大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶
丹参酮对去卵巢大鼠牙槽骨丢失的抑制作用
丹参酮对去卵巢大鼠牙槽骨丢失的抑制作用张晓燕崔燎吴铁刘运新（广东医学院，广东东莞523808）〔摘要〕目的探讨丹参酮对去卵巢大鼠牙槽骨丢失的抑制作用。
方法SD 大鼠随机分为对照组、去卵巢组和丹参酮治疗组。
实验90d后取大鼠牙槽骨，测量牙槽骨组织形态计量学参数、牙槽骨组织中碱性磷酸酶（ALP ）和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP ）活性。
结果与去卵巢组相比，丹参酮治疗组牙槽骨骨量明显增多，%Tb.Ar 升高33.33%（P ＜0.05）；牙槽骨组织中ALP 阳性的成骨细胞数升高了51.38%（P ＜0.05）；TRAP 阳性的破骨细胞数减少27.27%（P ＞0.05）。
结论丹参酮能促进牙槽骨骨形成和抑制骨吸收，防治牙槽骨骨质疏松。
〔关键词〕牙槽骨；骨质疏松；丹参酮；碱性磷酸酶；抗酒石酸酸性磷酸酶〔中图分类号〕R589.5〔文献标识码〕A〔文章编号〕1005-9202（2012）01-0113-02；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.01.048通讯作者：吴铁（1955-），男，教授，硕士生导师，主要从事骨质疏松的研究第一作者：张晓燕（1978-），女，硕士，讲师，主要从事骨质疏松的研究。
牙槽骨是上下颌骨包围和支持牙根的部分，是决定牙齿能否固定在口腔中发挥正常功能的关键。
研究发现系统性骨质疏松时牙槽骨也出现骨丢失，牙槽骨骨质疏松加速牙槽骨的破坏和牙脱落〔1，2〕、促进牙周病的发生〔3〕。
所以，防治牙槽骨骨质疏松具有重要意义。
传统中药-丹参具有抗氧化、心血管药理作用及抗炎消菌作用而在临床中广泛应用。
丹参由水溶性成分和脂溶性成分组成，其中，丹参酮是其主要的脂溶性成分。
本课题组发现丹参酮能防止去卵巢大鼠腰椎和胫骨松质骨的丢失〔4〕然而，丹参酮能否防止去卵巢大鼠牙槽骨丢失，目前国内外未见报道。
该实验通过测定各组大鼠牙槽骨组织形态计量学参数、碱性磷酸酶（ALP ）和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP ）活性，探讨丹参酮对去卵巢大鼠牙槽骨的影响。
补肾中药复方对高盐摄入去卵巢大鼠骨代谢及ENaCα、NCC和ClC-3表达的影响
补肾中药复方对高盐摄入去卵巢大鼠骨代谢及ENaCα、NCC和ClC-3表达的影响崔琰;孙珂焕;詹小瑶;莫枢;肖雅雯;王攀攀;杨丽;张荣华;朱晓峰【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2024(40)1【摘要】目的:探讨补肾中药复方(Bushen formulae,BHF)对高盐摄入去卵巢大鼠骨代谢的影响及其可能的作用机制。
方法:80只SPF级SD雌性大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、中高盐组、高盐组、补肾方组、补肾方+生理盐水组、补肾方+中高盐组、补肾方+高盐组,每组各10只,造模后给予不同饮食、补肾中药复方干预,中高盐饮食、高盐饮食中氯化钠添加浓度分别为2%w/w、8%w/w,补肾中药复方干预剂量为7.8 g·kg^(-1)·d^(-1),每日1次,连续给药12周。
检测各组骨密度、骨微结构、骨参数、骨代谢生物标志物、骨组织病理变化情况以及采用Western blot检测骨组织上皮钠离子通道α(ENaCα)、钠-氯同向转运体(NCC)、电压门控性氯离子通道3(ClC-3)蛋白的表达。
结果:与假手术组相比,模型组大鼠骨密度降低,骨微结构破坏;与模型组相比,中高盐、高盐饮食组大鼠骨微结构破坏更为明显,同时高盐组骨形成标志物骨钙素(BGP)、Ⅰ型原胶原氨基端前肽(PINP)水平显著上升(P<0.05),骨吸收标志物Ⅰ型胶原氨基端肽(NTX)、Ⅰ型胶原羧基端肽(CTX)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)均显著增加(P<0.05),骨代谢处于高转换状态;高盐饮食加速骨小梁结构的破坏,Western blot结果显示高盐饮食引起股骨组织ENaCα、ClC-3蛋白表达水平下降(P<0.05),NCC蛋白表达水平升高(P<0.05),补肾中药复方干预后能够不同程度的调节高盐引起的相关离子通道的表达。
结论:补肾中药复方能够不同程度的调节高盐引起的相关离子通道ENaCα、ClC-3、NCC的表达,对骨代谢失衡具有一定的改善和治疗作用。
益肾填精、补钙壮骨中药复方对骨形成蛋白-4诱导成骨信号转导机制的调控作用
益肾填精、补钙壮骨中药复方对骨形成蛋白-4诱导成骨信号转导机制的调控作用（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）【摘要】目的研究益肾填精、补钙壮骨中药复方对骨形成蛋白-4(BMP-4)诱导成骨信号转导机制的调控作用。
方法将雌性Wistar 大鼠随机分为7组：正常组、模型空白组、牡蛎钙补肾中药复方低剂量组、牡蛎钙补肾中药复方中剂量组、牡蛎钙补肾中药复方高剂量组、骨疏康颗粒组、牡蛎碳酸钙咀嚼片组。
采用切除大鼠双侧卵巢的方法复制绝经后骨质疏松症模型,应用益肾填精、补钙壮骨中药复方防治12周后进行取材及实验指标检测：用双能X线骨密度仪检测股骨骨密度；用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测大鼠骨组织BMP-4和Smad5、6 mRNA表达。
结果与模型空白组比较,中药复方各剂量组股骨骨密度显著升高(P＜0.01)；骨组织BMP-4、Smad5 mRNA表达水平明显升高(P＜0.01),Smad6 mRNA表达水平明显降低(P＜0.01)。
结论益肾填精、补钙壮骨中药复方可明显上调BMP-4和Smad5 mRNA表达,下调Smad6 mRNA表达。
【关键词】骨质疏松症；骨形成蛋白-4；信号转导；Smads蛋白Abstract：Objective To study the regulating effect of complementing calcium and invigorating kidney method on the bone morphogenetic protein-4 (BMP-4) and signal transduction mechanism. Methods Female Wistar rats were randomly divided into seven groups：normal group, model group, low-, middle-, high-dose yster calcium compound Chinese medicine for reinforcing kidney group, Gushukang granule group, oyster shell calcium tablets group. The model of postmenopausal osteoporosis was established through ovariectomy in rats. The osteoporosis rats were treated with nanometer calcium and invigorating kidney Chinese medicine Gushukang granule, and oyster shell carbonate chewable tablets were used as positive-control groups, the normal rats as standard control, and the model rats as model control. After 12 weeks of the treatment, the indexes were tested. The bone mineral density (BMD) of femoral bone in vitro was detected by dual-energy X-ray densitometer and the expression of BMP-4 and Smad 5, 6 mRNA were detected by reverse transcription-polymerase chain reation (RT-PCR). Results Compared with the model rats, BMD of femoral bone in Chinese medicine groups (high dose, middle dose, low dose) increasedobviously (P＜0.01). The expression of BMP-4 and Smad5 mRNA increased obviously (P＜0.01), and the expression of Smad6 mRNA decreased obviously (P＜0.01). Conclusions Nanometer calcium and invigorating kidney Chinese medicine can increase the expression of BMP-4 and Smad5 mRNA, and decrease the expression of Smad6 mRNA.Key words：osteoporosis；bone morphogenetic protein-4；signal transduction；Smads protein骨质疏松症是一种全身代谢性疾病,其病理机制十分复杂,是由多种细胞、激素和生长因子参与、互相交织而成的复杂网络。
1,25(OH)2维生素D3诱导大鼠骨髓单核细胞形成破骨细胞
特 征 、 异 性 酶 表 达 、 及 骨 吸 收 陷 窝 。进 而 计 数诱 导 的 破 骨 细 胞 数 量 ， 定 其 功 能 活 性 ， 与全 骨 髓 诱 导 方 法 比 特 以 鉴 并 较。 结果 骨 髓 单 核 细 胞 诱 导 组 在 培 养 第 ７ｄ出现 Ｔ ＡＰ 多 核 细 胞 ， １ ＡＰ 多 核 细 胞 数 量 达 峰 值 ， ２ Ｒ 第 ４ｄＴＲ 第 １ｄ
细 胞 形 成破 骨 细胞
葛冬霞， 良 吴 李 △， 江， 陈槐卿
四 川 大 学华 西基 础 医学 与 法 医 学 院 生 物 医 学 工 程 研 究 室 （ 都 ６ ０ ４ ） 成 １ ０ １
【 要 】 目的 观察 １ ２ 羟 维 生 素 Ｄａ１ ２ （ 摘 ，５二 ［ ，５０Ｈ） ］ 导 成 年 大 鼠骨 髓 来 源 的单 核 细 胞 形 成 多 核 破 骨 细 ｚ 诱 Ｄａ 胞 的 作 用 。方 法 实 验 分 为 单 核 细 胞 诱 导 组 和 全 骨髓 诱 导组 ， 组 各 １ 每 Ｏ只大 鼠 。密 度 梯 度 离 心 法 分 离 大 鼠骨 髓 中 的 单 核 细 胞 ，— Ｅ 培 养 液 中加 入 １ ｍｏ／ 的 １２ （ Ｈ） Ｄ 诱 导 单 核 细 胞 向破 骨 细 胞 分 化 。利 用 抗 酒 石 酸 酸 ａＭ Ｍ ０ ｌＬ ，５Ｏ ｚ 。
ｃ ｌ ｗｅ ｅ ｓ ｌｔｄ ｒ ｍ ｒ ｔ ｏ ｅ ｅｌ ｓ ｒ ｉｏａｅ ｆｏ ａ ｂ ｎ ｍａ ｒ ｗ ａ ｄ ｕｔ ｒｄ ｎ ｈ ａＭ ＥＭ ｗｉ １ — ｍｏ ／ １ ５ （ ｒｏ ｎ ｃ ｌｕ ｅ ｉ ｔ ｅ — ｔ ｈ ００ ｌＬ ，２ ＯＨ ） ２
抗洒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP 5b)定量测定
抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRACP 5b）定量测定一、简介和用途、适用范围大量的抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）是由骨吸收的破骨细胞和有活力的巨噬细胞所释放的。
在血液循环中的TRACP有TRACP 5b 和TRACP 5a二种形式， TRACP 5b 来源于破骨细胞，而TRACP 5a来源于巨噬细胞。
由破骨细胞刚分泌到血液中的TRACP 5b是有活性的酶，但当TRACP 5b在血液循环中被清除之前已无活性，并被降解为碎片。
这样TRACP 5b不会因肝、肾功能受损而在血液中积蓄。
血清中TRACP 5b均来源于破骨细胞，此酶在昼夜的活性水平变化不明显，且不受进食的影响，故可在一天的任何时候都可以采集标本进行检验。
此试剂盒依据测定由破骨细胞释放的TRACP 5b的特异性测定方法。
它可以用于测定骨吸收亢进的病人，如原发性骨质疏松和肾性骨病，也可以预测骨折的危险性，并便于了解抗骨吸收治疗的效果。
在肿瘤病人中，当TRACP 5b 的活力增高提示肿瘤骨转移。
在体外，培养基中TRACP 5b的活力大小代表了破骨细胞数量的多少，因此应用于此试剂盒在进行人的破骨细胞培养时，可用于检测破骨细胞的数量。
二、试验原理测试孔内已包被抗TRACP单克隆抗体→加入校准液、质控品和样品→加入释放剂→有活性的TRACP 5b从结合蛋白质上离解→TRACP 5b与孔内包被的抗TRACP单克隆抗体结合→加入底物pNPP孵育→加入终止液终止反应→在酶标仪上检测结果。
此试验的优点1、所测定的TRACP 5b是由破骨细胞专一释放的。
2、此试验对TRACP 5a或其它磷酸酶没有干扰。
3、溶血不影响结果。
4、不受昼夜变化的影响。
5、不受肝脏、肾脏疾病的影响。
6、不受进食的影响。
7、酶标板容易拆卸，方便检测。
三、试剂盒（一）组成1、酶标板：96孔，已包被抗—TRACP抗体。
2、质控液：3×0.5ml。
3、校准液：3×0.5ml(3×1U/L,3×5U/L,3×10U/L)。
钙磷对体外培养大鼠破骨细胞的影响
钙磷对体外培养大鼠破骨细胞的影响顾建红1，刘俊栋1,2，翟必华1,3，刘学忠1，卞建春1，刘宗平1*（1. 扬州大学兽医学院，扬州 225009；2. 江苏畜牧兽医职业技术学院，泰州 225300；3.福建进出口检验检疫局，福州 350001）摘要：通过成骨细胞（osteoblast, OB）与脾细胞共培养在体外诱导脾细胞转化为破骨细胞（Osteoclasts, OC），转化过程中分别加入5 mmol/L、3 mmol/L的钙(Calcium, Ca)或磷(Phosphorus, P)及不同浓度比例的钙磷，对照不添加钙磷因子。
采用形态学观察、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色计数、扫描电镜观察象牙片吸收陷窝，研究钙磷因子作用下OC的生成和活化。
结果表明，培养液中Ca、P浓度分别为3 mmol/L及5 mmol/L 对OC的生成及活化均有显著抑制作用（P<0.05），5 mmol/L Ca与对照组比较差异极显著（P<0.01）。
Ca:P 为2:1组对OC生成和活化的抑制作用最强。
认为钙磷通过抑制OC生成和活化，从而抑制OC的骨吸收活性。
关键词：破骨细胞；磷；钙；抗酒石酸酸性磷酸酶；吸收陷窝Effects of calcium and phosphoruson Rat’s osteoclasts formation and activationGu Jianhong 1, Liu Jundong1,2, Zhai Bihua1,3, Liu Xuezhong1,Bian Jianchun1, Liu Zongping1*（1. College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Jiangsu, Yangzhou 225009, China;2. Jiangsu Animal Husbandry & Veterinary College, Jiangsu, Taizhou 225300, China；3. Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou 350001, China)Abstract: Osteoclasts were obtained by a co-culture system with rat spleen cells and osteoblasts. In the conversion process, different strengths of calcium, phosphorus and different concentration ratios of calcium to phosphorus were added to the co-culture system. The formation and activation of osteoclasts was detected by morphologic observation, histochemical staining for tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and detection of lacunar resorption through scanning electron micrograph. The formation and activation of osteoclasts were inhibited by high concentration of calcium and phosphorus (p<0.05). Compared with control, the difference of high concentration group was very significant. Moreover, osteoclasts formation and activation were inhibited by the ratio of calcium to phosphorus (2:1) mostly. Calcium and Phosphorus inhibit bone absorbing activity by inhibiting formation and activation of osteoclasts.Keyword: osteoclast; phosphorus; calcium; tartrate-resistant acid phosphatase; lacunar resorption 钙、磷或维生素D代谢紊乱是引起动物骨营养不良的主要原因。
大鼠模型
大运动性疲劳模型建立方法的比较研究
大鼠运动应激性溃疡模型的建立
本研究对大鼠进行一次性跑台运动和12周长期跑台
运动训练,从组织形态学、生物力学、生物化学、分子生物学等不同层次和角度,
比较跟键在不同运动过程中的反应和适应性变化,探讨跑台运动对大鼠跟膜的影
响及其变化机制。本实验采用了两种运动干预方式:①一次性跑台运动组:健康雄
尿病大鼠再按体重各自随机分为5组：安静对照组、一次性运动组、一次性运动+KN93组、耐力
训练组、耐力训练+KN93组，共10组。跑台速度20 m/min，运动时间1 h。一次性运动组大鼠1
次运动后3 h取材。耐力训练组采用同样跑台速度和运动时间，训练1周，并于最后1次训练后
12 h取材。结果得到，糖尿病大鼠耐力训练组，骨骼肌细胞核内MEF2和GLUT4的结合活性及
1%’’’AS:BJ，!’分钟2取上清液（血清），保存待测；
迅速取骨骼肌腓场肌红肌部分，液氮速冻后迅速转移到超低温
1/ )*!2冰箱保存!分别测定骨骼肌中L\]与^R-O? =活性!
过度训练对大鼠骨骼肌
将40只大鼠随机
分为训练对照组和过度训练组,分别进行8周的中等强度和大强度跑台训练,于第8周周末运动后处死全部
MDA含量和PLA2活性明显升高,GSH含量和SOD活性明显降低;第8周末,心肌ACP和β-葡萄糖醛酸酶明
显增加。结果显示过度训练后心肌线粒体的结构和功能发生了明显变化,这些变化是引起过度训练状态下
心肌损伤的主要原因。
过度训练状态下大鼠心肌线粒体病理性变化的研究
雄性SD大鼠24只,体重为395 -432g,由苏州大学实验动
结合活性，虽然MEF2和GLUT4的结合活性参与调解了正常大鼠骨骼肌GLUT4基因表达，但并
中医不同治法对骨质疏松症大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶含量影响的比较研究
中医不同治法对骨质疏松症大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶含量影响的比较研究杨芳;朱辉;郑洪新;王剑;林庶茹【摘要】目的观察中医不同治法对糖皮质激素诱导骨质疏松症大鼠骨抗酒石酸酸性磷酸酶含量的影响,探讨中医防治骨质疏松症的作用机制.方法将120只雌雄各半的大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、补肾中药组、健脾中药组、活血化瘀中药组和骨疏康中药组6个组,用地塞米松肌注造模.实验结束后,腹主动脉取血处死大鼠,用酶联免疫法检测各组大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶的含量.结果与正常组比较,模型组大鼠血清TRACP含量升高极为显著(P＜0.01);与模型组比较,各治疗组大鼠血清TRACP含量均明显降低,其中以补肾组和骨疏康组降低最为明显,与其他各组比较具有极显著差异(P＜0.01).结论补肾方法通过降低抗酒石酸酸性磷酸酶含量对骨质疏松症具有一定的防治作用.【期刊名称】《中国骨质疏松杂志》【年(卷),期】2016(022)004【总页数】3页(P393-395)【关键词】骨质疏松症;抗酒石酸酸性磷酸酶;补肾方法;中医【作者】杨芳;朱辉;郑洪新;王剑;林庶茹【作者单位】辽宁中医药大学,沈阳110847;辽宁中医药大学,沈阳110847;辽宁中医药大学,沈阳110847;辽宁中医药大学,沈阳110847;辽宁中医药大学,沈阳110847【正文语种】中文【中图分类】R-332骨质疏松(osteoporosis，OP)是以骨量减少、骨微观结构退化为特征，致使骨的脆性增加以及易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病。
糖皮质激素(glucocorticoid，GC)是引起骨质疏松症的最常见的药物，长期接受GC治疗者都有发生骨质疏松的危险，而这种由GC治疗所导致的骨质疏松症即成为糖皮质激素性骨质疏松症(glucocorticoid induced osteoporosis，GIO)。
本实验研究以中医学整体观念为指导思想，采用分子生物学的技术，观察补肾、健脾、活血化瘀方法对糖皮质激素性骨质疏松症大鼠的抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRACP)含量的影响。
雄激素受体抑制剂对大鼠成骨细胞的作用分析
雄激素受体抑制剂对大鼠成骨细胞的作用分析杨政兴;陈忠铭;刘美宝;陈夏韧【期刊名称】《临床合理用药杂志》【年(卷),期】2017(10)34【摘要】目的分析雄激素受体抑制剂对大鼠成骨细胞的作用。
方法采用LNCaP人前列腺癌细胞建立原发性裸鼠前列腺癌模型,其中实验组21只应用雄性激素受体抑制剂——比卡鲁胺进行饲喂给药,对照组7只注射生理盐水,另选择未荷瘤裸鼠6只为空白组,比较给药前后3组裸鼠血清睾酮、雄激素、骨源性碱性磷酸酶(BALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP-5b)水平。
结果 LNCaP人前列腺癌细胞荷瘤小鼠及空白组裸鼠生长情况均正常,精神状态较好,均无实验过程中死亡。
于实验组比卡鲁胺给药1周后,3组各项指标比较差异均无统计学意义(P>0.05);比卡鲁胺给药4周后,实验组睾酮水平明显低于对照组和空白组(P<0.05),雌激素水平高于对照组和空白组(P<0.05),3组BALP和TRAP-56比较差异均无统计学意义(P>0.05)。
结论雄性激素受体抑制剂可以治疗及缓解前列腺癌症状,但同时可引起患者骨质疏松的不良反应,应合理适量使用。
【总页数】2页(P80-81)【作者】杨政兴;陈忠铭;刘美宝;陈夏韧【作者单位】厦门大学附属福州第二医院【正文语种】中文【中图分类】R973.2【相关文献】1.雄激素对大鼠胎颅盖骨成骨细胞雌激素受体基因表达的影响2.雄激素受体在大鼠睾丸发育过程中的表达及雄激素对其表达的调节作用3.雄性受体大鼠同种肾移植慢性排斥反应中性激素、性别、雄激素受体拮抗剂的作用4.雄性大鼠成骨细胞内雄激素受体表达对骨代谢的影响因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
维生素E治疗对老年雌性大鼠骨量、骨代谢以及自噬水平影响
212中国骨质疏松杂志2021年2月第27卷第2期Chin J Osteoporos,February2021,Vol27,No.2 Published online doi：10.3969/j.issn.1006-7108.2021.02.010维生素E治疗对老年雌性大鼠骨量、骨代谢以及自噬水平影响杨海超*黄炜韩晓东唐山市工人医院，河北唐山063000中图分类号：R681文献标识码：A文章编号：1006-7108(2021)02-0212-05摘要：目的观察维生素E对老年雌性大鼠骨量、骨代谢作用及自噬水平的影响。
方法10只年轻雌性大鼠和20只老年雌性Sprague-Dawley大鼠被随机分为三组:对照组(10只年轻大鼠)、模型组(10只老年大鼠)和治疗组(10只老年大鼠)。
在实验过程中，治疗组接受维生素E治疗。
治疗12周后，通过Micro-CT和HE切片染色检测大鼠股骨骨密度(bone mineral density,BMD)和骨微结构变化;使用ELISA试剂盒检测血清中骨转换标志物水平的改变;通过蛋白质印迹检测维生素E对骨细胞自噬蛋白的影响。
结果Micro-CT检测和HE切片染色表明维生素E治疗可以改善老年大鼠股骨干骺端骨密度和骨小梁微观以及微观参数［骨体积/总体积(BV/TV)，骨小梁厚度(Tb.Th)，骨小梁数(Tb.N)和骨小梁分离度(Tb.Sp)］。
和模型组比较，治疗组骨吸收指标抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)水平明显降低，骨形成指标骨钙素(OC)水平明显增加；自噬相关蛋白LC3-H/LC3-I、Beclin1和Atg5的蛋白质表达更高,p62表达显著降低；比较差异有统计学意义(P<0.05)。
结论维生素E能够通过提高自噬水平和改善骨转换来保护老年雌性大鼠的骨量。
关键词：自噬;骨转换;老年雌性大鼠;维生素EEffects of Vitamin E treatment on bone mass,bone metabolism and autophagy in aged female ratsYANG Haichao*,HUANG Wei,HAN XiaodongTangshan Workers Hospital,Tangshan063000*Corresponding author:YANG Haichao,Email:3384604245@Abstract:Objective To observe the effects of vitamin E on bone mass and bone metabolism and the effect on the autophagy in aged female rats.Methods Ten young rats and twenty old female Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups:a control group(10young rats),a model group(10old rats),and a treatment group(10old rats),10in each group.During the experiment,the treatment group received vitamin E treatment.After12weeks of treatment,BMD and bone microstructure changes in femurs of rats were detected by Micro-CT detection and HE section staining；ELISA kits were used to detect changes in the levels of bone turnover markers in serum；and the effect of vitamin E on autophagy proteins in bone cells was detected by Western blot. Results Micro-CT detection and HE section staining showed that vitamin E treatment could improve the bone mineral density and trabecular bone microscopic parameters in the femoral metaphysis of aged rats.Serological result showed that the level of anti-tartrate acid phosphatase5b(TRACP-5b),a bone resorption indicator,was significantly reduced,and osteocalcin(OC),a bone formation indicator,was significantly increased.At the same time,the protein expression of autophagy-related proteins LC3-H/LC3-I, Beclin1and Atg5was higher,and p62expression was significantly reduced(P<0.05).Conclusion Vitamin E protects bone mass in elderly female rats by increasing autophagy levels and improving bone turnover.Key words:autophagy；bone turnover；aged female rats；vitamin E老年骨质疏松症的发病率随着世界人口的老龄率、与死亡风险增加密切相关［1］,老年骨质疏松性化而逐渐增加。
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预期应用 ELISA 法定量测定大鼠血清,血浆或其它相关液体中 TRACP-5b 含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中 TRACP-5b 水平。用纯化的抗体包被 微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入 TRACP-5b、生物素化的抗大鼠 TRACP-5b 抗体、HRP 标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物 TRACP-5b 显色。TRACP-5b 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品 中的 TRACP-5b 呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。 试剂盒组成 1. 酶联板：一块（96 孔） 2. 标准品（冻干品）：2 瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至 1ml，盖好后静置 10 分钟以上 ， 然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为 20 U/L，做系列倍比稀释后，分别稀释成 20 U/L，10 U/L，5 U/L ，2.5 U/L，1.2 U/L，0.6 U/L，0.3 U/L，其原液直接作为最高标准浓度，样品稀 释液直接作为标准浓度 0 U/L，临用前 15 分钟内配制。 如配制 10 U/L 标准品：取 0.5ml 20 U/L 的上述标准品加入含有 0.5ml 样品稀释液的 Eppendorf 管中，混匀即可，其余浓度以此类推。 3. 样品稀释液：1×20ml/瓶。 4. 检测稀释液 A：1×10ml/瓶。 5. 检测稀释液 B：1×10ml/瓶。 6. 检测溶液 A：1×120ul/瓶（1：100）临用前以抗体稀释液 A1：100 稀释。 7. 检测溶液 B：1×120ul/瓶（1：100）临用前以抗体稀释液 B1：100 稀释。 8. 底物溶液：1×10ml/瓶。 9. 浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释 25 倍。 10. 终止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 标本的采集及保存 1．血清：标本请于室温放置 2 小时或 4℃过夜后于 1000 x g 离心 20 分钟，取上清即可检测 ， 或将标本放于 -20℃保存，但应避免反复 冻融。 2．血浆：可用 EDTA 或肝素作为抗凝剂，标本采集后 30 分钟内于 2 - 8° C 1000 x g 离心 15 分钟，或将标本放于 -20℃保存，但应避免反复 冻融。 注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。 3. 组织匀浆: 将动物的组织标本先用 PBS 洗涤,去除多余血液,匀浆化后放在 20mlPBS 中于20° C 放置过夜,第二天,经过二次反复冻融破膜,将匀浆物 5000x g 离心 5 分钟,取上清即可检 测。 操作步骤 各试剂在使用前平衡至室温。 1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外，余孔分别加标准溶液或待测样 品 100ul，轻轻混匀，37℃，120 分钟。 2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。 3. 每孔加检测溶液 A 工作液 100ul，37℃,60 分钟。洗板 3 次，350ul/每孔，甩干。 4. 每孔加检测溶液 B 工作液 100ul，37℃，60 分钟，洗板 5 次，甩干。 5. 依序每孔加底物溶液 90ul，37℃避光显色 30 分钟。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。 特异性
本试剂盒可同时检测重组或天然的大鼠 TRACP-5b，且与其它相关蛋白无交叉反应。 计算
以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD 值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上 绘出标准曲线，根据样品的 OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准 物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出 样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 注意事项 1． 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。 2． 一次加样时间最好控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 3． 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。 4． 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。 5．在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。 6．底物请避光保存。 检测范围：
6. 依序每孔加终止溶液 50ul，终止反应。用酶联仪在 450nm 波长依序测量各孔的光密度（OD 值 ）。 注： 1． 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及 2NH2SO4。 测量时先用此孔调 OD 值至零。 2．为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。 洗板方法 手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层 吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少 0.4ml 注入孔内，浸泡 1-2 分钟 ， 根据需要，重复此过程数次。
0.3 U/L -20 U/L 说明 1. 在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染， 试剂避免受到微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。 2. 小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度。请注意在吸取标本 / 标准品，酶结合 物或底物时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的 “预孵 育”时间，从而明显地影响到测量值的 准确性及 重复性。而且，洗涤不充分将影响试验结果 。 3. 试剂盒保存：部分试剂保存于-20℃，部分试剂保存于 2-8℃，具体以标签上的标示为准。 4. 浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。 5. 刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任 何影响。 6. 中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。 7. 所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。 8. 有效期：6 个月