兔骨髓间充质干细胞的分离

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兔骨髓间充质干细胞的分离、体外培养、鉴定和体外标记

ｆＮａｃａｇＵｎｖｒｉ，ｎｈｎ３０６ＤｅａｔｎｆＰｔｏｈｓｏｏｙｉａｆｉｅｓｉｏｎｈｎｉｅｓｙＮａｅａｇ３００；ｌａｔｐｒｍｅｔｏａｈｐｙｉｌｇ，ＭｅｉａｏｌｇｆＮａｃａｇｄｃｌＣｌｅｏｎｈｎｅ
Ｕｎｖｒｉ；ｒｎｔｕｅｔｅＦｒｔｆｌｔｄＨｏｐｔｌｆＮａｃａｇＵｎｖｒｉ）ｉｅｔＢｕｎＩｓｔｔ，ｈｉｉｉｅｓｉｎｈｎｉｅｓｔｓｙｉｓＡｆａａｏｙ【ｓｒｃ】ＯｂｅｔｅＴｘｌｒｔｏｆｉｌｔｎｕｆａｉｎａｄｃｌｒｆｂｎｌｏｄｒｅｓｎｈｍａｔｍＡｂｔａｔｊｃｉ：ｏｅｐｏｅａｍｅｈｄｏｏａｉ，ｐｒｃｔｎｕｔｅｏｏｅｍａＴｗ— ｅｖｄｍｅｅｃｙｌｓｅｖｓｏｉｉｏｕｉ
ＭＣ表面抗原进行鉴定，明所培养的细胞为ＭＳｓ采用５溴脱氧尿嘧啶核苷ｆ一ｒｍ一一ｅｘｕｉｎ，ｒＵ体外标Ｓｓ证Ｃ。一５Ｂｏｏ２ｄｏｙｒｉｅＢｄ）ｄ记兔ＭＣ，测其标记阳性率。果：骨髓培养法培养的原代ＭＳｓＳ８检结全Ｃ接种４天后可以被观察到，形态均匀成梭形，长生
增殖迅速，合ＭＳｓ长的特性，～Ｃ融合接近８％，符Ｃ生７８ｄＭＳｓ０传代培养生长良好。Ｃ生长曲线呈Ｓ型，ＭＳｓ由生长曲线分析可知，Ｃ在培养第４８ｄ为高速生长期，Ｃ在第３５代生长最为旺盛。流式细胞术鉴定，Ｄ４一、Ｄ５一、ＭＳｓ～ＭＳｓ～经Ｃ３（）Ｃ４（）Ｃ４（）Ｃ０（）证明所培养的细胞为较纯的ＭＳｓＢｄＤ４＋、Ｄ１５＋，Ｃ。ｒＵ体外标记兔ＭＳｓ阳性率达到８％～０结论：用本Ｃ的５９％。应

兔骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨诱导

ＴｕｏＺｈｅｎ．ｈｅ ’
１ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ，ＳｅｃｏｎｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＬａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００３０，Ｇａｎｓｕ
关键词：
庾佳佳 ★ ，男，１９８５年生，
山西省新绛县人，汉族，兰州大学在读硕士，主要从事骨组织工程研究
干细胞；骨髓干细胞；骨髓间充质干细胞；密度梯度离心法；分离培养：成骨诱导；骨组织工程；兔；国家自然科学基金；干细胞图片文章
中国组织工程研究
第，７眷第６期
２０１３— ０２—０５出版
ＷＷＷ．ＣＲＴＥＲ．ｏｒｇ
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｉｓｓｕｅＥｎｇｉｎｅｅｎｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＦｅｂｒｕａｒｙ５，２０１３Ｖｏ１．１７，Ｎｏ．６
兔骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨诱导冰 ★
庾佳佳 ’ ，汪新柱，赵琳’ ，孙瑞’ ，闰雪萍。，张苍宇’ ，任广铁’ ，拓振合 ’
２甘肃省中医院放射科，甘肃省兰州市
１兰州大学第二医院骨科，甘肃省兰州市７３００３０７３００５０３兰州大学口腔医学院，甘肃省兰州市７３００００
．
养。

兔骨髓间充质干细胞的分离、体外培养、成骨诱导与鉴定

（广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科，广西南宁５３００２１）
摘要：目的建立一种兔骨髓间充质干细（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌ１．ＭＳＣ）体外分离培养、扩增及鉴定的方法。方法采用全骨髓贴壁培养法分离
原代和传代培养的ｒＢＭＳＣｓ具有活跃的增殖能力，成骨成脂诱导后，碱性磷酸酶染色、茜素红染色、ｖｏｎＫｏｓｓａ法染色、Ｉ型胶原免疫细胞化学
检测和油红。染色均呈阳性。成骨诱导电镜检测呈阳性。结论全骨髓贴壁培养法操作相对简单，可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞，
ＭｅｔｈｏｄｓＢＭＳＣｓｆｒｏｍｒａｂｂｉｔｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄ，ｃｕｌｔｕｒｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙｔｈｅｗｈｏｌｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗａｄｈｅｒｅｎｃｅｍｅｔｈｏｄ，ＴｈｅｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒＰｈｓｅａ — ｃｏｎｔｒａｓｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅａｎｄｔｈｅｇｒｏｗｔｈｃｕｖｅｒｏｆｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｗａｓｄｒａｗｎａｃｃｏｒｄｉｎｇｌｙ．ＢＭＳＣｓｗｅｒｅｉｎｄｕｃｅｄｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏｏｓｔｅｏｂｌｓｔａｓａｎｄａｄｉｐｏｃｙｔｅｓａｎｄｄｅｔｅｃｔｅｄＡｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔｓｅａａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｐｏｉｎｔｓ．ＲｅｓｕｌｔｓＢＭＳＣｓｆｒｏｍｒａｂｂｉｔｓｗｅｒｅｓｐｉｎｄｌｅｃｅｌｌ — ｂａｓｅｄ，ｓｈｏｗｉｎｇｒａｄｉａｌｃｏｌ Байду номын сангаас ｎｙａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ．Ｔｈｅｒｏｇｔｈｗｃｕｒｖｅｗｅｒｅｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ￣；ｉｔｈｔｈｅｒｏｇｗｔｈｃｈａｒａｃｔｅｉｓｒｔｉｃｓａｎｄｇｏｏｄａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｎｏｒｍａｌｃｅｌｌｓ．Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，ｏｉｌｒｅｄＯ

兔骨髓间充质干细胞的体外培养及相关检测的实验研究

中医正骨２１０１年１第２１月３卷第１１期
・
（８３３・总０）・
基础研究・
兔骨髓间充质干细胞的体外培养及相关检测的实验研究
王萧枫童培建金红婷吴银生，，，
（．１浙江省温州市中西医结合医院，浙江温州３５０；．１２００２浙江中医药大学，浙江杭州３０５）１３０
ＷｎｈｕＣｔ，ｅｚｏ２００Ｚｅａｇ，ｈｎｅｚｏｉＷｎｈｕ３５０，ｈｆｎＣｉｙｉａ
ＡＳＲＴＯｂｅｔｅＴｘｌｒｔｐｒａｈｓｔｉｌｔ，ｕｕｅａｄｉｅｔｙｔｅｂｎａｏｓｎｈｍｌｔｍｃｌ（Ｃ）０ＢＴＡＣｊｃｉ：ｏｅｐｏｅｈａｐｏｃｅｏａｃｌｒｎｎｉｈｏｅｍ￣ｗｍｅｅｃｙａｓｅｌＭＳｓｆｖｅｏｓｅｔｄｆｅｓ
ｒｂｉｎｖｔｏＭｅｈｄ：ａｂｔＭＳｅｅｅｔｃｅｈｏｇｈｅｓｔｒｄｅｔｅｔｆｇｔｎａｄｓｐｒｔｎｏｅｃｍｂｎｔｎａｈｒａｂｔｉｉ．ｓｒｔｏｓＲｂｉＣｓｗｒｘｒｔｄｔｒｕｈｔｅｄｎｉｇａｉｎｎｒｕａｉｎｅａａｉｆｔｏｉａｉｄｅ－ａｙｃｉｏｏｈｏ
ｅｔｃｌｇｏｔａｅａｄｍｏｐｏｏｉａｈｎｅｓｏｓｒｅｓｎｅｉｖｒｄｍｉｒｓｏｅｓｌｃｈ３ｃｌｎｕｅｓｎｐｃａｄａｎ，ｅｌｒｗｈｒｔｎｒｈｌｇｃｌａｇｓｗａｂｅｖｄｕｉｇｔｎｅｅｃｏｃｐ，ｅｅｔｅＰｅｌｉｄｃｄｕｉｇｓｅｉｍｅｉｃｈｔｔｓｌｓｐｌｍｅｔｄ，ｂｅｖｈｅｓｂｌｙｏｉｅｅｔａｉｎｉｔｏｅｃｌ，ａｅｌ，ａｔｌｇｅｌ．ｘｒｓｉｎｏ２Ｃ４Ｃ４，Ｄ５ｗｓｕｐｅｎｅｏｓｒｅｔｅｆａｉｉｔｆｄｆｒｎｉｔｎｏｂｎｅｌｆｔｃｌｃｒａｅｃｌＥｐｅｓｏｆｉｆｏｓｓｉｓＣＤ９，Ｄ４，Ｄ３Ｃ４ａｄｔｃｅｓｎｏｙｏｔ．ｓｌ：ｈｕｕｅｅｌｈｗｉｇｌｎｕｉｒａｄｆｒｂａｔｉｅｇｏｔｐａｔｔｃｍｅｔａｄｒｐｄｅｅｔｄｕｉｇｆｗｃｔｍｅｒＲｅｕｔＴｅｃｈｒｄｃｌｓｏｎｏｇｆｓｆｍｎｂｏｌｓ－ｌｒｗｈ，ｌｓｉａｔｈｎｎａｉｌｙｓｓｏｉｋｃａ

兔DCM造模及骨髓间充质干细胞培养方法学的研究

ｗｅｒｅｋ，ｎｅｏｅｊｔｇａｒｍｃｍ／ｇｂｄｔｗｃｅｋｆｅｋ．ｏｐｒｔｆｃｎｙｏｔｏｅｋｆｗｅｓａｄｔｔｒｓｎｅｉｄｉｙｉ１ｇｋｏｙｗｉａｅｒｗｅｓＷｅｃｍａｅｅｉｃｆｗｏ８ｈｈｉｉｃｎａｎｔｅｗｏ８ｅｈｉｅ
在为研究ＤＭ治疗方法的选择以及临床疗效的观察奠定基础，细胞移植的准备提供方法学依据。方法Ｃ为
１每次２ｍ／ｇ及每周２次每次１ｇｋ，连续８的给药方式进行兔ＤＭ模型的制备，药结束后３周处死动次ｇｋ，／ｇ均ｍ周Ｃ给
亡率和体重减轻率无统计学差异。应用密度梯度离心法和全骨髓培养法均可获得ＭＣ，Ｓｓ但所获细胞纯度及其生物学特性略有差异。结论
的选有效，两种给药方式模型制备效果一致，推荐使用１１的周次
给药方式；种培养方法均可获得ＭＣ细胞，根据不同实验中具体需要的细胞数量和细胞纯度进行不同培养方法两Ｓｓ可关键词：张型心肌病；物模型；髓问充质干细胞；外培养；扩动骨体兔
ｆｏｂｎｒｏｆａｂｔＳＮｎＪＮｈａｇｑａ，ＩＮＪ－ｅ，ｔ１（ｅａｔｅｔｆＵｔｓｕｄＴｅｏｄｆｌｒｍｏｅｍａｒｗｏｂｉＵＭｉ，ＩＧＳｕｎ－ｕｎＴｉｗｉｅａ．Ｄｐｒｎｏｌｏｎ，ｈ＆ｃｎ：ｉｒＡＡａｍｒｏＡｆ — ｉ

兔骨髓间充质干细胞的分离、扩增及诱导分化

胞诱导，４ｄ成骨细胞诱导组检测碱性磷酸酶，脂肪细胞诱导组进行油红０染色。结果全骨髓贴壁培养１后成
法可获得ＢＭＳｓ原代和传代培养的ＢＭＳｓＭ．Ｃ，Ｍ．Ｃ具有活跃的增殖能力。成骨细胞诱导组碱性磷酸酶检测表
【摘要】目的探讨兔骨髓间充质干细胞（ｏｅｍａｒｗｍｅｅｃｙｌｔｍｅｌ，Ｍ— Ｃｓ体外培养、向ｂｎｒｏｓｎｈｍａｓｃｌＢＭＳ）ｅｓ定诱导分化为成骨细胞和成脂肪细胞的途径，为进一步的实验研究打下基础。方法抽取兔股骨骨髓，以全骨髓贴壁培养法进行体外培养，贴壁细胞传代，倒置显微镜下观察细胞形态。取第３代细胞向成骨细胞和成脂肪细
Ｃｈｎｓｅｉａｎｖｒｉ，ｎｉｇｉｅｅＭｄｕｎｘ３０１ｙａｇｉ５０１，Ｃｈｎｉａ
［ｂｔａｔＯｂｅｔｅＴｎｅｔａｈｕｔａｉｎｉｉｏｏａｂｔｂｎｒｗｓｎｈｍａｓｍｅｌＡｓｃ］ｒｊｃｖｏｉｖｓｇｔｔｅｃｌｖｔｎｖｔｆｒｂｉｏｅｍａｒｍｅｅｃｙｌｔｃｌｉｉｅｉｏｒｏｅｓ（Ｍ．Ｓ）ｔｅｎｕｔｎｎｄｆｒｎｉｔｎｆＭ．ＳｓｎｏｔｏｌｔｎｄｉｏｌｓｆｒｕｔｅＢＭＣｓｈｉｄｃｉａｄｉｅｅｔｉｏＢＭＣｉｔｓｂａｓｏｆａｏｏｅｓａｌｂａｔｏｆｒｒｐｓｈ
【关键词】骨髓问充质干细胞；细胞，培养的；因扩增；基细胞分化；兔中图分类号：１２．４文献标识码：文章编号：６４６６２１）１０４．３１９２３Ａ１７－６Ｘ（０００－０９０

幼兔髂骨穿刺抽取骨髓间充质干细胞分离培养鉴定：注意的细节与技术

幼兔髂骨穿刺抽取骨髓间充质干细胞分离培养鉴定：注意的细节与技术张聪;刘洪美;李庆伟;陈国武;梁啸;孟纯阳【摘要】背景：骨髓间充质干细胞被认为是构建组织工程骨修复骨与软骨缺损中较为常用的种子细胞，在其基本操作过程中注意常见问题并及时避免，对后期细胞学及组织工程学实验很有意义。

目的：通过作者实验操作过程中所遇问题的总结和分析，为初学者和科研人员提供可靠的骨髓间充质干细胞分离培养鉴定方法，减少操作过程中的人为失误和易犯问题。

方法：取16只幼年新西兰大白兔作为实验对象，进行髂骨穿刺抽取骨髓液。

采用密度梯度离心法联合贴壁培养法体外筛选纯化细胞，并且通过倒置相差显微镜观察其形态学特点、生长曲线和流式细胞术鉴定骨髓间充质干细胞表型。

结果与结论：实验过程中前5只兔骨髓抽吸、骨髓间充质干细胞分离过程中遇到不同的问题和困难，经认真总结和分析，后11只兔骨髓抽吸、骨髓间充质干细胞分离均获成功，在细胞培养过程中未发现细菌污染和细胞老化，第3代骨髓间充质干细胞高表达CD29、CD44抗原，而CD14、CD34抗原低表达，MTT测细胞生长曲线显示P3和P5增殖活性较高。

尽管骨髓间充质干细胞分离培养鉴定技术已较为成熟，但是如果操作过程中不注意细节问题，也将会导致实验困难重重或失败。

严格执行常规操作步骤可以得到纯度较高的骨髓间充质干细胞，提高成功率，为后续相关细胞实验和动物实验做好准备。

%BACKGROUND:Bone marrow mesenchymal stem cells are considered as commonly used seed cells to construct tissue-engineered for repair of bone and cartilage defects. It is of great significance for cytology and tissue engineering experiments to study the common problems existing in the basic operation and how to avoid these problems in a timely manner.OBJECTIVE:To summarize the common problems existing in the process of operation in order to provide reliable methods about separation, culture and identification of bone marrow mesenchymal stem cells for beginners and researchers. These can reduce or avoid some errors and problems during operation. METHODS:Sixteen New Zealand white rabbits were selected as experiment objects, and bone marrow mesenchymal stem cells were separated from rabbits by iliac puncture, purified and augmented by using density gradient centrifugation combined with adherent culture method. Then cellmorphology was observed by inverted phase contrast microscope, growth curve detected by MTT method and cellphenotype identified by flow cytometry. RESULTS AND CONCLUSION:We encountered some problems in the process of separation and culture, when we operated the first five rabbits. After careful y summarizing and analysis of the reasons, the operation was successful y completed on the rest 11 rabbits. Bacteria pol ution and cellaging were not found in the process of cellculture. What is more, the cells at passage 3 appeared with high-expression of CD29, and CD44, but low expression of CD14 and CD34. The cellgrowth curve showed that the proliferation activity of cells at passages 3 and 5 was higher than that at passage 10. Although the technology of separation, culture and identification of bone marrow mesenchymal stem cells is mature, the failure wil be happen if we do not pay attention to the details of operation. By strictly carrying out normal operations, we can get high purity of bone marrow mesenchymal stemcells, which lays a good foundation for celland animal experiments in the future.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2014(000)023【总页数】6页(P3639-3644)【关键词】干细胞;骨髓干细胞;骨髓间充质干细胞;种子细胞;细胞培养;表型鉴定;兔;山东省自然科学基金【作者】张聪;刘洪美;李庆伟;陈国武;梁啸;孟纯阳【作者单位】济宁医学院附属医院脊柱外科，山东省济宁市 272000;济宁医学院病理教研室，山东省济宁市 272000;济宁医学院附属医院脊柱外科，山东省济宁市 272000;济宁医学院附属医院脊柱外科，山东省济宁市 272000;济宁医学院附属医院脊柱外科，山东省济宁市 272000;济宁医学院附属医院脊柱外科，山东省济宁市 272000【正文语种】中文【中图分类】R394.20 引言 Introduction骨髓组织中除含有造血干细胞外，还含有少量的骨髓间充质干细胞[1]。

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及DiI荧光标记

ｏＤ２ｎｆＣ９ａｄＣＤ１６ｏｅｌｗｅｅａａｙｅｙｕｉｇｉ０ｆｉｒｎｌｚｄｂｓｎｍｍｕｏｙｏｈｍｉｔ．ｈｈｒｅｅａｉｎｏＣｓｌｂｌｄｂｉ．ｃｓｎｅｔｃｅｓｙＴｅｔｉｇｎｒｔｆｒｄｏＭＳｓｗａａｅｅｙＤＩＴｅｌｂｌｇｅｆｉｎｙｗｓｄｔｃｅ．ｅｕｔ：ｈｒｒｕｔｒｄＭＳｓａｈｒｄｔｌｓｉｕｆｃｔｉ８ｈａｄｒａｈｄｈａｅｉｆｃｅｃａｅｅｔｄＲｓｌＴｅｐｉｙｃｌｅＣｄｅｅｏｐａｔｓｒｅｗｉｎ４ｎｅｃｅｎｉｓｍａｕｃａｈ９％ｃｎｕｎｅｗｉｉ — ．Ｃｘｒｓｅ０ｏｆｅｃｔｎ７８ｄＭＳｓｅｐｅｓｄＣＤ２ｎＤ１６Ａ１ｏｅＭＳｓｓｏｅｄｆｏｅｃｎｅｂｍｍｕｏｕｒ — ｌｈ９ａｄＣ０．１ｆｈＣｈｗｄｒｕｒｓｅｃｙｉｔｅｌｎｆｏｏｌ
ｃｉ（Ｓｓｉｖｒ．Ｍｅｈｄ：ＳｓｅｅｓｌｅｎｕｔａｄｙｅｓｙｒｄｅｔｎｄｅｅｔｅｏｓＴｅｘｒｓｉｓｅｌＭＣ）ｎｉｏｓｔｔｏｓＭＣｒｉａｄａｄｃｌｖｔｎｉａｉｄａｈｒｎｔｄ．ｈｐｅｓｎｗｏｔｉｅｂｄｔｇｎａｍｈｅｏ
汇合；免疫细胞化学方法检测细胞表面标志抗原Ｃ２，Ｄ０Ｄ９Ｃ１６为阳性；ｉ进行细胞标记后，荧光显微镜下见所有ＤＩＭＣ均被标记为红色荧光，Ｓｓ敏感性好，标记效率高。结论：此培养方法可以作为培养兔ＭＳｓＣ的常规方法，为构建组织工程尿道提供充足的种子细胞。关键词骨髓细胞间质干细胞细胞，培养的细胞分离免疫组织化学荧光抗体技术流式细胞术兔

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3000rpm×30 min离心，小心吸取中间白膜层，DMEM 洗涤2次，接种于含 15%FBS的低糖完全培养基中
二、全骨髓培养法
• 制备细胞悬液同前，将所收集的细胞悬液用200 目滤网过滤, 制备成单细胞悬液,1000rpm×5min 洗涤2 次, 弃上清液, 取沉淀重新悬浮后, 接种于含 15% FBS 的培养液中
兔骨髓间充质干细胞的分离
密度梯度离心法全骨髓培养法
一、密度梯度离心法
超酒精棉球、保鲜膜、打火机、手术包、percoll分离液、培养基、培养瓶等
• 取生后21天新西兰大白兔1只（兰州大学动物房提供），重约0.3kg
水淹法处死后, 放入75% 的酒精内浸泡15 min。无菌条件下取出双侧股骨、胫骨、肱骨，去除附带组织,浸入生理盐水中清洗2次
无菌间内，超净台上，将长骨从中间剪断。此方法优点： 1.可最大量提取出干骺端干细胞（丁香园提示干细胞大量存在于干骺端） 2.操作简便，只需剪开一次
• 以10ml 注射器吸取无血清低糖DMEM 培养液反复冲洗, 以骨头发白为准,4号针头反复抽吸制备成单细胞悬液,装入两离心管中以 1000rpm×5min离心，去除上清， DMEM 重悬，轻铺于等量的密度1.073g/ml Percol 分离液上（5ml:5ml）