生物技术制药(第三版,夏焕章)复习重点

1.绪论1.1首次代表性药物——第一个动物疫苗药（美—基因工程药—DNA重组技术生产—1982欧洲被批用）：重组人胰岛素1.2（名词解释1）生物技术药物：采用DNA重组技术/其他生物新技术研制的蛋白质/核酸药物。

（包括——细胞因子、重组蛋白质药物、抗体、疫苗、寡苷酸药物…….）生物技术制药：以生物体、组织、细胞等为原料，利用物理、化学、生物化学、生物技术、微生物学、药学等科学的原理和方法进行药物制造的技术。

生物技术制药特性/特点：高技术、高投入、长周期、高风险、高收益2.基因工程制药2.1基因工程技术的优点：①大量生产，为临床使用建立有效的保障。

②提供足够数量的生理活性物质③挖掘更多内源生理活性物质④获得新型化合物，扩大药物筛选来源2.2什么叫基因工程药（技术）？将目的基因插入载体、拼接、转入新宿主细胞，构建工程菌/细胞，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。

基因工程：将外源基因经体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。

2.3工作流程上游——（实验室）——分离目的基因，构建工程菌/细胞下游——（实验室产品产业化）——（大规模培养）产品分离纯化，质量控制等2.4目的基因获得——反转录法（制取真核生物目的基因常用方法）①mRNA纯化——得到目的基因的mRNA特点：真核细胞中mRNA的3’端常含有一多聚腺苷酸polyA②cDNA第一链合成模板：蛋白质真核细胞的mRNA；反转录酶作用下，合成互补的DNA③cDNA第二链合成模板：cDNA（只反映基因表达转录及加工后产物携带信息—只与基因编码序列相关，不含内含子）反转录酶/DNA聚合酶1/Klenow酶大片段作用下，最终合成双链DNA序列得蛋白质多肽的DNA序列④cDNA克隆载体：质粒DNA/噬菌体DNA连接方法：加同聚尾；加人工接头⑤重组体导入宿主细胞⑥cDNA文库鉴定——表型筛选⑦目的cDNA克隆的分离与鉴定方法：核酸探针杂交法；免疫反应鉴定法2.5基因表达①常用宿主菌细胞及优缺点（目前最常用——大肠杆菌、酿酒酵母）1）原核细胞（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉素-可糖基化）P222）真核细胞（酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞）优点：可糖基化缺点：合成复杂②宿主菌的要求1）具有高浓度、高产量、高产率2）能利用廉价原料而得3）不致病、不产生内毒素4）发热量低、需氧低，适当发酵温度和细胞形态（培养条件温和）5）易代谢调控、易进行重组DNA技术6）产物易提取纯化③影响基因在大肠杆菌中表达的因素：1）表达质粒的拷贝数和稳定性（一定范围内，表达和拷贝数成正比；载体越小，稳定性越好）2）外源基因的表达效率3）表达产物的稳定性4）细胞代谢负荷5）工程菌的培养条件2.6（名词解释2）基因工程的不稳定性：传代过程中出现的质粒不稳定现象，质粒不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定，（稳定性至少维持25代），分裂不稳定指工程菌分裂时出现一定比例的不含质粒的子代菌现象（整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸）；结构不稳定指DNA从质粒上丢失/碱基重排、缺失所致工程菌性能改变（导致其表观生物学功能丧失）。

2.7基因工程药的分离纯化***分离纯化一般不超过4~5个步骤步骤：1）细胞破碎——方法：物理破碎；化学破碎；生物破碎2）固液分离——方法：离心；膜过滤；双水相萃取3）浓缩与初步分离4）高度纯化直至得到纯品分离纯化主要依赖于色谱/层析分离方法层析法（定义+原理P48）：①离子交换层析：以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂平衡离子进行可逆交换时，结合力大小的差别而进行分离的层析方法。

——电荷不同，离子强度——分辨率高，容量大，易操作②疏水层系：利用蛋白质表面的疏水区与固定相上疏水性基团相互作用力的差异，对蛋白质组分进行分离的层析方法。

——疏水性③亲和层系：利用固定化配体与目的蛋白质之间非常特异的生物亲和力进行吸附，这种结合既是特异的，也是可逆的，改变条件可以解除结合。

——特异性亲和性，生物分子专一性④凝胶过滤层析（凝胶排组层析/分子筛层析）：以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小对溶液中各组分进行分离的液相层析方法。

——相对分子质量（分子大小）5）加工成品2.8西药Eg干扰素干扰素IFN制备流程：发酵——产物提取与纯化（干扰素合成——工程菌组建，切之前，获得目的cDNA）干扰素：机体免疫细胞产生的一类细胞因子。

是机体受到病毒感染时，免疫细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。

（目前最主要的抗病毒感染和抗肿瘤生物制品）（侯云德——中国干扰素之父）3.动物细胞工程制药3.1（名词解释3）细胞工程：以细胞为单位，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术，有目的地设计和操作，进行细胞水平上遗传操作及大规模细胞和组织培养。

（使细胞某种遗传特性发生改变，从而达到改良或生产新产品的目的，及使细胞增加或重新获得某种特定产物的能力，从而在离体条件下进行大量培养、增殖，并提取对人类有用的产品。

）（1907-Harrison-动物细胞培养开始标志；1911-Carrel-首次无菌技术引入细胞培养；1950-Earle等-建立Hela等多种细胞系细胞制药：动物-人活性因子、疫苗、单克隆抗体等；植物-人活性因子、疫苗、经济价值高的植物有效成分等）3.2动物细胞的生理特征***①细胞分裂周期长（12~48h）②细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象（癌细胞没有）接触抑制现象（密度依赖抑制现象）：当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片，即每个细胞与其周围细胞相互接触时，细胞停止增殖，而此时若保持充足的营养物质，细胞仍可存活一段时间，但密度不会增加。

③正常二倍体细胞的生长寿命有限原代培养：细胞离体培养开始（成年人成纤维细胞—50代；鸡胚—30代；小鼠—8代；异倍体—无限）④动物细胞对周围环境十分敏感（无细胞壁保护）⑤动物细胞对培养基要求高（>12必需氨基酸+>8维生素+多种无机盐+微量元素）⑥动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同原核生物由于缺少糙面内质网，无法对蛋白质进行糖基化和其他一系列的翻译后修饰。

3.3生产用的动物细胞（二倍体）①原代细胞（鸡胚）：直接取自动物细胞、器官，经粉碎、消化而获细胞悬液。

（费钱费力）②二倍体细胞系概念：原代细胞经传代、筛选、克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。

特点：1）染色体组型仍是2n的核型2）具有明显的贴壁细胞依赖和接触抑制的特性3）有限增殖，一般可连续培养50代4）无致瘤性③转化细胞系通过某个转化过程形成，常由染色体断裂变成异倍体，从而失去正常细胞的特点，获得无限增殖的能力。

（自发/人为而得）1）Vero细胞：1962-日本大学-正常成年非洲绿猴肾-贴壁依赖的成纤维细胞2）BHK-21细胞：1961-英国大学-5只无性别生长1天幼鼠肾3）Namalwa细胞-1972-S-肯尼亚Burkitt淋巴瘤患者取出-瑞典K研究所建成的一株人的类淋巴细胞④工程细胞系1）融合细胞系（细胞融合：两个及以上的细胞合并成一个细胞的过程）2）重组工程细胞系3.4动物细胞培养的环境条件1）设备2）无菌操作3）温度——37±0.5℃4）溶解氧5）co2——PH（培养基:水质-无热原质；PH-7.2~7.4；渗透压）3.5培养基加血清（常用5%~10%胎牛血清）的原因1）提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和激素2）提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子3）提供可识别金属、激素、维生素、脂质的结合蛋白4）提供细胞生长所需要脂肪酸和微量元素5）提供良好PH缓冲系统3.6大规模细胞培养技术①悬浮培养优势：1）无需胰酶消化，没有化学、机械损伤2）培养条件均一传代、制备简单，易操作，成本低3）回收率高，及时监测细胞在反应器内的生长情况4）培养规模易被放大5）传质、传氧较好缺点：由于细胞体积较小，难采用灌流培养②贴壁培养优势：1）容易更换培养液，进行灌流培养，提高单位体积内的细胞密度2）适用细胞较广缺点：1）操作复杂2）培养条件不均一3）传质、传氧较差4）不能有效监测细胞生长5）需要合适贴附材料和足够的面积③贴壁-悬浮培养1）（名词解释4）微载体培养：利用贴壁细胞能够贴附于带适量正电荷的微载体表面生长的特性，将细胞和微载体共同悬浮于培养容器中，使细胞在微载体上附着生长的细胞培养方法。

优势：极大增大供细胞贴附的比表面积；单位体积培养液产率增加2）巨载体培养——大规模细胞培养的操作方式①批式操作（早期，最常用）：将细胞种子液无菌接入生物反应容器中进行培养，在培养过程中不进行营养物的流加，随细胞生长变化产物不断累积，最后一次性收获细胞、产物及培养液。

优势：操作简单，易于控制，培养周期短，污染风险低缺点：产量低（不能使细胞一直处于最优条件）②流加式操作：批式操作的基础上，初始流入一定量培养液至反应反应器内，在培养过程中随细胞对营养物质消耗，流加浓缩营养物质或培养基，从而使细胞持续生长至较高密度，整个过程没有流出或回收，在细胞进入衰退期或衰退后进行终止回收整个反应体系，分离细胞和细胞碎片，浓缩和纯化目标蛋白。

（整过程反应体积变化的）特点：可避免某种营养成分的初始浓度高，而产生的底物浓度底物抑制现象——逐步加培养基；防止某种限制营养成分在培养过程中被耗尽。

③灌流式操作：细胞增长过程中，不断补充新鲜培养基，同时采用细胞节流装置以相同流速不断流出培养基，生物反应器内细胞密度较高，产物回收率较高。

（不断加，不断取出）优势：极大提高细胞密度缺点：消耗大量培养基；成本利用率低；周期长，污染概率高3.7重组人促红细胞生成素EPO为什么不在人体内培养？P111（EPO是由165个氨基酸组成的高糖基化蛋白质，去唾液酸/糖基化不影响其体外活性，但缩短体内半衰期，使其丧失体内活性——说明糖基化对生物活性的重要性。

因此，基因工程的EPO不能利用其原核表达系统，只能利用哺乳动物细胞表达系统生产——如：CHO细胞）4.抗体（抗体Ab：是抗原刺激机体的免疫系统后，由B淋巴细胞系的终末分化细胞-浆细胞产生、可与抗原特异性结合的免疫球蛋白。

）4.1基因工程抗体：利用DNA重组技术，在基因水平上对抗体分子进行切割拼接，甚至人工全合成基因，与适当载体重组后导入表达系统的抗体。

【包括：嵌合抗体-1993-巴利昔单抗、人源化抗体-1997-达利珠单抗、全人源抗体-2002-阿达木单抗、小分子抗体（单链抗体、单域抗体）】4.2人源化抗体：泛指人经基因工程技术，对已有的异源抗体进行改造，植入一定比例的人抗成分得到的基因工程抗体。

（解决异源抗体进入人体后引发的排斥反应。