实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理与应用
RT-qPCR技术的原理及应用
RT-qPCR技术的工作原理
1 逆转录（RT）阶段
通过RT酶将RNA模板转录成相应的互补DNA（cDNA）。
2 实时荧光定量PCR（qPCR）阶段
在PCR反应过程中，结合荧光探针或DNA染料实时检测PCR产物的数量，并利用定量标准 曲线计算RNA的起始含量。
RT-qPCR技术的优点和应用范围
高灵敏度
2 引物和探针设计
合理设计引物和探针，确保其与目标序列的特异性和敏感性。
3 数据分析和标准化
准确解读和分析RT-qPCR结果，合理选择标准曲线和内部参考基因等。
结论及展望
RT-qPCR技术以其高灵敏度、高特异性和广泛应用范围，在基因表达分析和病 毒检测等领域发挥着重要作用。随着技术的不断发展，我们可以期待在未来 更多领域中看到RT-qPCR技术的应用。
RT-qPCR技术的原理及应 用
RT-qPCR技术是一种广泛应用于分子生物学领域的技术，用于检测和定量分析 RNA的表达水平。 本文将介绍RT-qPCR技术的基本概念、工作原理、优点和应 用范围，并探讨其在基因表达分析和病毒检测中的应用。 与其他方法相比， RT-qPCR技术具有许多优点，但在应用中也有一些挑战和注意事项。
RT-qPCR技术的基本概念
1 什么是RT-qPCR技术？
2 为什么使用RT-qPCR技术？
RT-qPCR（逆转录实时荧光定量聚合酶链反应） 是一种将反转录和实时荧光定量PCR结合起来 的技术，用于定量分析RNA的表达水平。
RT-qPCR技ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ具有高灵敏度、高特异性、广泛 动态范围和准确性等优点，使其成为研究基 因表达和病毒检测等领域的重要工具。
1
目标基因筛选
使用RT-qPCR技术可以准确地定量不同基
实时荧光定量PCR的研究进展及其应用
实时荧光定量PCR的研究进展及其应用一、本文概述实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，简称qPCR）是一种在分子生物学领域广泛应用的分子生物学技术，它能够在PCR 扩增过程中实时监测反应产物的积累，从而精确地定量目标DNA或RNA的初始浓度。
自20世纪90年代诞生以来，qPCR技术以其高灵敏度、高特异性、快速性和定量准确等优点，在基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定、基因突变分析、药物研发等多个领域发挥了重要作用。
随着技术的不断发展和完善，实时荧光定量PCR已成为现代生物学研究中不可或缺的工具。
本文旨在全面综述实时荧光定量PCR技术的最新研究进展，包括其原理、方法、技术优化、应用领域的拓展以及面临的挑战等。
文章首先简要介绍qPCR技术的基本原理和常用方法，然后重点论述近年来在技术优化、多重PCR、数字化PCR等方向上的进展。
接着，本文详细探讨实时荧光定量PCR在基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定、基因突变分析、药物研发等领域的应用案例和前景。
文章还将讨论实时荧光定量PCR面临的挑战，如引物设计、数据分析等问题，并提出相应的解决方案。
通过本文的综述，读者可以对实时荧光定量PCR技术的最新进展和应用有一个全面的了解，为相关研究提供参考和借鉴。
二、实时荧光定量PCR的基本原理与技术特点实时荧光定量PCR（Real-time Fluorescent Quantitative PCR，简称qPCR）是一种在PCR扩增过程中，通过对荧光信号的实时检测，对特定DNA片段进行定量分析的技术。
其基本原理是利用荧光染料或荧光标记的特异性探针，在PCR反应过程中实时检测PCR产物量的变化，从而得到DNA模板的初始浓度。
实时性：通过荧光信号的实时检测，可以实时了解PCR产物的生成情况，无需PCR结束后进行电泳等后续操作，大大缩短了实验时间。
定量性：通过标准曲线的建立，可以准确地计算出DNA模板的初始浓度，实现了PCR的定量分析。
实时荧光定量PCR的原理操作及其应用
实时荧光定量PCR的原理操作及其应用实时qPCR的基本原理是利用DNA模板进行PCR扩增，并通过特定荧光探针或抑制剂标记扩增产物，荧光信号的强度与目标模板数量成正比。
PCR扩增过程中，荧光信号逐渐累积，通过荧光检测系统实时监测荧光的强度变化，可以获取PCR扩增曲线，并通过比较样品的荧光信号与标准曲线建立一个浓度与荧光信号的转换关系，从而确定样品中目标物质的数量。
实时qPCR的操作过程通常包括以下几个步骤：1.准备反应体系：根据所需扩增物质选择合适的引物和探针，并根据样品数量和扩增条件计算所需反应体系的配方。
反应体系中通常包括DNA模板、引物、探针、dNTPs、缓冲液和DNA聚合酶等。
2.设定PCR程序：根据不同引物的特性和样品的要求，设置PCR程序。
PCR程序通常包括一个初始变性步骤，多个循环变性/退火/延伸步骤和一个终止步骤。
循环变性/退火/延伸步骤的温度和时间通常根据引物的需求进行设定。
3.反应体系装填：将反应体系装入PCR管或耐热反应板中，确保样品和反应物均匀分布。
4.实时监测：将PCR反应体系置于实时荧光PCR仪中，根据设定的PCR程序进行扩增，并实时监测荧光信号的累积变化。
5.数据分析：根据荧光信号的变化情况，可以绘制PCR扩增曲线，并通过计算荧光信号的阈值周期数（Ct值）来确定样品中目标物质的相对数量。
比较不同样品的Ct值，可以进行定量分析。
实时qPCR具有广泛的应用。
1.基因表达分析：可以通过实时qPCR检测特定基因在不同组织或样品中的表达水平，从而研究基因在生理和病理过程中的作用。
2.病原体检测：实时qPCR可以用于快速、准确地检测和鉴定病原体，如细菌、病毒和寄生虫等，对于临床诊断和流行病学研究具有重要意义。
3.检测基因突变：实时qPCR可以用于检测个体中基因突变的存在与否，并进行基因型分析，从而研究与疾病相关的突变和遗传变异。
4.微生物学研究：可以通过实时qPCR检测微生物的数量和动态变化，了解其在环境中的分布和生物地理学特征，以及其在食品安全、环境保护等方面的应用。
实时荧光定量pcr检测核酸的原理
实时荧光定量pcr检测核酸的原理实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，RT-qPCR）是一种基于聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的技术，能够快速、准确地定量检测核酸。
RT-qPCR的原理基于PCR的扩增和荧光信号的监测。
PCR是一种通过反复复制DNA片段的方法，它由DNA模板、引物和DNA聚合酶组成。
引物是专门设计的短链DNA片段，它们能够在目标DNA序列的两端精确结合并指导DNA聚合酶的复制。
PCR的循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，双链DNA被加热至94-98℃，使其解离成两条单链DNA。
在退火步骤中，引物与单链DNA特异性结合。
在延伸步骤中，DNA聚合酶沿着单链DNA模板合成新的DNA链。
每一个PCR循环会使目标DNA的数量翻倍，经过多个循环，目标DNA的数量会大幅增加。
RT-qPCR通过引入荧光探针实现对PCR扩增产物的实时检测。
荧光探针也是一种短链DNA片段，其中包含一个荧光染料和一个荧光信号抑制器。
荧光信号抑制器通过与荧光染料的近距离接触，抑制了荧光信号的发射。
当荧光探针与PCR扩增产物结合时，荧光信号抑制器与荧光染料分离，荧光信号得以释放。
通过荧光信号的增加可以判断PCR扩增产物的数量。
RT-qPCR的步骤包括样品处理、反转录、PCR扩增和荧光信号检测。
首先，需要从待检测样品中提取出核酸。
然后，通过反转录酶将RNA转录成cDNA，以便后续PCR扩增。
接下来，将引物、荧光探针和PCR反应液与样品一起加入PCR扩增管中。
PCR扩增过程中，荧光探针与PCR产物结合，并释放荧光信号。
PCR扩增和荧光信号检测是在同一反应管中进行的，所以可以实现实时监测。
最后，根据荧光信号的强度，可以计算出PCR扩增产物的初始数量。
RT-qPCR具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点。
它可以在短时间内检测到低浓度的核酸，并且能够区分不同的核酸序列。
实时荧光定量PCR原理
实时荧光定量PCR原理1.PCR基本原理PCR通过在不断循环的体系中复制和放大特定DNA片段，从而实现DNA的快速扩增。
PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，DNA的双链结构被解开，形成两条单链DNA。
在退火步骤中，引物与目标DNA的互补序列结合，形成引物-目标DNA结合复合物。
在延伸步骤中，DNA聚合酶通过追加互补碱基，并使用引物作为起始点，在目标DNA的基础上合成新的DNA链。
实时荧光PCR是对传统PCR技术的改进，它通过添加荧光探针（也称为探针引物）来实时监测PCR反应的进程。
荧光探针通常由两部分组成：一个荧光标记物和一个定向增效子。
在PCR反应的延伸步骤中，荧光探针与目标DNA的互补序列结合，并被PCR酶切割，导致荧光信号被释放。
3.原理图解实时荧光PCR通常需要使用一个双喷嘴热循环仪（Thermal Cycler），其中一个喷嘴用于控制样品的温度，另一个喷嘴用于实时监测PCR反应的进程。
具体的PCR反应流程如下：-备制PCR试剂：将PCR反应所需的试剂混合均匀，包括DNA模板、引物、荧光探针和内参物。
-生成PCR产物：通过一系列的循环反应，将DNA模板放大成大量的PCR产物。
-荧光信号监测：PCR反应过程中，荧光探针与PCR产物的结合会释放荧光信号。
实时荧光PCR系统通过探测和记录PCR反应体系中的荧光信号，并在每个循环结束时测定信号强度。
4.数据解读和PCR效率计算实时荧光PCR的结果通常以荧光信号的周期阈值（Ct值）表示，Ct值是荧光信号强度超过背景噪音的循环数。
Ct值越低，表示PCR产物浓度越高，反之亦然。
根据Ct值，可以计算PCR的效率。
效率（E）的计算公式为：E =10^(-1/slope) - 1，其中slope为荧光曲线的斜率。
效率越接近1，表示PCR反应越有效。
5.RT-qPCR的应用RT-qPCR可应用于多个领域，包括基因表达分析、病原体检测和药物开发等。
实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用
病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 •相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究
RT-PCR技术的数据分析 相对定量通过内标定量
内标（Endogenous Control） 通常是18S、28S、β-actin、GAPDH基因等看家基因
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR反应体系 模板 4.5μl Tag mixture 5.0μl F(F’) 0.25μl R(R’) 0.25μl
荧光染料
SYBR Green I
荧光标记的探针TaqMan探针法
RT-PCR技术的原理及试验流程
Monitoring PCR with the SYBR Green I Dye（SYBR Green 法）
克服了普通PCR：1、终点定量重复性不好 2、EB有毒，荧光太贵等缺点
实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。
RT-PCR技术的原理及试验流程
在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才能够 被检测到，一般以15个循环的荧光信号作为荧光本底 信号。
RT-PCR技术的数据分析
扣 除 背 景 荧 光 后 的 相 对 荧 光 量
如何定量？-ΔΔCt
PCR扩增循环数
2. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 — — Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是： 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的 循环数（如图所示）。
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。
它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。
二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。
实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。
根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。
实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。
三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。
（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。
实时荧光定量pcr的原理及应用
实时荧光定量PCR的原理及应用1. 简介实时荧光定量PCR（Real-time quantitative polymerase chain reaction，简称qPCR）是一种强大的分子生物学技术，能够在同一反应体系中完成DNA扩增和定量，具有高灵敏度、高特异性和高精确性的优势。
本文将介绍实时荧光定量PCR 的原理和应用。
2. 原理实时荧光定量PCR基于传统PCR技术的基础上，引入荧光染料或探针来实时监测PCR反应过程中产生的增量扩增DNA量。
其原理如下：1.DNA模板的变性：通过加热将DNA模板的双链DNA变性成两个单链。
2.引物结合：待扩增的特定DNA序列的引物（Forward primer和Reverse primer）与模板DNA的互补序列结合。
3.DNA聚合酶扩增：DNA聚合酶沿着模板DNA链酶解附近的单链DNA，并将新的DNA链合成。
4.荧光信号监测：引入特定的荧光染料（如SYBR Green）或探针（如TaqMan探针），实时监测PCR反应体系中DNA扩增量的变化。
5.数据分析：使用特定的PCR仪器记录和分析荧光信号，根据荧光信号的变化量确定目标DNA序列的起始量。
3. 应用实时荧光定量PCR技术在许多领域中有广泛的应用，主要包括以下方面：3.1 疾病诊断与检测实时荧光定量PCR可以用于快速检测和诊断各种疾病，例如：•新型冠状病毒（COVID-19）检测•癌症标志物的检测•细菌和病毒感染的检测•遗传性疾病的检测3.2 基因表达分析实时荧光定量PCR可以用于研究基因的表达水平，包括：•基因表达差异分析•基因调控网络的研究•基因表达谱的分析•转录因子的研究3.3 环境监测实时荧光定量PCR可以应用于环境监测领域，用于检测和量化环境中的微生物和污染物，例如：•水质监测中细菌和病毒的检测•土壤中污染物降解菌的鉴定和定量•空气中微生物的检测3.4 遗传学研究实时荧光定量PCR在遗传学研究中也有广泛的应用，包括：•DNA定量和质量检测•突变检测和鉴定•群体遗传学分析•基因组学研究4. 总结实时荧光定量PCR技术是一种准确、高效、灵敏的分子生物学技术，广泛应用于医学、生物学、环境科学和农业等领域。
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RT-PCR技术的数据分析
相对定量通过内标定量
内标（Endogenous Control） 通常是18S、28S、β-actin、GAPDH基因等看家基 因
在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定， 受环境因素影响小
内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组 数量
RT-PCR技术的数据分析 PCR分四个阶段
SYBR Green法优缺点
RT-PCR技术的原理及试验流程
Monitoring PCR with TaqMan（ TaqMan法）
RT-PCR技术的原理及试验流程
TaqMan法
RT-PCR技术的原理及试验流程
TaqMan探针法优缺点
RT-PCR技术的数据分析
•绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 •相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究
扣 除 背 景 荧 光 后 的 相 对 荧 光 量
PCR扩增循环数
2. Ct 值的定义
在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 —
— Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：
每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的
循环数（如图所示）。
RT-PCR技术的数据分如析 何定量？-ΔΔCt
5.0μl
F(F’)
0.25μl
R(R’)
0.25μl
荧光染料 SYBR Green I 荧光标记的探针TaqMan探针法
RT-PCR技术的原理及试验流程
Monitoring PCR with the SYBR Green I Dye（SYBR Green 法）
变性
退火
延伸
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR技术的数据分如析 何定量？-ΔΔCt
扣 除 背 景 荧 光 后 的 相 对 荧 光 量
PCR扩增循环数
1. 荧光域值（threshold）的设定
在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才能够 被检测到，一般以15个循环的荧光信号作为荧光本底 信号。
RT-PCR技术的数据分如析 何定量？-ΔΔCt
实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR) 的原理与应用
实时荧光定量PCR目录 Contents
一、实时荧光定量PCR的定义 二、RT-PCR技术的原理及试验流程 三、RT-PCR技术的数据分析
四、RT-PCR技术的应用
实时荧光定量PCR的定义
普 通
PCR
PCR
电泳
在PCR结束后对 终点产物 进行定量分析
RT-PCR技术的数据分析
SYBR Green 熔解曲线分析
ห้องสมุดไป่ตู้
谢谢大家！
RT-PCR技术的数据分析
RT-PCR技术的数据分析
相对定量分析方法 -ΔΔCt
前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近 100％且偏差在 5％以内 1、用目标基因的CT值减内参基因的CT值： ΔCT（test)= CT （target, test) - CT （ref, test) ΔCT（control)= CT （target, control) - CT （ref, control) 2、用试验样本的ΔCT值减校准样本的ΔCT 值：
？ 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和
相应的为软 什么选择对初始模板定量 件分析结果，而对不待是测样终品产的物初定始模量板进行定量或
定性分析。
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR反应体系
模板
4.5μl
Tag mixture
标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
RT-PCR技术的数据分析
3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存
在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝 数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对 数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从 标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR 产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和 相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或 定性分析。
实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR 产物进行
扣 除 背 景 荧 光 后 的 相 对 荧 光 量
PCR扩增循环数
3. Ct值与起始模板的关系
研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存
在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝
数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对
数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从