2.TAE电泳缓冲液
3.琼脂糖（Agarose）
4.6×电泳加样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。
1 / 9。
PCR产物胶回收实验
实验六 PCR产物胶回收实验（一）一、实验目的1. 掌握胶回收的常规操作2. 了解胶回收PCR产物的目的二、实验原理利用胶回收试剂盒纯化PCR产物。
本试剂盒提供一个从TBE或TAE电泳缓冲液配制的琼脂糖凝胶中提取高质量DNA的简单、快速、有效的技术，适合从浓度≤3%，高，低熔点琼脂糖凝胶中，回收长度为60bp~23Kb的DNA片段，小于100bpDNA片段回收率为10%~55%，0.1~10kbDNA片段回收率最大为99%，大于10kbDNA片段回收率为20~70%。
回收的基因组DNA可以应用到克隆，测序，限制性酶切等各类下游分子生物学实验。
三、试剂及配套设备和材料3.1 试剂Extraction buffer Wash buffer Elution buffer3.2 配套设备和材料无菌1.5ml离心管各种规格移液器和无菌移液器吸头无水乙醇异丙醇可能需要3M KAc (pH 5.0) 离心机四、基本技术参数1. 用干净、锋利的手术刀，将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下，并放入1.5或2.0 ml离心管中。
请尽量切去不包含DNA片段的凝胶。
一般情况下，电泳的DNA上样量≥50 ul（50ul为最终洗脱体积）。
2. 按1：3的比例（凝胶质量毫克数：融胶液体积微升数）加入Extraction buffer。
例如：100mg凝胶应加入300ul Extraction Buffer。
对于每人份试剂用量，凝胶质量不能超过400mg。
3. 于恒温水浴或金属浴中50℃温育，直到凝胶融化。
一般温育时间为10分钟，温育过程中没隔23分钟混匀一次。
如果温育后，混合液体颜色变紫，请加入10 ul 3M KAc （pH 5.0），使混合液颜色变回黄色。
4. 可选：按1：1的比例（凝胶质量毫克数：异丙醇体积微升数）加入异丙醇，并混合均匀。
如DNA片段大于500bp/小于4kb，不需要加异丙醇。
5. 将混合液全部转移到Spin column内，于6,000g离心1分钟，并弃去接液管内液体。
pcr扩增后产物流程和注意事项
pcr扩增后产物流程和注意事项下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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PCR产物的胶回收分离纯化
一、实验仪器
1、琼脂糖凝胶电泳系统
2、紫外观察分析仪
3、离心机
4、单面刀片
5、恒温水浴锅
二、试剂
1、DNA回收试剂盒
2、50×TAE
3、ddH2O
三、步骤
1 在紫外灯下切分含DNA的琼脂糖块，尽可能除去多余的琼脂糖．放入1.5ml离心管中。
4. 称量胶块重量，计算胶块体积。
计算胶块体积时，以1 mg=1 μl 进行计算。
5. 向胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer，DR-I Buffer 的加量如下表：
凝胶浓度DR-I Buffer 使用量
1.0％ 3 个凝胶体积量
1.0％～1.5％ 4 个凝胶体积量
1.5％～
2.0％ 5 个凝胶体积量
6. 均匀混合后75℃加热融化胶块（低熔点琼脂糖凝胶只需在45℃加热）。
此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约6～10 分钟）。
注）胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA 的回收率。
7. 向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量的1/2体积量的DR-II Buffer，均匀混合。
当分离小于400 bp 的DNA 片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20% 的异丙醇。
8. 将试剂盒中的Spin Column 安置于Collection Tube 上。
9. 将上述操作7 的溶液转移至Spin Column 中，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃滤液。
注）如将滤液再加入Spin Column 中离心一次，可以提高DNA 的回收率。
10. 将500 μl的漂洗液Rinse A加入Spin Column中，12,000 rpm 离心30 秒钟，弃滤液。
11. 将700 μl的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm 离心30 秒钟，弃滤液。
注）请确认Rinse B中已经加入了指定体积的100%乙醇。
12. 重复操作步骤11。
13. 将Spin Column 安置于新的1.5 ml 的离心管上，在Spin Column 膜的中央处加入25 μl 的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置 1 分钟。
注）把灭菌蒸馏水或Elution Buffer 加热至60℃使用时有利于提高洗
脱效率。
14. 12,000 rpm 离心1 分钟洗脱DNA。
将1.5ml离心管(DNA)贮存于-20℃。
15 琼脂糖凝胶电泳检测回收产物。
制备：溶胶液：6 M NaClO 4 (pH 5.2) ，0.03M NaAC(pH 5.2)溴酚红少许
洗液：50 mM Tris-cl，0.1 mM EDTA，pH 8.0) 70%乙醇
存储液：TE buffer (10 mM Tris-cl，0.1 mM EDTA，pH 8.0).
注意事项
1.电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌，总之一句话就是保证切下的带没有外源dna污染。
2. 切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。
为了减少胶的体积，可以用相对比较薄的胶来做，只要够点样即可，也可采用薄而宽的梳子来跑胶。
3. 关于防护，在一般有机玻璃后就足够了，戴上防护面具以保护眼睛，如果戴树脂眼镜就可以了。
要是非常害怕紫外照射，或者对于胶有特殊要求，例如要求不含EB，可以采用点marker和带刻度的尺子一起照相的方法来确定目的条带在胶上的位置进行切胶。
4. 按照正常程序点marker跑胶，然后切下有marker的胶，EB染色，紫外灯下与带刻度的尺子一起照相。
由于要回收的带与marker间的相对位置已知，根据尺子来衡量未染色胶上目的带的位置即可。
如果觉得很难判断，可以直接在marker边点少量的样，这样位置就容易确定了。