Hela细胞培养
Hela细胞（人工颈癌细胞）
实验准备工作
1、Hela细胞（人宫颈癌细胞）
2、细胞培养试剂：DMEM培养基，胎牛血清，青霉素，链霉素，0.25%胰蛋白酶（含0.02%
的EDTA），PBS等
3、培养器具：培养瓶、烧杯、镊子、酒精棉、离心管、改良吸管、胶头吸管、细胞计数板、
毛细管等。
4、实验设备:二氧化碳培养箱、光学显微镜、无菌操作台、恒温水浴锅、酒精灯。
5、细胞冻存和复苏的方法
冻存液：含10%血清的完全培养基和5％-10% DMSO
取对数生长期细胞，精胰酶消化后加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（1×106~5×106细胞/ml），加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记细胞名称和冷冻日
期。
复苏细胞是从零下80℃冰箱或液氮罐中取出冻存管，迅速投入37℃水浴中，使其融化（1分钟左右），用培养集缓慢稀释至原体积的10倍以上，大部分细胞完全贴
壁后（4~6小时），吸取含有冻存液的培养基，并换成完全培养基。
细胞复苏实验步骤
1. 从零下80℃冰箱或者液氮罐中取出冷冻管，迅速投入37℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。
2．培养基缓慢稀释至原体积的10倍以上。
3.1低速离心10分钟，吸去上清，加入新鲜的培养基培养刚复苏的细胞。
3.2六个小时细胞完全贴壁后吸去含有冻存液的培养基并换成完全培养基。
6、细胞传代实验步骤
取密度80％左右的Hela细胞，吸去旧的培养基，用PBS或者Trypsin消化液润洗细胞以减少残留的血清对Trypsin的抑制作用。
吸去PBS或者Trypsin，加入Trypsin消化液，于37℃消化2～4分钟，于倒置显微镜下观察，当细胞之间出现间时或者变圆时，吸掉Trypsin消化
液。
(也可以直接加入适量含血清的新鲜培养基终止Trypsin的消化作用
并进行吹打分离细胞，消化细胞时应静置以避免漂浮的细胞滚动成团) 加入适量新鲜培养基，用移液器上下吹打数次打散细胞团块以尽可能形成单细胞悬液，吹打均匀后，按照稀释比例转移至新的培养瓶中，补充
完全培养基并以正常培养条件培养。
细胞实验方案
HALA细胞工程实验培养方案背景知识：Hela Cells是细胞学与医学研究中使用的一种细胞，源自一位美国妇女海莉耶塔·拉克斯（Henrietta Lacks）的子宫颈癌细胞的细胞系。
这名美国妇女在1951年死于该癌症。
为了让拉克斯保持匿名，此细胞株原宣称是依“Helen Lane”命名。
HeLa细胞系被视为“不死的”（即不同于其他一般的人类细胞，此细胞株不会衰老致死，并可以无限分裂下去），至今都被不间断的培养。
此细胞系跟其他癌细胞相比，增殖异常迅速。
海拉细胞系被George Gey分送给众研究单位（并未通知拉克斯本人也未得到她的许可），并用作癌症模式细胞研究。
HeLa细胞系也被用作研究细胞信号传导。
海拉细胞系是被人类乳突病毒第18型转化的，和正常子宫颈细胞有许多不同。
已证实海拉细胞系难以控制。
此细胞系有时会污染同一实验室的其他细胞培养物，干扰生物学的研究。
污染程度难以估计，因为研究人员很少检定已确立细胞系的本质和纯度。
据说有相当数目的体外细胞系其实就是HeLa细胞系，因为原先的细胞株已被快速增殖的HeLa细胞系污染物取代了。
实验原理：(1)细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
(2)体外培养过程中，随着培养时间的延长，细胞的分裂繁殖，培养物越来越大长满培养空间并因接触抑制而生长缓慢，此时须将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿中，这个过程称为传代（passage）或再培养（subculture）意义：①细胞生长、增殖的需要；②扩大培养，获得大量同种细胞，为后续研究做准备。
HeLa_细胞内及组织内纳米碳点含量测定
引用格式：毕禄莎, 汪丹, 李昊, 等. HeLa 细胞内及组织内纳米碳点含量测定[J]. 中国测试，2023, 49(11): 76-82. BI Lusha, WANG Dan, LI Hao, et al. Measurement of nano-carbon dots in HeLa cells and tissues[J]. China Measurement & Test, 2023, 49(11): 76-82.DOI: 10.11857/j.issn.1674-5124.2023040035HeLa 细胞内及组织内纳米碳点含量测定毕禄莎1， 汪 丹2， 李 昊3， 赵梦凡4(1. 西南医科大学附属医院药学部，四川 成都 646000; 2. 成都大学，四川 成都 610106;3. 西南医科大学附属医院临床研究中心，四川 成都 646000;4. 西南医科大学附属医院乳腺外科，四川 成都 646000)摘 要: 为解决纳米碳点无对照品而难以定量的缺陷，该文利用碳点稳定的荧光性，以纯荧光化合物为“替代对照品”，建立碳点的细胞内及组织内含量测定方法。
将具有良好成像性能的碳点作为候选碳点，以甲酚紫、罗丹明6G 为对照品，建立候选碳点及其叶酸偶联物HeLa 细胞内以及生物组织中的含量测定法及其方法学验证。
结果表明，三种候选碳点DCCDs 、ACUCDs 、UCPG-Fe 及其叶酸偶联物在HeLa 细胞内和组织内，均在一定浓度范围内具有良好的线性关系（r 2=0.993 3~0.999 2），平均回收率为86.61%~102.5%，精密度RSD 在2.82%~3.91%之间。
以此分别检测出细胞内DCCDs 和FA-DCCDs 在摄取时间3 、6、9 、12 h 的纳米碳点含量在0.125 5~0.266 5 μg/mL 之间及0.891 7~1.239 μg/mL 之间；肝、肾组织内DCCDs 在摄取时间20、30、40、50、60、70 min 的纳米碳点含量分别在1.132~1.756 μg/mL 之间及0.335 8~0.704 3 μg/mL 之间。
海拉细胞与自噬
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壹 背景知识 海拉细胞
是一种人工培养，具有无限增殖能力的细胞。 1951年由盖伊等从人子宫颈癌组织分离出来的 株细胞。HeLa是原患者假名海伦·莱恩的缩写。
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特点
➢可以连续传代； ➢细胞株不会衰老致死，
因此，这个自噬将代表着一种细胞生存机制。
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细胞凋亡： 是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的 有序的死亡。 核染色质的存在是区分细胞凋亡和自噬作用最有益 的标准;
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异噬：
细胞外物质（如作为营养成分的大分子颗粒物质、细菌、病毒等） 经吞噬作用或吞饮作用进入细胞，形成吞噬体或吞饮泡。
并可以无限分裂下去； ➢跟其他癌细胞相比，增
殖异常迅速； ➢感染性极强。
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动物细胞培养
概念 从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个细
胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增 殖。
如何进行细胞培养?培养时又需要提供哪些必要条件呢？
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过程
动物组织细胞间隙中含有一定 量的弹性纤维等蛋白质，将细
光镜定位和超薄切片
已分离的细胞层聚合块进行单层细胞原位超薄切片，用醋酸铀 和柠檬酸铅染色，观察酸性磷酸酶反应的产物。
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伍 实验讨论
一种观点： 在缺乏血清和氨基酸培养的海拉细胞中，观察到自噬液泡的数 量在以惊人的速度增加。 这个细胞自噬模型可以用来进一步研究控制自噬的机制：海拉 细胞显然能够通过消化自己的细胞质来应对营养剥夺。
细胞制备
保持细胞的生长对数期，一直进行五次传代培养，每次当细 胞贴壁时快速更换培养基，得到大量的海拉细胞。
苯丁酸钠对体外培养人宫颈癌Hela细胞增殖抑制作用
关键 词 ： ｅ Ｈ ｌ 胞 ； 蛋 白去 乙酰 化 酶 抑 制 剂 ；苯 丁 酸 钠 ； 胞 增 殖 ；细 胞 周 期 ａ细 组 细
中 图 分类 号 ：Ｒ ３ ． ２ ７ ０ ２ 文 献 标 识 码 ：Ａ
Ｂｌ ｃ ｉ ｆｅ ｔｏ ｏ ｉ ｍ ｈ ｎ ｌ ｕ ｙ ａ ｅ ｏ ｅｌｐ ｏ ｉｅ ａ ｉ ｎ ｉ ｏ ｋ ｎｇ ｅ ｃ ｆｓ ｄ ｕ ｐ ｅ ｙ ｂ ｔ ｒ ｔ ｎ ｃ ｌ ｒ ｌ ｒ ｔｏ ｎ ｆ ｈ ｍ ａ ｅ ｖ ｃ ｌｃ ｎ ｅ ｅｌｌ ｅ Ｈ ｅａ ｉ ｉｒ ｕ ｎ ｃ ｒ ｉ ａ ａ ｃ ｒ ｃ ｌ ｉ ｌ ｎ ｖ ｔ ｏ ｎ
第 ｌ ７卷 第 ４期
２ ０ 圭 ０ ８ Ｅ
河 南 医 学 研 究
ＨＥＮＡＮ Ｍ ＥＤＩ Ａ Ｌ ＲＥＳ ＡＲ Ｃｔ Ｃ Ｅ ｌ
Ｖ０ ． ７ １ １
ＮＯ ４ ．
ｌ 月 ２
Ｄｅ ｅ ｂ ｒ ２ ０ ｃ ｍ ｅ ０ ８
文 章 编 号 ：０ ４ ４ ７ ２ ０ ） ４ ０ ０ — １ ０ －３ Ｘ（ ０ ８ ０ —３ ６０ ０
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Hela-EGFP稳转细胞株说明书
干冰运输细胞： 1、 37℃水浴融化细胞冻存液，间或摇动冻存管以加速融化
过程。待细胞冻存液完全融化后，用 70%乙醇消毒细胞 冻存管外壁。 2、 室温 200g 离心 5 分钟收集细胞。吸去上清。 3、 用 1ml 培养基重悬细胞。 4、 将细胞接种到 6mm 培养皿或 25cm 培养瓶中，补加 5ml 培养基，37℃ 5%CO2 培养。
细胞冻存： 1、 将细胞培养液、PBS 和胰蛋白酶和冻存液温浴到 37℃。 2、 冻存的细胞应为状态好，生长旺盛的细胞。 3、 按细胞传代方法消化细胞，用适量细胞培养液终止消化，
重悬细胞。 4、 室温 200g 离心 10 分钟收集细胞，用冻存液重悬细胞，
并调节浓度至大约 1×10^6 个细胞/ml。分装到细胞冻 存管。 5、 将细胞冻存管放入程序降温盒，‐80℃过夜。 6、 将冻存的细胞转入液氮中。
5、 第二天观察细胞贴壁情况，换液去除未贴壁细胞，继续 培养。
6、 细胞生长后及时消化传代，尽早冻存 1~2 支。
细胞传代： 1、 传代前将细胞培养液、PBS 和胰蛋白酶温浴到 37℃。 2、 吸去细胞培养液。 3、 用 PBS 漂洗一次。 4、 加入适量胰蛋白酶，轻轻晃动细胞瓶，使胰蛋白酶均匀
覆盖细胞。吸去胰蛋白酶，将培养瓶放置在细胞培养箱 中，37 摄氏度消化。在倒置显微镜下观察，看到细胞分 开及稍微变圆即可，过度消化可能导致细胞贴壁困难。 5、 加入 5ml 细胞培养基，用吸管轻柔吹打分散细胞。 6、 按 1:3 到 1:5 接种细胞。
培养基：DMEM 高糖培养基+10%胎牛血清 消化液：0.25%胰蛋白酶，0.53mM EDTA 冻存液：50%胎牛血清，40%DMEM，10%DMSO 培养条件：37℃，5% CO2
Hela细胞的研究及对癌症研究的贡献
当初的难题是：那些癌细胞总是很快死掉，即使有少量的“幸存者”，它们也根本不会
生长无法满足研究的需要。
2
2、Hela cells的特点
Ⅰ、可以连续传代
Ⅱ、细胞株不会衰老致死，并可以无限分裂下去
Ⅲ、此细胞系跟其它癌细胞相比，增殖异常迅速
Ⅳ、感染性极强
Fig.3 衰老的问题
Hela细胞生长奇快，甚至超越一般癌细胞。Hela细胞经历细胞分裂时可维持端粒酶活 性以维持瑞粒长度，一般细胞的端粒会随着老化而变短，终至细胞死亡。海乐细胞利用此
In A State Strain Of Human Malignant Epithelial Cells (Strain Hela)Derived From An Epidermoid Carcinoma Of The
Cervix”.[J]Journal of Experimental Medicine . 1953 ,97 (5): 695–710.
4
4、克隆技术的奠基
Fig.5 A、Typical clones produced from single HeLa cells growing on glass slides above a feeder layer ( X 1.7). B、Photomicrograph
of a typical clone (X50).[2]
Fig.4 A Somaliboy is injected with inactivated poliovirus vaccine (Mogadishu, 1993)
当初的研究遇到的难题是，研究已使用外神经系组织与猴子做实验，无法用人体与其他动
物做实验， Jonas Salk首次将脊髓灰质炎疫苗的研究使用到人体体外第一个活细胞Hela用于研究
HeLa细胞株
HeLa细胞株在生物学与医学研究中，HeLa细胞是指源自一名美国妇女的子宫颈癌细胞的细胞。
这名美国妇女名叫Henrietta Lacks，于1951年死于癌症。
本来为了让Lacks保持匿名，此细胞株宣称是依“Helen Lane”命名。
HeLa细胞株被George Gey分送给众研究单位（而未通知Lacks本人也未得到她的许可），因用作癌症研究而广为流传。
至今已被视为“不死的”，也就是说此细胞株（不同于其他人类细胞）不会老死，而且可以不限次数的分裂下去，而且已被培养出一个不间断的系列。
从1951年至今，Hela细胞已经培养了50多年，分裂了18000次以上仍然没有停止的迹象。
此细胞株即使和其他癌细胞相比，增殖依然异常迅速。
一般两天左右即可长到35000000～40000000个。
然而，由于当初采集细胞时并没有征得患者或家属的同意，HeLa细胞株广泛应用引发了一系列的医学伦理问题。
2009年，Rebecca Skloot将这个具有传奇性的故事编撰成书，书名为《永生的海拉》[1]。
此细胞株被用作“model cancer cells”来研究细胞信号传导（cellular signal transduction）。
HeLa细胞株是由正常子宫颈细胞被一种人类乳突状瘤病毒（Human Papillomavirus 18 或HPV18）转型成癌细胞的，而且和正常子宫颈细胞有许多不同。
目前已经证实HeLa细胞株难以控制。
此细胞株有时会污染同一实验室的其他细胞培养环境（cell culture），进而影响生物研究。
由于研究人员很少检查已确立的细胞株的本质和纯粹度，因此污染的程度不明。
据说有相当数目的“人造”细胞株其实是HeLa细胞株，也就是说原来的细胞株被一群受到HeLa细胞株污染的快速增殖细胞淹没了。
有的学者已经认为此细胞株其实是一新的品种，因为此细胞株能自行繁殖和散布。
在1991年此细胞株被命名为Helacyton gartleri。
利用MTT法测定不同浓度顺铂对Hela细胞增殖的抑制效果.doc
利用MTT法测定不同浓度顺铂对Hela细胞增殖的抑制效果摘要：目的：观察不同浓度顺铂对Hela细胞增殖的抑制作用，并探讨出最适合用于抑制Hela增殖的浓度梯度。
方法：采用MTT比色法对经不同浓度顺铂处理后的Hela细胞进行测定，检测不同浓度顺铂对细胞增殖的抑制情况。
结果：0.3～1μg/mL浓度的顺铂对Hela细胞的增殖主要起到促进作用；1～7.5μg/mL梯度内的顺铂作用不清晰，而7.5～80μg/mL这一浓度梯度内的顺铂则都是起抑制作用，且抑制作用随浓度升高而增强；只是在7.5～25μg/mL这一浓度梯度内，不同浓度顺铂间的抑制作用存在较大差异，而在25～80μg/mL这一范围内顺铂的抑制作用相差不大。
结论：高浓度顺铂对Hela细胞的增殖确实有抑制作用，而低浓度顺铂则不然，所以通过归结之后可知，较适合用于抑制Hela细胞增殖的顺铂梯度应在10～25μg/mL之间，可以是10μg/mL，15μg/mL，20μg/mL，25μg/mL。
关键词：MTT法，顺铂，Hela细胞，增殖，抑制MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazo-liumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，是一种黄颜色的染料。
MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法；其检测原理是：外源性MTT在哺乳类动物类活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶的作用下还原为水不溶性的蓝紫色（或蓝色）结晶甲瓒（Formazan），并沉积在细胞中；在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比[1]。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，因此用酶联免疫检测仪在490nm或570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
而死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT 不会有反应。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
海拉细胞系
• 2. 贴壁期：
• • •
• 3. 潜伏期：
• 4. 对数生长期： •
• •
血清质量好坏是细胞培养的关键
• 常用血清有胎牛血清、新生牛血 清、小牛血清、兔血清、马血清 等 • 根据牛出生时间和血清采制分离 方法分为： • 1、胎牛血清：八月龄胎牛心脏穿 刺取血； • 2、新生牛血清：出生12-24小时 新生牛静脉采血； • 3.小牛血清：出生三月龄小牛动脉 采血分离血清； • 其中以胎牛血清质量最好。优质 血清的标准：透明，淡黄色，无 沉淀物，无细菌、支原体、病毒 污染。
细胞的培养
• 传代培养
细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种 到新的培养器皿中。培养细胞的“一代”，不表 示细胞分裂一次，而是指培养细胞从接种到再次 转移培养的过程。在一次传代培养中，细胞能倍 增3-6次。
• 原代培养
取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞 在传代之前称为原代培养。一旦进行传代培养，便 不再是原代培养，而改称为细胞系。
哈拉尔德· 楚尔· 豪森
HPV疫苗——救命的疫苗
近些年，去香港除了旅游和 购物外，又多了个理由，那 就是打“宫颈癌疫苗” （HPV疫苗）。HPV疫苗市场 空前火爆！ 2016年7月18日， 希瑞适 （Cervarix，人乳头状瘤病毒 (HPV)疫苗[16型和18型]）获 得中国食品药品监督管理总 局的上市许可，成为国内首 个获批的预防宫颈癌的HPV 疫苗，预计到2017年初才能 真正上市。
•
她的细胞，将永远造福于人类
• 1951年10月4日，由于癌症扩散 到了全身，拉克丝病逝于约翰· 霍 布金斯大学医院隔离病房。拉克 丝的遗体，被埋葬于自家的庭院， 连墓碑也没有树立。但是海拉的 细胞至今依然存活，继续为人类 健康发挥着积极作用。 • 2010年3月，帕蒂略教授捐款为 拉克丝树立了墓碑。墓碑上镌刻 着这样一行字：“她的细胞，将 永远造胞 (HeLa)的应用
细胞生物学实验手册：培养细胞的形态观察和计数
实验十三培养细胞的形态观察和计数【实验目的】了解培养中的动物细胞的一般形态和生长状态；掌握细胞计数的基本方法。
【实验用品】一、材料和标本培养中的HeLa细胞(人子宫颈癌上皮细胞)、NIH3T3(小鼠成纤维细胞)、HL一60细胞(人白血病细胞)二、器材和仪器倒置显微镜、细胞计数板、普通光学显微镜、乳头吸管三、试剂 0.3％台盼兰染液、0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液【实验内容】一、培养细胞的形态观察(一)原理体外培养的细胞主要有两种状态。
一种是能贴附在培养支持物上的细胞，如HeLa细胞、NH3T3等，叫贴壁型细胞，体外培养的细胞绝大多数都属于这种细胞。
另一种细胞并不贴附在容器的壁上，而是悬浮在培养液中生长，如HL—60，叫做悬浮型细胞，这类细胞主要是血液原性或癌原性的细胞。
(二)操作l．将细胞培养瓶从37℃二氧化碳培养箱(或温箱)中取出，注意观察细胞培养液的颜色和清澈度。
然后，将细胞培养瓶平稳地放在倒置显微镜载物台上，此时应注意不要将瓶翻转，也不要让瓶内的液体接触瓶塞或流出瓶口。
2．打开倒置镜光源，通过双筒目镜将视野调到合适的亮度。
3．调节载物台的高度进行对焦，在看到细胞层之后，再用细调节器将物像调清楚，注意观察细胞的轮廓、形状和内部结构。
在观察时，最经常使用的是10X 物镜。
(三)结果贴壁细胞一般有两种形状，即上皮细胞形和成纤维细胞形细胞。
上皮细胞形细胞呈扁平的不规则多角形，圆形核位于中央，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片，如HeLa细胞。
成纤维细胞形细胞形态与体内成纤维细胞形态相似，胞体呈梭形或不规则三角形，中央有圆核，胞质向外伸出2～3个长短不同的突起，细胞群常借原生质突连接成网，如 NIH3T3(参照照片)。
贴壁细胞在生长状态良好时，细胞内颗粒少，看不到有空泡，细胞边缘清楚，培养基内看不到悬浮的细胞和碎片，培养液清澈透明，而当细胞内颗粒较多，透明差，空泡多时，表明生长较差。