高效液相色谱速率理论
高效液相色谱实验报告
高效液相色谱实验报告高效液相色谱法，基本原理为影响柱效的主要因素是涡流扩散和传质阻抗。
分为液固吸附色谱法，流动相为液体，固定相是固体吸附剂；液分配色谱法，固定相几乎全是化学键合硅胶，又称化学键合相色谱法等。
（二）塔板理论：塔板理论方程式（高斯方程式）：理论塔板式数：理论塔板高度：（三）速率理论： h=a+b/u+cu影响塔板高度的因素：1、涡流扩散 2、纵向扩散 3、传质阻抗二、气相色谱仪：（1）色谱柱：固定相与柱管组成。
填充柱、毛细管柱；分配柱、吸附柱（2）紧固液：低沸点的液体，操作方式下为液态。
甲基硅油、聚乙二醇等选择原则：按相似性、按主要差别、按麦氏差别选择。
（3）载体：化学惰性的多孔性微粒（4）毛细管色谱柱：开管型、填充型（5）检测器：1、浓度型检测器：热导检测器和电子捕捉检测器2、质量型检测器：氢焰离子化检测器中国药典对气相色谱规定：除检测器种类、紧固液品种及特定选定的色谱柱材料严禁任一修改外，其他均可适度发生改变，色谱图于30min内记录完。
第四节高效液相色谱法1、基本原理：影响柱效的主要因素就是涡流蔓延和传质电阻。
分类：1、液固吸附色谱法：流动相为液体，固定相是固体吸附剂。
2、液——液分配色谱法：紧固二者几乎全系列就是化学键再分硅胶，又称化学键再分相色谱法。
按固定相和流动相的极性2又分：正相色谱法和反相色谱法正相色谱法：流动二者极性大于紧固二者极性的色谱法。
用作拆分溶有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质，用作所含相同官能团物质的拆分。
极性强组分先流入反相色谱法：……………大于……………………… 用于分离非极性至中等极性的分子型化合物2、高效率液相色谱仪：1、高压输液泵2、色谱柱3、进样阀4、检测器：紫外稀释检测器、荧光检测器、热法折光检测器、电化学检测中国药典对高效液相色谱法规定：除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意更改外，其余均可适当改变，色谱图于20min内记录完毕。
第五节色谱系统适用性试验和定量分析方法一、系统适用性试验1、色谱柱的理论板数：2、分离度：应大于1.53、重复性3、拖尾声因子：0.95-1.05之间二、定量测定法：1、内标法加较正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量2、外标法测量供试品中某个杂质或主成分含量3、加较正因子的主成分自身对照法不加较正因子的主成分自身对照法。
20-高效液相色谱
5. 离子色谱
其分离原理与离子交换色谱原理一样， 电导检测器检测。 问题：由于流动相都是强电解质，其电导率比 待测离子约高 2 个数量级，这种强背景电导会完
全掩盖待测离子信号。
1975年Small提出，在离子交换柱之后，再串结一根
抑制柱。该柱装填与分离柱电荷完全相反的离子交 换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具 有高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相， 从而可用电导检测器检测各种离子的含量。
在反相色谱法中，通过调节流动相的pH，抑制样品组 分的解离，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离 有机弱酸、弱碱的目的，称为离子抑制色谱法（ISC）
（1）适用范围 弱酸 3.0≤pKa≤ 7.0 弱碱 7.0≤pKa≤ 8.0
（2）抑制剂 弱酸（乙酸）、弱碱（氨水）或缓冲盐 （3）影响k的因素 a．与流动相的极性有关（同反相色谱） b．与流动相pH有关：弱酸 pH≤pKa k↑， tR↑ 弱碱 反之
由苯乙烯与二乙烯苯交联而成
21
20.4.2 化学键合相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； 一般的键合相用硅胶为载体： a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C (ODS）
1. 非极性键合相 键合相表面基团为非极性烃基， 如C18 、C8、 C1 和苯基等。一般用于反相色谱
33
选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）使用前需要用微孔滤膜过滤，除去固体颗粒。
（3）流动相使用前最好脱气。
34
20.6 高效液相色谱仪
35
记录系统
输液系统
高效液相色谱法
第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。
具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。
HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）是最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。
经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。
它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。
HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。
液相色谱速率理论方程式
液相色谱速率理论方程式1、流动相的要求：高效液相级色谱醇，二次蒸馏水，缓冲盐肯定要过滤；流动相脱气至关紧要（可采纳抽滤，超声波脱气等方法）2、吸滤头：特别情况下可拆下滤头抽取以判定其中是否堵塞；亦可用注射器吸取流动相通过吸滤头打出以判定其是否堵塞。
若有堵塞情况可用异丙醇超声波清洗；清洗不成功则需要更换。
3、单向阀：如碰到泵压不稳或流动相不能抽取，则可能是单向阀显现问题，卸下用异丙醇超声波清洗，清洗时须按其安装的方向放置在小烧杯中，切记不可与安装方向倒置超洗！4、泵头：泵头漏液或显现其它故障一般要申请维护和修理（如漏液，或更换柱塞杆及其密封垫等）5、过滤器：当色谱峰显现异常情况时，有可能是此部件被污染，拆下用异丙醇超洗或更换过滤垫片。
6、排液阀：此处不能完全密封或漏液时一般是其中的垫片污染或磨损，可卸下后取出其垫片用异丙醇超声波清洗或更换垫圈。
7、手动进样器：平常应注意用二次蒸馏水和甲醇在装载状态及进样分析状态清洗；如显现漏液现象，原因极可能为转子密封垫磨损或污染，一般须申请维护和修理或更换配件。
8、流通池：在色谱峰不正常时会可能是此部件补污染。
可拆卸后取出其中的垫片用异丙醇超洗（可依据说明书进行操作或申请维护和修理）。
9、工作站：显现死机可重起计算机；不正常运行时，首先可更换电脑测试其硬件故障；或在本机上重新插拔接口、重新安装软件。
液相色谱速率理论方程式在范第姆特方程模型基础上，依据液相色谱的特点作了某些修正，得到如下几种液相色谱速率理论方程式。
1、高效液相色谱速率理论方程式：其中涡流扩散项：分子扩散项：传质阻力项：其中包含：称为流动的流动相中传质阻力系数，称为滞留的流动相中的传质阻力系数，称为固定相中的传质阻力系数。
高效液相色谱速率理论方程认真表达式：式中，dp——色谱柱填料平均粒径；df——固定相有效液膜厚度；U——流动相平均流速；Dm——组分分子在流动相中的扩散系数；Ds——组分分子在固定相中的扩散系数；wm——由色谱柱和填充的性质所决议的系数；ws——与容量因子k有关的系数；wsm——与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数以及容量因子k有关的系数。
液相色谱速率理论方程式
液相色谱速率理论方程式液相色谱技术在分析化学领域广泛应用，它可以对分子间的相互作用进行分离和分析。
液相色谱在某些情况下可以获得比气相色谱更好的分离性能，它对于有机药物、天然产品、杂质和特定化合物的分析具有重要的应用价值。
在液相色谱技术中，速率方程是评估和优化分离的一个基本工具。
运动相中物质在离子交换、分配等作用下在固定相上分离的速率过程与化学反应通常是非常不同的，它们是一种不可逆的动态平衡状态。
液相色谱速率方程式可以用来描述某一个分离过程的运动特性，并根据这些运动特性和物理化学性质推导出一些数学方程来评估和优化分离过程。
液相色谱速率方程的特点是实验条件千差万别，影响因素很多，因此需要大量的实验数据和统计方法。
液相色谱分离的速度由固定相和流动相的物理化学特性共同决定。
在理论上，液相色谱分离的速度可以用一些数学公式计算，其中比较著名的有康托尔方程、范德沙方程、克罗默方程等。
康托尔方程是最早提出的液相色谱速率方程，它假设液相色谱分离过程是在局部热力学平衡状态下进行的。
康托尔方程可以用来评估物质在液相色谱柱中的速度和列效率。
康托尔方程参数的确定是通过实验来完成的，它包括相对体积、局部网架的功率函数、分离因子和颗粒尺寸等。
康托尔方程的主要缺陷是它不能估计非理想的杂质分离效应，以及在非平衡情况下的分离效果。
范德沙方程则超越了康托尔方程的限制，它用形式更加系统的方法来描述了液相色谱分离。
范德沙方程假设液相色谱分离过程是一种多段过程，每一个单元都有一定规律的质量传递速度。
范德沙方程可以处理各种白噪声和杂质分离问题，但它也存在着一些缺陷，如计算过程过于复杂，对复杂液相色谱分离的描述存在不足等。
克罗默方程则将范德沙方程进行了优化，它是目前使用最多的液相色谱速率方程。
克罗默方程是从范德沙方程发展而来的，它将范德沙方程的一些难以处理的部分进行了线性化简化。
克罗默方程能够准确地描述各种液相色谱分离現象，有效地解决了液相色谱分离过程中存在的问题。
第4节 速率理论 -2
对固定液的要求 1. 粘度要低，以便减小DL 粘度要低，以便减小 2. 固定液含量要适当低
C = Cl + Cg Cl = Cg = 8
π
2
⋅
k
(1 + f2 ⋅ DL
0.01k
(1 + k )
⋅
d p2 DG
丁黎
中国药科大学色谱分析课程
色谱柱尺寸
对柱径的要求 柱内径要小 0.1 ~ 0.3 mm
丁黎 中国药科大学色谱分析课程
固定相颗粒直径减 小，曲线斜率大大 降低，这样可在较 降低， 高的流动相线速度 下，保持较高的柱 达高效高速。 效，达高效高速。
丁黎
中国药科大学色谱分析课程
超高液相色谱（ 超高液相色谱（UPLC） ）
• 超高液相色谱仪（ultra-performance liquid 超高液相色谱仪（ chromatography,UPLC）是Waters公司21世 公司21 ） 公司21世 纪初推出的产品（ 纪初推出的产品（ACQUITY UPLCTM）。 特点 采用1.7µm的填料的色谱柱，使板高－流 的填料的色谱柱， 采用 的填料的色谱柱 使板高－ 速曲线接近于平行于横轴的直线，使最佳 速曲线接近于平行于横轴的直线， 柱效范围更宽。 柱效范围更宽。 固定相的粒径小，柱阻大， 固定相的粒径小，柱阻大，需用超高压泵 输送流动相。 输送流动相。
H e = A = 2λ d p
dp：填料（固定相）颗粒的平均直径。 填料（固定相）颗粒的平均直径。 dp ↑ → A ↑，n↓，峰展宽 ， ， λ：填充不均匀因子。与色谱柱中载体颗粒大小及 ：填充不均匀因子。 分布、填充均匀情况有关。 分布、填充均匀情况有关。 填充不均匀 →λ↑ → A ↑，n↓，峰展宽 ， ，
高效液相色谱法
4. 区域宽度
衡量色谱峰宽度的参数，三种
表示方法： （ 1 ）标准偏差 ( ) ：即 0.607 倍峰 高处色谱峰宽度的一半。 （2）半峰宽(Y1/2)：色谱峰高一半 处的宽度 Y1/2 =2.354 。 （3）峰底宽(Wb)：Wb=4 。
2. 相平衡参数
（1）分配系数（ partition coefficient） K 组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、
流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”
气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为
液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作
用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争， 即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。
操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
试样一定时，K主要取决于固定相性质；
每个组份在各种固定相上的分配系数K不同； 选择适宜的固定相可改善分离效果； 试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础； 某组分的K = 0时，即不被固定相保留，最先流出。
3.分配比 （partition radio）k
一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比。
2. 按孔隙深度分
• 表面多孔型：以实心玻璃珠为基体，在基体表面 覆盖一层多孔活性材料(如 硅胶、氧化铝、离子交 换剂、分子筛、聚酰胺等)。表面多孔型固定相的 颗粒大(易装柱)、多孔层厚度小且孔浅(渗透性好， 出峰快)；但交换容量小。适于常规分离分析。 • 全多孔型：全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成， 因颗粒极细，因而孔径小、传质快、 柱效高。特 别适于复杂混合物的分离。
（2）用体积表示的保 留值
保留体积（VR）： VR = tR×qv qv为柱出口处的载气流量， 单位：m L / min。 死体积（VM）： VM = tM ×qv
高效液相色谱法教学【全】精选全文
例: 流动相极性变化对组分k’的影响
②更换色谱柱（改变N）
措施： a.选择长柱子(N=L/H) b.填料颗粒尽量小 c.低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小) d.低的溶剂粘度(提高柱效)
高效液相色谱法
High Performance Liquid
Chromatography （HPLC）
前言:
HPLC是70年代以后发展最 快的一个分析化学分支，现 已成为生化、医学、药物、 化学化工、食品卫生、环保 检测等领域最常用的分离分 析手段。
我国：
开始仅为少数研究实验室拥有， 现很多的生产、研究、质检部门都拥有。 广泛应用于： 质量控制、分析化验、制备分离。 讲课目的：入门 教材：《实用色谱法》（詹益兴 编著） 学习要求：记好笔记，
ⅰ大分子，扩散系数小 ⅱ小分子，扩散系数大
5. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液
相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略 不计，即 H = A + C u
• 降低传质阻力是提高 柱效主要途径。 •气相和液相Ｈ－ｕ区别
§１－４ 分离度 (Rs)
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
混合物最有效的分离、分析方法。 是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在 固液两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体，称为流动相。
液相色谱仪
高效液相色谱仪流程图
(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;
(2) 扩散导致色谱峰变宽，H↑(Ｎ↓)，分离变差; (3) B/u与流速有关：流速↓→ 滞留时间↑→ 扩散↑
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
高效液相色谱速率理论
1956年荷兰学者van Deemter 等在研究气液色谱时，提出了色谱过程动力学理论— 速率理论。
他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。
该理论模型对气相、液相色谱都适用。
式中：u 为流动相的线速度； A ， B ， C 为常数，分别代表
涡流扩散项、分子扩散系数、传质阻力系数。
该式从动力学角度很好地解释了影响板高（柱效）的各种因素！ 任何减少方程右边三项数值的方法，都可降低 H ，从而提高柱效。
1、涡流扩散项A
在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“ 涡 流” 的 流动，故称涡流扩散。
Cu u
B A H ++=
从图中可见，因填充物颗粒大小及填充的不均匀性，同一组分运行路线长短不同，流出时间不同，峰形展宽。
A ＝2 λdp
dp：填充物平均颗粒的直径 ;
λ：填充不均匀性因子
展宽程度以A表示
固定相颗粒越小 ( dp↓) ，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。
则由涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。
对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即A=0。
2、分子扩散项B /u（纵向扩散项）
纵向扩散是由浓度梯度造成的。
组分从柱口加入，其浓度分布的构型呈“塞子”状，如图所示。
它随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，“塞子”必然自发地向前和向后扩散，造成谱带展宽。
分子扩散项系数为： B=2γD g
B：分子扩散项系数
γ：阻碍因子（扩散阻止系数） , 因载体填充在柱内而引起气体扩散路径弯曲的因素 - 弯曲因子
D ：组分在流动相中扩散系数
3、传质阻力项C u
由于气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，它们的传质过程不完全相同，现分别讨论之。
（l）对于气液色谱，传质阻力系数C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数Cl两项，即：
C＝Cg＋Cl
气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程。
这一过程中试样组分将在两相间进行质量交换，即进行浓度分配。
有的分子还来不及进入两相界面，就被气相带走；有的则进人两相界面又来不及返回气相。
这样，使得试样在两相界面上
不能瞬间达到分配平衡，引起滞后现象，从而使色谱峰变宽。
对于填充柱，气相传质阻力系数Cg 为：
式中k 为容量因子。
由上式看出，气相传质阻力与填充物粒度则的平方成正比、与组分在载气流中的扩散系数见成反比。
因此，采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体（如氢气）做载气，可他Cg 减小，提高柱效。
液相传质阻力系数C1为：
由上式看出，固定相的液膜厚度df 薄，组分在液相的扩散系数D1大，则液相传质阻力就小。
降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但k 值随之变小，又会使C1增大。
当固定液含量一定时，液膜厚度随载体的比表面积增加而降低，因此，一般采用比表面积较大的载体来降低液膜厚度，但比表面太大，由于吸附造成拖尾峰，也不利分离。
虽然提高柱温可增大Dl ，但会使k 值减小，为了保持适当的Cl 值，应控制适宜的柱温。
g p g d k k C 2
2
2)1(01.0∙+=g p g D d k k C 222)1(01.0∙+=l
f l D d k k C 22)1(32∙+∙=l f l D d k k C 22)1(32∙+∙=
将上面式总结，即可得气液色谱速率板高方程 。
气液色谱速率板高方程 :
这一方程对选择色谱分离条件具有实际指导意义，它指出了色谱柱填充的均匀程度，填料颗粒的大小，流动相的种类及流速，固定相的液膜厚度等对柱效的影响。
（2）对于液液分配色谱，传质阻力系数（C ）包含流动相传质阻力系数（Cm ）和固定相传质系数（Cs ），即：
C ＝Cm ＋Cs
其中Cm 又包含流动的流动相中的传质阻力和滞留的流动相中的传质阻力，即：
式中右边第一项为流动的流动相中的传质阻力。
当流动相流过色谱柱内的填充物时，靠近填充物颗粒的流动相流速比在流路中间的稍慢一些，故柱内流动相的流速是不均匀. ωm 是由柱和填充的性质决定的因子。
ωsm 是一常数，它与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数及容量因子有关。
u D k kd D d k k u D d H l f
g p g p ])1(32)1(01.0[2222222++∙+++=γλm
p sm m p
m m D d D d C 22ωω+=m p sm m p m m D d D d C 22ωω+=
液液色谱中固定相传质阻力系数（Cs ）可用下式表示：
液液色谱的 Van Deemter 方程式可表达为：
该式与气液色谱速率方程的形式基本一致，主要区别在液液色谱中纵向扩散项可忽略不计，影响柱效的主要因素是传质阻力项。
速率理论的要点
(1) 组分分子在柱内运行的 多路径与涡流扩散 、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到平衡等因素是造成色谱峰扩展、柱效下降的主要原因。
(2) 通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。
(3) 速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。
阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。
(4) 各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；s
f s s D d C 2ω=u D d D d D d u D d H s f s m p sm m p m m p )(22222ωωγλ+∙++=u D d D d D d u D d H s f s m p sm m p m m p )(22222ωωωγλ+∙++=
柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。