鹅源草酸青霉CBH_基因克隆及真核表达载体构建

中国农业科学 2010,43(7):1464-1472Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2010.07.018 鹅源草酸青霉CBHⅠ基因克隆及真核表达载体构建王宝维1，2，张 倩1，葛文华1，张名爱2，岳 斌1，黄国清2（1青岛农业大学优质水禽研究所，山东青岛 266109；2青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛 266109）摘要：【目的】鹅源草酸青霉F67（Penicillium oxalicum Currie ＆Thom）纤维素酶二糖水解酶（cellobiohydrolase, CBHⅠ）基因克隆并构建真核表达载体，为该菌株分子特性的进一步研究及构建高效纤维素分解菌奠定基础。

【方法】首先通过兼并PCR法扩增CBHⅠ基因片段，然后利用改良热不对称交错PCR（TAIL-PCR）技术克隆CBHⅠ基因5′端和3′端侧翼序列，最后采用RT-PCR法扩增鹅源草酸青霉F67 CBHⅠ基因序列全长，并 对该基因进行生物信息学分析，构建pPIC9K真核表达载体。

【结果】分别扩增到鹅源草酸青霉F67纤维素酶 CBHⅠ基因片段A(EU574736)、5′端序列B1(EU603295)、3′端序列B2(EU652768)及全长基因C(EU727171)，并成 功构建真核表达载体pPIC9K-CBHⅠ；生物信息学分析表明，该基因蛋白序列与微紫青霉氨基酸序列同源性最高，达76%，前26个氨基酸为信号肽序列，疏水性可达2.63，由催化功能域、衔接区和真菌性纤维素结合域构成， 其三级结构主要为β-sheet。

【结论】鹅源草酸青霉纤维素酶CBHⅠ基因全长序列的克隆进一步丰富了丝状真菌 的生物信息学资源；其真核表达载体的构建为将该菌株进一步在真核宿主中表达，从而获得高效工程菌株奠定了基础。

关键词：鹅源草酸青霉；外切葡聚糖酶；TAIL-PCRCloning of the CBHI Gene of Goose-Origin Penicillium oxalicum Currie & Thom and Its Eukaryotic Expression Vector Construction WANG Bao-wei1,2, ZHANG Qian1, GE Wen-hua1, ZHANG Ming-ai2, YUE Bin1, HUANG Guo-qing2 (1High Quality Waterfowl Research Institute, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, Shandong; 2College of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, Shandong)Abstract: 【Objective】The aim of the study was to clone the cellobiohydrolase gene (CBHⅠ) of goose-origin Penicillium oxalicum Currie ＆Thom F67 and construct the eukaryotic expression vector for the gene. 【Method】A fragment of the CBHⅠgene was amplified by degenerate PCR, the 5′and 3′ flanking sequences of CBHⅠ gene were cloned using TAIL-PCR, and the full-length sequence of the CBHⅠgene was cloned by RT-PCR. The construction of the eukaryotic expression vector for the gene was also studied. 【Result】Fragment A (EU574736), 5′ sequence B1 (EU603295), 3′ sequence B2 (EU652768) and full-length sequence C (EU727171) of the CBHⅠgene were cloned successfully and an eukaryotic expression vector named pPIC9K-CBHⅠwas constructed for the gene. The bioinformatics analysis showed that the gene had the highest homology with the gene of Penicillium janthinellum, which reached up to 76%. The first 26 amino acids might be a signal peptide sequence with the hydrophobicity of up to 2.63. The CBHⅠgene consisted of the catalytic domain, convergence zone and cellulose-binding domain and its tertiary structure was mainly composed of β-sheets. 【Conclusion】The successful cloning of the full-length sequence of CBHⅠ gene of goose-origin Penicillium oxalicum Currie ＆ Thom F67 enriched the biological information resource of filamentous fungi, and the construction of the eukaryotic expression vector pPIC9K-CBHⅠhas laid a foundation for the expression of the CBHⅠgene in eukaryotic hosts and the availability of high-performance engineering strains.Key words: goose-origin Penicillium oxalicum Currie & Thom; CBHⅠ; TAIL-PCR收稿日期：2009-08-18；接受日期：2010-01-11基金项目：国家科技支撑计划项目（2008BADB2B08）、山东省良种工程项目作者简介：王宝维，教授。

E-mail：wangbw@7期王宝维等：鹅源草酸青霉CBHⅠ基因克隆及真核表达载体构建 14650 引言【研究意义】外切葡聚糖酶（exo-1,4-β-D- glucanase, EC.3.2.1.91）又称纤维二糖水解酶（cellobiohydrolase, CBH），是真菌降解天然纤维素的酶系中重要组分之一。

鹅源草酸青霉F67（Penicillium oxalicum Currie ＆ Thom）由鹅肠道分离并经中国科学院微生物研究所鉴定（微生物保藏号为CGMCC NO.2260），试验证明该菌株为高酶活纤维素分解菌[1-2]，对其外切葡聚糖酶基因的克隆，可为丰富丝状真菌的生物信息学资源及构建高效工程菌株奠定基础。

【前人研究进展】目前国内外对分解纤维素能力较强的真菌研究很多，对纤维素酶基因克隆的研究发展也非常迅速，且主要集中在真菌产生的酸性纤维素酶方面。

其中对木霉和曲霉纤维素酶基因研究比较透彻，如瑞氏木霉[3]、康宁木霉[4]和绿色木霉[5]，关于青霉纤维素酶基因克隆的研究报道相对较少[6]。

酵母菌是近年来广泛应用于商业化生产外源蛋白的基因工程菌，许多菌株的纤维素酶基因已成功在其细胞内得到了分泌表达[7]。

【本研究切入点】目前绝大多数真菌都是从土壤、腐烂物以及粪便中分离所得[8-11]，关于从动物体内分离纤维素分解菌的研究大多局限在反刍动物的瘤胃真菌，至今未见从家禽体内分离纤维素分解菌的报道，青岛农业大学优质水禽研究所从鹅肠道分离鉴定出一株草酸青霉F67，对此菌液体发酵特性研究发现，羧甲基纤维素钠可以强烈诱导草酸青霉产纤维素酶，以尿素为氮源时，纤维素酶活性维持在较高水平。

【拟解决的关键问题】本试验以草酸青霉F67为试验菌株，采用兼并PCR、RT-PCR、TAIL-PCR等分子生物学手段对其CBHⅠ基因进行克隆，同时构建真核表达载体，为该菌株分子特性的进一步研究及构建高效纤维素分解菌奠定基础。

1 材料与方法1.1 材料鹅源草酸青霉F67，为青岛农业大学优质水禽研究所分离鉴定保存的菌种（在优化条件下，产酶活力达到581.745 U·mL-1）；大肠杆菌E. coli DH5α，为实验室保存菌株；克隆载体pMD18-T、MMLV、RNasin、Taq酶、LA Taq酶、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2.0、DL-2000、X-gal、IPTG购自TaKaRa生物公司；RNA Trizol购自上海FASTAGEN生物公司；DEPC 购自TOYOBO公司；溴化乙啶、氨苄青霉素购自华美生物工程公司；琼脂糖购自Sigma公司；引物由上海生工合成；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 总RNA提取将草酸青霉从种子培养基中挑取菌环孢子，接种于装有50 mL羧甲基纤维素培养基（液体（g·L-1），羧甲基纤维素15.0，NH4NO3 1.0，KH2PO4 1.0，MgSO4·7H2O 0.5，酵母膏1.0，pH 7.0—7.5）的250 mL 烧瓶中，30℃，1 500 r/min摇床培养48 h。

采用真空抽滤法分离菌丝与培养基，菌丝体收集后，依次用无菌生理盐水洗涤1次，得到干净的菌丝体后提取菌丝总RNA，RNA提取参考RNA Trizol试剂操作说明书。

1.3 CBHⅠ基因克隆1.3.1 引物设计1.3.1.1 兼并引物设计 根据GenBank已发表的Penicillium janthinellum、Penicillium chrysogenum、Penicillium decumbens和Penicillium occitanis等青霉属纤维素酶CBHⅠ基因蛋白保守序列，利用Premier 5.0和Oligo 6.0引物设计软件设计兼并引物如下：P1：5′ TTGTCAGAT（C）G（T）CCAACTGGC 3′；P2：5′ CTGGTCGAGCCAC（G）TG（A）CATGT 3′。