乳酸菌的生理生化特性.
杂交构树青贮中优势乳酸菌的分离鉴定及其应用
杂交构树青贮中优势乳酸菌的分离鉴定及其应用杂交构树青贮中优势乳酸菌的分离鉴定及其应用引言青贮是一种常用的饲料保存方式，可以有效地保持饲草中的营养成分，并延长其保存期限。
然而，在青贮过程中常常会出现微生物的生长和发展，其中乳酸菌是青贮过程中的关键微生物之一。
乳酸菌在青贮过程中产生的乳酸，可以降低饲料的pH 值，抑制有害微生物的生长，从而保持青贮饲料的营养价值和食用安全性。
本文旨在探究杂交构树青贮中优势乳酸菌的分离鉴定方法，并探讨其在农业生产中的应用前景。
一、杂交构树青贮中优势乳酸菌的分离鉴定1. 试样采集与处理选择不同阶段的杂交构树青贮作为试验对象，采集不同深度和位置的样品用于分析。
将样品置于无菌容器中，在低温条件下进行运输和保存。
2. 乳酸菌的分离将样品取出后，进行稀释操作，制备不同浓度的样品液。
使用MRS培养基进行不同稀释液的平板接种，培养温度设置为37℃，培养时间为24-48小时。
3. 乳酸菌的鉴定通过菌落的形态特征、生理生化特性和基因测序等方法对乳酸菌进行鉴定。
观察乳酸菌菌落的形状、颜色、大小等特征，并进行显微镜下的形态观察。
接下来可以进行氧需求性、产酸性、温度范围、产气性等生理生化特性的测试。
最后，对鉴定结果进行基因测序，确保鉴定的准确性。
二、杂交构树青贮中优势乳酸菌的应用1. 青贮饲料改良杂交构树青贮中的优势乳酸菌可以发酵饲草中的糖类，产生乳酸，降低饲料的pH值。
这种乳酸发酵作用有助于抑制青贮过程中有害微生物的生长，提高饲料的保存能力，并保持饲料中维持营养成分的稳定性。
2. 饲料添加剂将分离鉴定出的优势乳酸菌用于饲料添加剂的研发中，可以在动物饲料中添加乳酸菌制剂。
乳酸菌制剂可以调整动物肠道内菌群的平衡，提高动物的消化吸收能力，增强抗病能力，减少饲料中抗生素的使用，提高乳制品质量。
3. 生物农药杂交构树青贮中优势乳酸菌中的抑菌物质可以作为生物农药的原料。
这种生物农药可以替代化学农药的使用，降低对环境的污染，保护农作物的生长。
乳酸菌定义
乳酸菌乳酸菌（Lactobacillus）是发酵糖类且主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。
凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸的细菌统称为乳酸菌。
是一种存在于人类体内的益生菌。
乳酸菌可用于制造酸奶、乳酪、德国酸菜、啤酒、葡萄酒、泡菜、腌渍食品和其他发酵食品。
1、形态特征乳酸链球菌族，菌体球状，通常成对或成链。
乳酸杆菌族，菌体杆状，单个或成链，有时成丝状、产生假分枝。
2、生活习性繁殖：在固体培养基上菌落较小，生长缓慢。
在液体发酵培养基内可以很快地生长，离心洗涤可以获得纯度较高的菌体且兼具需氧和厌氧的性能。
运动：大多数不运动，少数以周毛运动。
活性：普通的乳酸菌，活力极弱，它们只能在相对受限制的环境中存活，一旦脱离这些环境，其自身也会灭亡。
只有经过特殊工艺处理的乳酸菌才能到达肠道。
进入肠内的乳酸菌，必须具备数量多、活力强，才能发挥其生物功效。
3、类型乳酸菌大体上可分为两大类：（1）动物源乳酸菌取自动物，因菌种常处于相对不稳定状态，其生物功效也较不稳定，且在大量食用时，很容易导致人体动物蛋白过敏，即排斥反应。
（2）植物源乳酸菌因为取自植物易被人体吸收，不论摄取多大的量，人体不会产生异体蛋白排斥反应，且植物源乳酸菌比动物源者更具有活力，能比动物源多8倍的数量到达人体小肠内定植，从而发挥其强大而稳定的生物功效。
4、研究历史早在20世纪初，著名的生物学家梅契尼柯夫（Mechnikoff,1845-1916），在他获得诺贝尔奖的“长寿学说”里已明确指出，保加利亚的巴尔干岛地区居民，日常生活中经常饮用的酸奶中含有大量的乳酸菌，这些乳酸菌能够定植在人体内，有效地抑制有害菌的生长，减少由于肠道内有害菌产生的毒素对整个机体的毒害，这是保加利亚地区居民长寿的重要原因。
5000年前人类就已经在使用乳酸菌。
到目前为止，人类日常食用的泡菜、酸奶、酱油、豆豉等，都是应用乳酸菌这种原始而简单的随机天然发酵的代谢产物。
冷藏酱鸭中乳酸菌的分离鉴定及生物学特性研究
冷藏酱鸭中乳酸菌的分离鉴定及生物学特性研究作者：陈娟娟等来源：《湖北农业科学》2015年第03期摘要：从冷藏的酱鸭中分离筛选乳酸菌，对其进行生理生化特性研究和分子学鉴定。
结果表明，从冷藏酱鸭中筛选到2株优良乳酸菌，分别命名为J1、J2。
结合细菌形态学、生理生化特性和16S rDNA序列同源性以及系统进化树分析表明J1、J2为副干酪乳杆菌亚种（Lactobacillus paracasei subsp.），具有比较好的发酵产酸的能力，并且对大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphy lococcus aureus）具有很强的抑制作用，能够耐受极端的pH环境。
关键字：酱鸭；乳酸菌；分离；鉴定中图分类号：Q939.11+7 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）03-0676-04DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2015.03.044Identification and Biological Characteristics of Lactic Acid Bacteria Isolationfrom the Sauce Duck in Low TemperatureCHEN Juan-juan1，ZHOU Yan-qing1，LI Jing-yun1，ZHANG Yu1，WANG Wan-shen1，FAN Yu-xia1，CHANG Zhao1，YUE Xiao-jie1，YUAN Lu-lu2（1.College of Life Sciences， Henan Normal University， Xinxiang 453007， Henan，China；2. Zhoukou Science and Technology Bureau，Zhoukou 466000，Henan， China）Abstract： The research aimed to isolate and screen the fine lactic acid bacteria from the sauce duck in low temperature and identify them by molecule and biochemical test. Two strains of lactic acid bacteria were isolated and named J1 and J2. With the analysis of bacterial morphological，physiological and biochemical characteristics， 16S rRNA sequence homology and phylogenetic tree analysis， it showed that J1 and J2 were Lactobacillus paracasei subsp. J1 and J2 have a good ability to produce acid fermentation and to inhibit Escherichia coli and Staphylococcus aureus， and both can tolerate extreme pH environment.Key words： sauce duck； lactic acid bacteria； isolation； identification乳酸菌是一种常见的益生菌，具有直接为宿主提供营养物质、促进人和动物生长、调节胃肠道及泌尿生殖道的正常菌群、增强机体免疫和维持微生态平衡等多种功能[1]，被广泛应用到医学、食品、饲料工业和环保等方面。
泡菜中乳酸菌的筛选及培养条件研究
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从 泡菜 中筛 选 出 ４株 高 产 菌株 乳 酸 菌 ．并研 究 其
养基上多次划线分离纯化， 镜检， 得出纯菌株。然后 进行斜 面 接种 ，０— ４ ￣ Ｃ 下 短期 保藏 。
１ ． ３ ． ２ 生理 生化 特性 研 究
耐 盐 性 ：将 产 酸 能 力 最 强 的 一 号 菌 种 分 别 接
第 ｌ ７卷 第 １ 期
２ ０ １ ５年 １ 月
辽 宁 农 业 职 业 技术 学 院学 报
Ｊ ｏ ｕ ｎａ ｒ ｌ ｏ ｆ Ｌ ｉ ａ ｏ ｎ ｉ ｎ ｇ Ａｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ
Ｖｏ１ ． １ ７，Ｎｏ． １
Ｊ ａ ｎ ． ２ ０ １ ５
种于添加 ２ ％ 、４ ％ 、６ ％ 、８ ％Ｎ ａ Ｃ １的 ＭＲ Ｓ液 体
部分生理生化特性 ，为今后乳 酸菌的研究 和工业 上乳酸制品的生产提供可靠的依据。
培养 基 ，３ ０ ￣ Ｃ 分 别 培养 ２ ４ ｈ 、４ ８ ｈ 、７ ２ ｈ ，以 ＭＲ Ｓ
１ 材料和 方法
１ ． １ 试 验材 料
２ 试 验 结 果
２ ． １ 乳酸 菌 的筛选 平板 筛选 ： 目前 产 酸菌 的平 板筛 选 多 用 ｐ Ｈ试 剂 变色 圈法 和 Ｃ ａ Ｃ Ｏ ， 透 明圈 法［ ３ １ 。Ｃ ａ Ｃ Ｏ ， 来 源 广泛 、
乳酸菌的代谢途径和生理功能
乳酸菌的代谢途径和生理功能乳酸菌是一类常见的益生菌，它们可以优化人体肠道环境，调节肠道菌群平衡，有效预防和缓解多种肠道疾病。
当乳酸菌代谢途径正常，生理功能出色时，其对人体健康的贡献也会更大。
一、乳酸菌代谢途径乳酸菌的代谢途径可以分为两类：酸性代谢和非酸性代谢。
酸性代谢是指乳酸菌在缺氧环境下，产生乳酸作为代谢产物；而非酸性代谢则是指乳酸菌在氧气充足的环境下，进行代谢活动。
1.酸性代谢酸性代谢是乳酸菌最常见的代谢途径，其核心生产线是糖酸路。
在糖酸路中，乳酸菌将碳水化合物分解为两个三碳糖，并将其转化为乳酸。
这个过程不需要氧气，因此适用于缺氧环境。
乳酸可以与葡萄糖一样提供能量，从而维持细胞的正常代谢活动。
同时，乳酸也可以作为食品酸化剂，增加食品的质量和口感。
2.非酸性代谢相比于酸性代谢，非酸性代谢更需要氧气的参与。
常见的非酸性代谢途径包括：呼吸链通路、乙酸路、丙酮酸酸解途径等。
其中，呼吸链通路和乙酸路是比较重要的代谢途径。
在呼吸链通路中，乳酸菌需要通过线粒体进行呼吸作用，同时产生能量和二氧化碳。
而在乙酸路中，乳酸菌将木糖醇转化为乙酸和氢气，从而产生能量和二氧化碳。
二、生理功能乳酸菌有许多重要的生理功能，主要包括以下几个方面：1.促进肠道健康乳酸菌能够降低肠道内pH值，促进胃肠道的消化吸收和排泄功能。
同时，乳酸菌可以降低有害菌的数量，增加有益菌的数量，从而保持肠道菌群的平衡。
2.提高免疫力乳酸菌能够调节人体免疫系统，促进免疫细胞的生成和功能。
研究表明，乳酸菌可以通过增加黏膜层细胞和免疫球蛋白的分泌数量，提高人体对病菌的抵抗能力。
3.预防癌症乳酸菌有助于抑制癌细胞的生长和分裂，预防多种癌症的发生。
此外，乳酸菌还可以产生一些抗氧化物质，有效抵御自由基对人体细胞的损伤。
4.改善皮肤质量乳酸菌可以促进人体对维生素C和维生素E等营养物质的吸收，从而提高皮肤质量。
此外，乳酸菌还可以帮助皮肤保湿，减少皮肤病的发生。
以上是乳酸菌的代谢途径和生理功能的一些基本介绍。
乳酸菌的简介
乳酸菌的简介一、乳酸菌的起源根据圣经旧的书上记载，公元前4000多年，人类已经开始发酵乳酸肉制品及蔬菜腌渍物。
直到公元1857年，巴斯德(Pasteur)发现酸乳(sour milk)中有微小生物体存在，将其定名为”levue lactique”，发酵乃微生物作用所致的秘密才首次得以揭露；这是发现乳酸菌的开端。
1873年李斯特(Lister)利用稀释法，由酸乳中纯化分离出Bacterium lactis，也就是目前的Lactococcus lactis，这是乳酸菌最早被分离出来的纪录(廖,1998；李,2000)。
二、乳酸菌的定义乳酸菌一般是指能将碳水化合物发酵分解为乳酸的细菌群(佐佐木隆,1998)。
乳酸菌群具有以下几点特性：1.为革兰氏阳性(gram positive)球菌或杆菌。
2.不产生孢子(nonsporting)且无运动性(nonmotile)3.不具分泌催化酶(catalase negative)之能力。
4.可在有氧环境生长，但以无氧状态下生存较佳，亦有绝对厌氧者。
5.需有碳水化合物、胺基酸、维生素等多种生长因子方能生长之复合营养需求性(complex nutritional requirements)。
6.依代谢途径与最终产物的不同，可分为同质发酵(homofermentative)及异质发酵(heterofermentative)两种乳酸菌。
同质发酵性乳酸菌含有aldolase，最终产物90％-100％为乳酸；异质发酵性乳酸菌具有phosphoketolase，其最终产物除了40％-50％的乳酸外，还包括乙醇、二氧化碳及醋酸等多项产物(Ingledew,1995)。
乳酸菌普遍存在动物体消化道中，因耐酸性佳且可分泌乳酸及抗菌物质等有利于生存的条件，故消化道三大菌群当中最占优势(Nemcova et al. 1997)三、乳酸菌的分类乳酸菌一般包括Lactobacillus (L)、Leuconostoc (Leuc.)、Streptococcus (S)及Pediococcus (Ped.)四属；广义的乳酸菌尚包括Bifidobacterium与Sporolactobacillus 两个属(Jay, 2000)。
乳酸菌菌种的分离筛选方法解读
乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。
为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。
营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。
在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。
通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。
乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。
当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时，SL 培养基常用作为选择性培养基。
对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。
M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。
嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。
其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无鞭毛。
粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。
乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0 μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。
革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。
在MRS培养基上菌落小，呈白色。
沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。
乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。
分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80 等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。
培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。
乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。
分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。
也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。
一. 筛选方法：1.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。
其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。
筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6 →选择合适的稀释度涂布→ 37℃培养48h→挑选产生溶钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。
乳酸菌
正型乳酸发酵： 发酵产物主要是乳酸，也就是理论上将糖类 100%的转化成了乳酸。菌种主要包括乳酸 链球菌、保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌、 嗜酸乳杆菌等。 异型乳酸发酵： 发酵产物除乳酸外，还有乙醇、乙酸、二 氧化碳、甘油和氢气。发酵菌包括：短乳 杆菌、芽孢乳杆菌、大肠菌群类菌等。
乳酸球菌
乳酸杆菌
一、乳杆菌属（Lactobacillus） 1、形态特征：细胞形态以杆状为主的多样形，有长 形、细长状、棒形、弯曲形、短杆状、球杆状 等。一般排列成链，通常不运动，部分有周身鞭 毛，能运动。G+，无芽孢，有些菌株革兰氏染色 呈两极性，内部有颗粒物或呈现出条纹状。 2、培养特性：微好氧性，在固体培养基上培养时， 通常需厌氧条件或减少氧压、或充有5—10%的 CO2，可增加其表面生长物，有些菌株在初次分 离时就需厌氧条件。 常用培养基：MRS琼脂。 生长温度：2—53℃，最适温度30—40℃。 耐酸，最适pH 5.5—6.2。
DNA——G+C的含量为55—67mol% 模式种： 两歧双歧杆菌（Bfidobacterium bifidum） （5）对抗生素的敏感性 ① 具有抗性：多粘菌素B、卡那霉素、新霉素、 链霉素、庆大霉素、萘啶酸。 ② 高度敏感：青霉素G、万古霉素、氯林肯霉素、 红霉素、杆菌肽。 ③ 次敏感：氯霉素、四环素。 现在，由于双歧杆菌作为微生态制剂被广泛应用， 而临床上又不可避免的要使用抗生素，因此，双 歧杆菌对抗生素的敏感性问题应该引起重视。
无色杆菌属（Achrombacter）
通常分布于水和土壤中，形态为短杆状，G-，有鞭 毛，能运动。多数能分解葡萄糖和其它糖类产酸而 不产气，能使肉类和海产品变质、发粘。
产碱杆菌属（Alcaligenes）
分布极广，主要存在于水、土壤、饲料和人畜的肠 道内，形态为杆状，G-，不能分解糖类产酸，能产 生灰黄色、棕黄色或黄色色素。能使乳制品及其它 动物性食品产生粘性而变质，并能在培养基上产 碱。
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1.形态和培养特征观察采用牛肉膏蛋白胨培养基,将已纯化后的甘油菌种活化后于37℃下培养20～24h ,并进行革兰氏染色及菌体形态和菌落特征的观察。
染色方法参照微生物鉴定实验指导2.生长条件试验(1)耐盐性试验(NaCl 浓度:0. 85 、1. 20 和1. 71) (mol/ L) ;(2)耐酸碱试验(p H :4. 3 、5. 7 、6. 8 、8. 4 、8. 6 和8. 7) ;(3)温度梯度试验(温度: 10℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃和65℃) 。
分别将参试菌接种于以上处理的液体培养基中培养48 h ,记录生长状况。
3.生理生化试验⑴过氧化氢酶测定将实验菌接种于PGY培养基斜面上,37℃培养20h—24h,取一环接种的培养物,涂于干净的载玻片上,然后在其上滴加3%－—15%的过氧化氢,有气泡则为阳性反应,无气泡为阴性反应。
⑵葡萄糖产酸产气实验在PY基础培养基内加入30g葡萄糖和5%吐温-80,1.6g/100mL的溴甲酚紫1.4mL作指示剂, 在培养基内放置一小倒管,分装试管置37℃培养24h, 经培养后,指示剂变黄表示产酸,倒管内出现气泡,表示产气。
⑶淀粉水解实验接种新鲜的菌种于含有0.5g可溶性淀粉的PY基础培养基中,取少许培养液于比色盘内,同时取未接种的培养液作对照,分别在其中加入卢哥氏碘液.不显色表示淀粉水解,显蓝黑色或蓝紫色时,表示淀粉未水解或水解不完全。
⑷明胶液化实验将实验菌接种于明胶基础培养基中,置37℃培养,以一支未接种的试管作为对照。
将接种的和未接种的对照管置于冰箱或冷水中,等待对照管凝固后记录实验结果,反复观察对比多次。
如对照管凝固时,接种管液化为阳性反应,凝固为阴性反应⑸甲基红（M.R）试验接种实验细菌于PYG培养基，于37℃培养2天后，于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液，如呈红色，表示阳性。
⑹乙酰甲基甲醇V-P实验接种新鲜的实验菌种于培养基中, 37℃培养2天后,取培养液1mL在其中加入1ml 10％的NaOH，混匀，再加入3－4滴2%氯化铁溶液。
数小时后，培养基表面的下层出现红色者，为阳性⑺柠檬酸盐取幼龄菌种接种于柠檬酸盐斜面培养基上，适温培养3－7天，培养基呈碱性（蓝色）者为阳性反应，不变者则为阴性⑻酪素水解试验牛奶平板的制备：取5g脱脂奶粉加入50mL蒸馏水中（或用50mL脱脂牛奶），另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水中，将两液分开灭菌。
待冷至45－50℃时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板。
将平板倒置过夜，使表面水分干燥，然后将菌种点接在平板上，每皿可点接3－5株菌。
适温培养1、3、5天，记录菌落周围和下面酪素是否已被分解而呈透明。
配制该培养基时，切勿将牛奶和琼脂混合灭菌，以防牛奶凝固⑼厌氧生长测定将菌种接入营养肉汤平板后,用密封带包好放入CO2培养箱37℃培养2天后,观察生长情况,生长则为阳性(10)厌氧硝酸盐产气接种封油：以斜面菌种用接种环接种后，用凡士林油（凡士林和液体石蜡为1:1）封管，封油的高度约1厘米。
必须同时接种不含有硝酸钾的肉汁胨培养液作对照。
观察结果：培养2－7d，观察在含有硝酸钾的培养基中有否生长和产生气泡。
如有气泡产生，表示反硝化作用产生氮气，为阳性反应。
但如不含硝酸钾的对照培养基也可产生气泡，则只能按可疑或阴性处理。
(11)石蕊牛奶的反应牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白，在牛奶中加入石蕊是作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。
石蕊在中性时呈淡紫色，酸性时呈粉红色，碱性呈蓝色，还原时则自上而下地褪色变白。
观察其产酸、产碱、胨化、酸凝固、凝乳酶凝固、还原情况(12)糖发酵实验将需要测定的糖或醇类等碳水化合物加入PY基础培养基中,按表分装含5mL培养基的试管.分别取0.2mL,被鉴定菌株接到灭菌后的碳水化合物培养基中37℃培养24h,振荡培养。
检测时取培养液少许置于比色盘内,同时取未加碳水化合物的PY培养液作为对照,滴加试剂比较颜色的变化,记录产酸的强弱.附一些培养基：①PY培养基（100mL）：蛋白胨1.0g,酵母提取物1.0g,无机盐溶液4.0mL[盐溶液成分:无水CaCl2 0.2g,MgSO420.0g ,K2HPO4 1.0g, ,KH2PO4 1.0g,NaHCO3 10.0g,NaCl 2.0g](将CaCl2和MgSO4一起溶解于300mL蒸馏水中,再加500mL蒸馏水,一边搅拌一边缓慢加入其他盐类.继续搅拌直到全部溶解,加蒸馏水定容至1000mL,混合后贮备于4℃)②PYG培养基:PY在基础培养液内加入1.0g葡萄糖③营养明胶蛋白胨5g、牛肉膏3g、明胶120g、蒸馏水1000mL、pH6.8～7.0；加热溶解、校正至pH7.4～7.6，分装小管，121℃高压灭菌10min，取出后迅速冷却，使其凝固。
复查最终pH应为6.8～7.0④柠檬酸盐斜面培养基：柠檬酸钠3g NH4H2PO4 1g MgSO4 0.2gK2HPO4 1g NaCl 5g 琼脂15—20g 水1000mL 加热溶解后，调pH至7，再加入1.6%溴麝香草酚蓝指示剂10mL,培养基呈绿色，分装试管，每管5mL，121灭菌30min⑤含硝酸钾的营养肉汤加入2g硝酸钾入营养肉汤4.16S rDNA 序列分析这个LZ另外查好了，很多学问。
5.生长曲线活菌计数方法：采用涂布法,进行菌落计数，每隔一段时间（2-4小时）测实验九细菌的生理生化试验[日期：2009-5-30] 来源：作者：孔庆学[字体：大中小]实验九细菌的生理生化试验1 目的1.1 了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理1.2 掌握测定细菌生理生化反应的技术和方法2 原理各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。
由于细菌特有的单细胞原核生物的特性，这种差异就表现的更加明显。
不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，所以其发酵的类型和产物也不相同，也就是说，不同微生物具有不同的酶系统。
即使在分子生物学技术和手段不断发展的今天，细菌的生理生化反应在菌株的分类鉴定中仍有很大作用。
3 材料3.1 菌种大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的斜面菌种3.2 培养基葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗糖）3.3 试剂40％NaOH溶液、肌酸、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲基酚紫指示剂。
3.4 器具超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液管、杜氏小套管。
4 流程糖发酵试验→V-P试验→甲基红试验→吲哚试验5 步骤(一) 糖类发酵试验1 目的了解不同细菌分解利用糖的能力及实验原理，并掌握其操作方法．2 原理可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。
是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即B.C.P指示剂，其pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。
是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。
3 材料3.2菌种大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）的斜面菌种3.３培养基葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管４流程发酵液试管→标记→接种→培养→观察→记录5 步骤5.1 试管标记图9-1 糖发酵产气取分别装有葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管各Ａ不产气；Ｂ产气4支，每种糖发酵试管中均分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌和空白对照。
5.2 接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。
将装有培养液的杜氏小管倒置放入试管中（图9-1），置37℃恒温箱中培养，分别在培养24h、48h、和72h观察结果。
5.3 观察记录与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“－”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“＋”表示。
培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“＋”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“－”表示。
（二）乙酰甲基甲醇试验(V．P试验)1 目的了解鉴别不同肠杆菌科各菌属的乙酰甲基甲醇试验原理，并掌握其操作方法．2 原理某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧，氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。
3 材料3.1 菌种大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的斜面菌种3.2 培养基葡萄糖蛋白胨培养液的试管４流程培养液试管→标记→接种→培养→观察→记录5 步骤5.1 标记试管取5支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。
5.2 接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置37℃恒温箱中，培养24～48h。
5.3 观察记录取出以上试管，振荡2min。
另取5支空试管相应标记菌名，分别加入3～5ml以上对应管中的培养液，再加入40％NaOH溶液10～20滴，并用牙签挑入约0.5～1mg微量肌酸，振荡试管，以使空气中的氧溶入，置37℃恒温箱中保温15～30min后，若培养液呈红色，记录为V.P.试验阳性反应（用“＋”表示）；若不呈红色，记录为V.P.试验阴性反应（用“－”表示）。
注意：原试管中留下的培养液用作甲基红试验。
（三）甲基红试验（M.R.试验）1 目的了解鉴别肠杆菌科各菌属的甲基红试验原理，并掌握其操作方法．2 原理肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。
3 材料3.1 菌种同V．P试验3.2 培养基同V．P试验4 流程培养液→指示剂→观察→记录结果5 步骤于V.P.试验留下的培养液中，各加入2～3滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层，若培养液上层变成红色，即为阳性反应；若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用“＋”或“－”表示。
（四）吲哚试验1 目的掌握吲哚试验(Ehrlich法)的原理和方法2 原理有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚(靛基质)。