30种氨基酸同时定量检测方法及试剂盒制备汇编
氨基酸（AA）含量检测试剂盒说明书可见分光光度法
氨基酸（AA）含量检测试剂盒说明书可见分光光度法氨基酸(AA)含量检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号:BC1570规格:50T/48S产品内容：试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1瓶（棕色），4℃避光保存。
临用前加入4mL无水乙醇，盖紧后充分混匀，再加入56mL 蒸馏水混匀，避光保存。
试剂四：粉剂×1瓶，4℃避光保存。
临用前加5mL蒸馏水，充分溶解。
标准品：粉剂×1瓶，10mg半胱氨酸，4℃避光保存。
临用前加入8.26mL蒸馏水，得到10μmol/mL的半胱氨酸标准溶液备用。
产品说明：动物肝脏、肾脏是氨基酸代谢的主要器官，故尿中氨基酸的变化最能反应肝、肾的生理状态。
另外，氨基酸还能反应灼伤、伤寒等方面情况。
植物体内氨基酸含量对研究植物在不同条件下及不同生长发育时期氮代谢变化、植物对氮素的吸收、运输、同化及营养状况等有重要意义。
氨基酸的α-氨基可与水合茚三酮反应，产生蓝紫色化合物，在570nm有特征吸收峰；通过测定570nm 吸光度，来计算氨基酸含量。
试验中所需的仪器和试剂：台式离心机、可见分光光度计、水浴锅、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、无水乙醇、冰和蒸馏水。
操作步骤：一、粗酶液提取：(1)组织样本：称取约0.1g组织，加试剂一1mL，室温下充分研磨，转移到1.5mL EP管中，盖紧后（防止水分散失）置于沸水浴提取15min；自来水冷却后，10000rpm，4℃离心10min，取上清液，待测。
(2)细菌或细胞样本：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL试剂一，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次）；10000rpm，4℃离心10min，取上清液，待测。
二、测定步骤：1、分光光度计预热30min以上，调节波长至570nm，蒸馏水调零。
高效液相色谱—串联质谱法测定人体内30种氨基酸
高效液相色谱—串联质谱法测定人体内30种氨基酸作者：李鹏飞等来源：《分析化学》2013年第09期摘要：建立了以12种同位素标记氨基酸做内标，采用衍生化方法，LC-MS/MS采用MRM方式同时定量30种氨基酸的检测方法。
生物样本加入含有同位素内标的甲醇溶液，沉淀蛋白后氮气吹干加入衍生试剂，样本氨基酸与同位素氨基酸内标同步衍生，减小实验误差。
选用TC-C18色谱柱，以水-乙腈（均含有0.01%七氟丁酸和0.1%甲酸）为流动相，采用梯度洗脱进行分离，30种氨基酸及其中的同分异构体都能基线分离。
选用3200QTRAP型质谱仪的多重反应监测（MRM）扫描方式进行检测。
本方法用于实时监测恶性血液病患者血浆氨基酸谱的变化，可以直接反映机体的代谢及营养状况，对患者的移植成功率及改善移植后患者的生存质量均有重要意义。
关键词：高效液相色谱-串联质谱；氨基酸；高通量定量；同位素内标；恶性血液病1 引言氨基酸是生命的基石，是人体基本营养物质，也是蛋白质的组成单位。
生命的产生、存在和消亡，均与蛋白质有关，而氨基酸是蛋白质的基本单位，如果人体缺乏氨基酸，就会导致生理功能异常，影响机体代谢的正常进行，导致疾病。
检测复杂样本中氨基酸的含量对临床和科研等都具有重要意义。
目前，氨基酸检测技术繁多，1958年Spackman等首先提出了用阳离子交换色谱与柱后茚三酮衍生结合的方法分析蛋白质中的氨基酸[1]，实现了氨基酸分析的自动化[2]。
其后，新的氨基酸分析方法不断涌现，柱前衍生反相高效液相色谱法[3～5]、毛细管电泳法[6]、质谱法等相继应用于氨基酸分析[2，7～14]。
液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/MS）充分整合了液相色谱对复杂样本的高分离能力与质谱的高选择性、高灵敏度等优势，在生物体内源性小分子定性与定量方面有广泛应用，LC-MS/MS用于体内外氨基酸的检测在一定程度上解决了复杂基质干扰问题，极大地提高了检测水平和检测灵敏度，并实现了高通量检测。
氨基酸定量方法和氨基酸定量用试剂盒[发明专利]
![氨基酸定量方法和氨基酸定量用试剂盒[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/e02a8efba300a6c30d229f2f.png)
专利名称：氨基酸定量方法和氨基酸定量用试剂盒
专利类型：发明专利
发明人：中柄朋子,青木秀之,喜田干子,山田健太,金子昌二,钉宫章光
申请号：CN201780021302.9
申请日：20170328
公开号：CN109073590A
公开日：
20181221
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供使用氨酰tRNA合成酶(AARS)选择性且简便、高灵敏度地定量测定对象的氨基酸(L型和/或D型氨基酸)的方法和氨基酸定量用试剂盒。
上述氨基酸定量方法，其特征在于：在使用AARS定量样品中的氨基酸量(L型和/或D型氨基酸)的方法中，通过使AARS和氨基酸从一度形成的氨酰AMP‑AARS复合体中游离、并将它们再次用于氨酰AMP‑AARS复合体的形成，最终产生达到比样品中所含的氨基酸多的摩尔数的作为测定对象的焦磷酸等反应产物；以及用于实施该方法的氨基酸定量用试剂盒。
申请人：池田食研株式会社,公立大学法人广岛市立大学
地址：日本广岛县
国籍：JP
代理机构：中国专利代理(香港)有限公司
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氨基酸测定方法
4。
1 光度分析法［5] ［6]β-氨基丙酸和茚三酮溶液在弱酸的条件下可以生成蓝紫色物质[7]，其颜色深浅主要与β-氨基丙酸的浓度有关。
因此可利用此显色反应采用比色法定量测量β—氨基丙酸。
我在实验中发现很多因素如浓度、pH 值、反应温度、以及反应时间等对此显色反应有很大的影响.如忽视这些因素会使实验产生很大的误差.就此显色反应的最佳条件我做了初步的探究.4.1。
1试剂的配制：缓冲液的配制:配制pH= 6。
00的NaAc －HAc 缓冲溶液β—氨基丙酸标准溶液的配制：用电子天平准确称取1。
020 g β-氨基丙酸（生化纯）,溶于250ml pH=6.00缓冲溶液中，得到C = 4.080 g/L 标准溶液.茚三酮试剂的配制：称取0.5g 茚三酮溶于100ml 蒸馏水中,得到5g/L 的茚三酮水溶液。
4.1。
2标准曲线的确定分别准确移取0.30ml 、0。
40ml 、0。
50ml 、0.60ml 、0.70ml 、0。
80ml 、0.90ml 、1。
00ml 标准液于8个比色管中，用pH=6.00的缓冲溶液稀释到5.00ml 再加入1ml 茚三酮水溶液充分摇匀，将其放在沸水浴中加热10min 。
冷却到室温，用7230型分光光度计在569nm 下测其吸光度.以吸光度和浓度作一个标准曲线。
4。
1。
3样品的测定稀释待测液于0.24mg/ml-0.73mg/ml,调pH 值到6.00，以相同的反应条件，测其吸光值并与上面的标准曲线对照查出稀释液的浓度，再乘以稀释倍数即为β-氨基丙酸的浓度。
4.1.4 标准曲线的测定结果β-氨基丙酸浓度在0.24mg/ml —0.73mg/ml 范围内与茚三酮水溶液反应，颜色表现出由浅蓝到深蓝的递增变化。
用茚三酮比色法测得的一组数据得到的标准曲线如图1：吸光度加入标液体积(ml)图 1 标准曲线的测定Fig 1 Determination of the standard curve注:在沸水中加热10min ，β—氨基丙酸标准溶液5ml 、茚三酮水溶液1ml 、缓冲溶液pH=6.004.1。
实验一 氨基酸总量的测定(发园艺.设施等)
实验一植物组织中氨基酸总量的测定(茚三酮比色法)一、目的意义和要求：二、原理：三、植物材料：1、发芽水稻种子：用水(对照)、50mmol/L NaCl和500mmol/L NaCl溶液分别浸种２天后，室温（28℃）下萌发２天。
2、每组用２种材料，即１种对照和１种NaCl处理。
四、试剂配制 :1.水合茚三酮试剂: 称取0.6克再结晶的茚三酮置烧杯中，加入15毫升正丙醇，搅拌使其溶解。
再加入30毫升正丁醇及60毫升乙二醇，最后加入9毫升pH5.4的乙酸—乙酸钠缓冲液，混匀，贮于棕色瓶，置冰箱中保存备用，10天之内有效。
2. 乙酸—乙酸钠缓冲液（pH为5.4）：称取化学纯乙酸钠54.4克，加100毫升无氨蒸馏水，在电炉上加热至沸，使体积蒸发至原体积的一半。
冷却后加30毫升冰乙酸，用无氨蒸馏水稀释至100毫升。
3. 标准氨基酸：称取80℃下烘干的亮氨酸46.8毫克，溶解在10%的异丙醇中，并用10%异丙醇稀释至100毫升。
取此液5毫升，用蒸馏水稀释至50毫升，即为每毫升含氮5微克的标准液。
4.0.1%抗坏血酸：称取50毫克抗坏血酸溶于50毫升无氨蒸馏水中，随用随配。
五、操作步骤：1、样品制备：称取水稻萌发种子1克于研钵中，加入2ml10%乙酸、石英砂，充分研成匀浆，再加入3ml10%乙酸，研磨均匀后用蒸馏水洗入100ml容量瓶并用蒸馏水定容至100ml。
混匀后用干燥滤纸过滤到三角瓶中备用。
2、标准曲线的绘制：取8支试管，按下表编号、加试剂。
2、样品测定：取3支20ml刻度试管，按下表编号、加试剂。
加完试剂后，混匀，盖上玻塞，置沸水浴中加热15分钟，然后取出放在冷水浴中迅速冷却并经常摇动，使加热时形成的红色逐渐被空气氧化而褪色，直至溶液呈蓝紫色时，用60%的乙醇定容至20毫升，摇匀，用光径为1厘米的比色杯，在波长570nm下测定其消光值，制作标准曲线。
3、样品测定：取2支试管，分别加入2亳升过滤液，加入0.1%抗坏血酸0.1毫升，水合茚三酮3ml,混匀加盖，置沸水浴加热15min，取出后用冷水迅速冷却，用60%乙醇定容至20ml。
氨基酸总量(氨态氮)的测定
氨基酸总量(氨态氮)的测定一、目的与原理：1、了解掌握单指示剂与双指示剂甲醛滴定法测氨基酸总量的方法与原理：二、单指示剂甲醛滴定法：(一)原理：氨基酸具有酸、碱两重性质，因为氨基酸含有-COOH基显示酸性，又含有-NH2基显示碱性。
由于这二个基的相互作用，使氨基酸成为中性的内盐。
当加入甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，其碱性消失，破坏内盐的存在，就可用碱来滴定-COOH基，以间接方法测定氨基酸的量，反应式可能以下面三种形式存在。
（二）试剂(1)40％中性甲醛溶液，以麝香草酚酞为指示剂，用1N NaOH溶液中和。
(2)0.1％麝香草酚酞乙醇溶液。
(3)0.100N氢氧化钠标准溶液。
(三)操作步骤：称取一定量样品(约含20毫克左右的氨基酸)于烧杯中(如为固体加水50毫升)，加2-3滴指示剂，用0.1OON NaOH溶液滴定至淡蓝色。
加入中性甲醛20毫升，摇匀，静置1分钟，此时蓝色应消失。
再用0.1OON NaOH 溶液滴定至淡蓝色。
记录两次滴定所消耗的碱液毫升数，用下述公式计算计算：氨基酸态氮(％)=( N V×0.014×100)/W式中：N：NaOH标准溶液当量浓渡。
V：NaOH标准溶液消耗的总量(m1)W：样品溶液相当样品重量(克)。
0.014：氮的毫克当量。
三、双指示剂甲醛滴定法：(一)原理：与单色法相同，只是在此法中使用了两种指示剂。
从分析结果看，双指示剂甲醛滴定法与亚硝酸氮气容量法(此法操作复杂，不作介绍)相近单色滴定法稍偏低，主要因为单指示剂甲醛滴定法是以氨基酸溶液PH值作为麝香草酚酞的终点。
PH值在9.2，而双指示剂是以氨基酸溶液的PH 值作为中性红的终点，PH值为7.0，从理论计算看，双色滴定法较为准确。
(二)试剂：(1)三种试剂同单指示剂法(2)0.1％中性红(50％乙醇溶液)(三)操作步骤：取相同的两份样品，分别注入100毫升三角烧瓶中，一份加入中性红指示剂2-3滴，用0.100N NaOH溶液滴定终点(由红变琥珀色)，记录用量，另一份加入麝香草酚酞3滴和中性甲醛20毫升，摇匀，以0.100NNaOH 准溶液滴定至淡蓝色。
总氨基酸的测定方法
总氨基酸的测定方法
嘿，咱今儿就来聊聊总氨基酸的测定方法！这可是个挺有意思的事
儿呢。
你想想看，氨基酸就像一群小精灵，在我们的身体里跑来跑去，发
挥着各种重要的作用。
那要怎么知道它们一共有多少呢？这就需要一
些特别的方法啦。
比如说比色法，就好像是一个超级侦探，能通过颜色的变化来找出
氨基酸的踪迹。
把样本和一些试剂放在一起，然后观察颜色的变化，
就可以大致知道氨基酸的量啦。
这是不是很神奇呀？
还有茚三酮显色法，它就像是一个魔法棒，能让氨基酸显现出独特
的色彩。
当茚三酮和氨基酸相遇，哇哦，就会产生奇妙的反应，让我
们能清楚地看到它们的存在。
另外呢，高效液相色谱法也很不错哦。
它就像一台精准的仪器，能
把各种氨基酸一个一个地分辨出来，然后准确地告诉我们它们的含量。
那这些方法难不难呢？其实呀，只要你用心去学，就会发现也没那
么难啦。
就像学骑自行车一样，一开始可能会摇摇晃晃，但多练习几
次就会啦。
你说，如果没有这些测定方法，我们怎么能更好地了解氨基酸在我
们身体里的情况呢？怎么能知道该怎么补充它们，让我们更健康呢？
这些方法不只是在实验室里有用哦，在很多领域都能派上用场呢。
比如在食品行业，能帮助我们检测食品中的氨基酸含量，让我们吃得更放心。
在医学领域，更是能帮助医生诊断疾病，制定治疗方案呢。
所以呀，总氨基酸的测定方法可真是太重要啦！咱可得好好了解了解，说不定哪天自己也能动手测一测呢！这难道不是一件很有趣的事情吗？你难道不想去尝试尝试吗？。
AccQ-Tag法测氨基酸含量SOP
AccQ-Tag法测氨基酸含量1.所需设备及试剂1.1.设备：a.天平（精度0.1mg）；b.pH计（精度0.01级）；c.单标线吸管（50ml）；d.容量瓶（500ml）；e.溶剂过滤器及滤膜（0.45µm）；f.试管（1.5×15cm，1.5×10cm）；g.样品管（6×50mm）；h.微量进样器（10µl）；i.微量可调移液器（20µl，100µl，1000µl）及吸头；j.旋涡混匀器；k.烘箱（55℃）；l.HPLC系统及AccQ-Tag柱。
1.2.试剂：a.超纯水（≥18MΩ∙cm）；b.乙腈（HPLC级）；c.Waters AccQ-Tag流动相A浓液d.Waters氨基酸水解液标准（H）；e.Waters AccQ-Fluor试剂盒（包括硼酸缓冲液1、衍生剂粉2A、稀释液2B）。
2.流动相A制备：吸取50ml Waters AccQ-Tag流动相A浓液，放至500ml容量瓶中，加超纯水至刻度，用0.45µm滤膜过滤后备用。
3.衍生3.1.标定标准制备3.1.1.1mmol/L色氨酸标准液：称取色氨酸（生化试剂）20.4mg，加超纯水溶解至100ml。
3.1.2.含色氨酸的标定标准：取1支Waters氨基酸水解液标准，打开后吸取1ml，放至一支干净的1.5×15cm试管中，加2.5ml色氨酸标准液，6.5ml超纯水，旋涡混匀，每支Eppendorf 管分装1ml备用。
（此标准含有的色氨酸的浓度与其它氨基酸一样，为0.25mmol/L。
）3.1.3.10倍稀释后的标准可在–20℃保存1个月。
剩余的氨基酸水解液标准可在–20℃保存3个月。
未启封的氨基酸水解液标准可在4℃保存1年。
使用–20℃保存的标准应充分解冻并混匀。
3.2.衍生试剂制备3.2.1.将烘箱预热至55±1℃；3.2.2.取一瓶衍生剂粉2A，轻轻敲动以确保打开前所有粉末落在瓶底；3.2.3.吸取1ml稀释液2B并弃去以冲洗一个干净的微量移液吸头；（警告：稀释液2B为乙腈，可燃且有毒，参考安全数据表。
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专利中文英语查找前案讨论此申请查看PDFPDF下载公CN103163226 A开号发布申请类型专利申CN 201110417088 请号公2013年6月19日开日申请2011年12月14日日期优2011年12月14日先权日公开号201110417088.3, CN 103163226 A, CN 103163226A, CN 201110417088, CN-A-103163226, CN103163226A, CN103163226A, CN201110417088, CN201110417088.3发明者刘丽宏, 李鹏飞, 李丹, 张绪得, 陶蓓蓓申请人刘丽宏, 李鹏飞, 李丹导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan被以下专利引用(4), 分类(2), 法律事件(3)外部链接: 中国国家知识产权局, 欧洲专利数据库 (Espacenet)30种氨基酸同时定量检测方法及试剂盒制备CN 103163226 A摘要本发明提供一种高灵敏和高通量的30种氨基酸同时定量检测试剂盒及其制备方法。
复杂样本中氨基酸经有机溶剂提取处理后采用甲醇沉淀并加入稳定同位素标记的氨基酸内标，用盐酸正丁醇衍生化处理，吹干复溶后，采用C18键合相硅胶为固定相，以含七氟丁酸和甲酸的乙腈水为流动相进行反相色谱梯度分离，运用质谱仪进行定量检测。
本发明的试剂盒，测试灵敏度可达到10ng/ml，各项方法学指标均可满足氨基酸临床检验、工业生产和科学研究等定量需要。
权利要求(8)1.一种高灵敏30种氨基酸同时定量检测试剂盒，其特征在于由特定浓度的稳定同位素内标样本、质控样本、衍生化试剂、流动相调节液组成。
2.根据权利I所述的30种氨基酸同时定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤:(1)稳定同位素内标冻干粉的制备；(2)质控样本的配制；(3)衍生化试剂的制备；(4)流动相调节液的配制。
3.—种30种氨基酸同时定量检测方法，包括: (1)浓缩储备液和日常工作液的配制: 取“稳定同位素内标冻干粉”用有机溶剂充分溶解，混匀，即为浓缩储备液，使用效期I个月；浓缩储备液用有机溶剂稀释适宜倍数，即为日常工作液，使用效期I周。
(2)样本预处理: 取一定量的样本，加入日常工作液，涡流，高速离心取上清液，吹干或冻干或挥干，加入适量的衍生化试剂衍生化一定时间，吹干或冻干或挥干，加入复溶液复溶。
(2)液相分离: a.采用C18、C8或氰基键和硅胶作固定相；b.流动相:甲醇；乙腈；乙酸；甲酸；三氟乙酸；七氟丁酸；乙酸铵；甲酸铵；二乙胺•’三乙胺；等度或梯度洗脱；控制流速。
(3)质谱测定:电喷雾离子源；大气压化学电离源；正离子方式。
4.根据权利3所述的30种氨基酸同时定量检测方法，其特征在于同时定量检测30种氨基酸(精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天门冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、缬氨酸、甘氨酸、酪氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、Y-氨基丁酸、丝胺酸、牛磺酸、脯氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、α-氨基正丁酸、肌氨酸、δ-羟基赖氨酸、羟基脯氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、焦谷氨酸)中的一种或多种，包含且不限于此30种氨基酸。
5.根据权利3所述的30种氨基酸同时定量检测方法，其特征在于用乙腈、甲醇、三氯醋酸或高氯酸等蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀。
6.根据权利3所述的30种氨基酸同时定量检测方法，其特征在于用盐酸正丁醇进行衍生化处理。
7.根据权利3所述的30种氨基酸同时定量检测方法，其特征在于用稳定同位素内标进行定量检测。
8.根据权利3所述的30种氨基酸同时定量检测方法，其特征在于其所使用的流动相为:甲醇；乙腈；乙酸；甲酸；三氟乙酸；七氟丁酸；乙酸铵；甲酸铵；二乙胺；三乙胺；反相色谱等度或梯度分离。
说明30种氨基酸同时定量检测方法及试剂盒制备所属技术领域[0001] 本发明涉及一种基于液相色谱-串联质谱技术(LC-MS/MS)开发的30种氨基酸同时定量检测试剂盒，更具体地说是采用液相色谱-串联质谱技术对样本中30种氨基酸进行高灵敏度定量检测的方法。
[0002] 本发明还涉及本发明试剂盒的生产方法和应用。
背景技术[0003] 氨基酸(Amino acid)是含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。
自然界中已发现的氨基酸有180多种，人体内重要的氨基酸有30多种。
生命的产生、存在和消亡，无一不与蛋白质有关，而氨基酸正是蛋白质的基本单位，所以如果人体氨基酸发生变化，不在正常值范围内，就会导致生理功能异常，影响机体代谢的正常进行，最后导致疾病。
目前氨基酸代谢障碍所引起的疾病已超过400多种，涉及代谢、肿瘤、免疫、心脑血管、神经系统、肾病、糖尿病、亚健康、老年病等各类疾病和人体生长发育、营养健康、肌肉骨骼生长、激素分泌、解毒功能等各个健康环节。
[0004] 氨基酸在医药上也有广泛应用。
目前用作药物的氨基酸有一百几十种，其中包括构成蛋白质的氨基酸有20种和构成非蛋白质的氨基酸有100多种。
因此，检测复杂样本中氣基酸的含量对临床检验、工业生广和科学研究等都具有重要意义。
[0005] 1958年Spackman等首先提出了用阳离子交换色谱与柱后却三酮衍生结合的方法分析蛋白质中的氨基酸，实现了氨基酸分析的自动化。
其后，新的氨基酸分析方法不断涌现，柱前衍生反相高效液相色谱法、高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法、毛细管电泳法、液相色谱法等相继应用于氨基酸分析。
传统的氨基酸分析技术已很难满足极微量氨基酸的准确和高通量检测需求。
[0006] 液相色谱-串联质谱技术以液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统，样本在液相色谱质谱部分分别被分离及离子化，经检测器得到质谱图，具有高选择性、高灵敏度、样本处理简单和自动化程度高的特点，日渐成为体内外定性和定量分析的实用方法。
研究开发一种结果准确、严格区分同分异构体、分析通量高、价格低廉、操作简便、易于推广的30种氨基酸LC-MS/MS同时定量检测试剂盒，使其能广泛应用于复杂样本中氨基酸临床、科研和工业生产，将有助于提高氨基酸检测质量、促进检测方法标准化和规范化。
发明内容[0007] 本发明的目的在于提供一种高灵敏和高通量的30种氨基酸同时定量检测试剂盒，以满足临床检验、工业生产和科学研究等对氨基酸定量检则的需要。
[0008] 本发明的另一目的在于提供上述试剂盒的制备方法。
[0009] 技术方案[0010] 本试剂盒是一种采用LC-MS/MS测定复杂样本中30种氨基酸(精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天门冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、缬氨酸、甘氨酸、酪氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、Y-氨基丁酸、丝胺酸、牛磺酸、脯氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、α-氨基正丁酸、肌氨酸、δ-羟基赖氨酸、羟基脯氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、焦谷氨酸)浓度的新型试剂盒。
复杂样本中氨基酸经有机溶剂提取处理后采用甲醇沉淀并加入稳定同位素标记的氨基酸内标，用盐酸正丁醇为衍生化试剂进行处理，吹干复溶后上清液进行LC-MS/MS检测，记录氨基酸和内标的峰面积。
根据氨基酸对应稳定同位素内标浓度、样本中的氨基酸/对应同位素内标峰面积比值即可计算出每种氨基酸的浓度。
测定结果为复杂样本中氨基酸浓度。
[0011] 本发明的试剂盒制备过程包括如下步骤:[0012] 1.稳定同位素内标冻干粉:12种稳定同位素标记氨基酸对照品冻干粉(含2H4 ;5-13C-精氨酸、2H3-亮氨酸、2H3-甲硫氨酸、13C6-苯丙氨酸、2H3-天门冬氨酸、2H2-瓜氨酸、2H3-谷氨酸、2H8-缬氨酸、13C6-酪氨酸、2H4-丙氨酸、2H3-鸟氨酸均0.5pmoL ;含15N ；2-13C-甘氨酸2.5pmoL),贴签标记,完成操作。
[0013] 2.质控样本A的配制:精密称取IOmg精氨酸对照品，置IOmL容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，配制成Img.mL—1的精氨酸储备液。
精密量取精氨酸储备液871 μL，置50mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成17.42 μg.πιΓ1的精氨酸(lOOymol/L)质控样本，分装，贴签标记，完成操作。
[0014] 3.质控样本B的配制:精密称取IOmg苯丙氨酸对照品，置IOmL 容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，配制成Img.mL—1的苯丙氨酸储备液。
精密量取苯丙氨酸储备液413 μL,置50mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成8.26 μg *mL_1的苯丙氨酸(50 μmol/L)质控样本，分装，贴签标记，完成操作。
[0015] 4.衍生化试剂组分A:色谱纯正丁醇，分装，贴签标记，完成操作。
[0016] 5.衍生化试剂组分B:12mol/L盐酸，分装，贴签标记，完成操作。
[0017] 6.流动相调节液A的配制:色谱纯甲酸，分装，贴签标记，完成操作。
[0018] 7.流动相调节液B的配制:色谱纯七氟丁酸，分装，贴签标记，完成操作。
[0019] 本发明的试剂盒使用方法如下:[0020] 取10 μL样本置于1.5mL EP管中，加入日常工作液100 μL，13200r/min离心2min。
将离心后的上清液直接转移到另一1.5mL EP 管中，氮气保护下50°C吹干，加入60 μL衍生化试剂，密封，涡旋30s，瞬时离心，65°C孵育15min进行衍生化。
衍生后的溶液再次瞬时离心，在氮气保护下5011C吹干。
加入100 μL复溶液复溶,润旋30s, 13200r/min离心2min,进样5 μL进行LC-MS/MS分析。
[0021] 有益效果[0022] 本发明试剂盒采用LC-MS/MS同时定量检测复杂样本中30种氨基酸的浓度，建立了一种高灵敏度(pmol级)和准确性的30种氨基酸LC-MS/MS定量方法，同分异构体基本都能基线分离，方法操作简单、快速、高通量，可用于临床检验、工业生产和科学研究中样本的检测。
同时，本发明试剂盒首次实现多种氨基酸LC-MS/MS定量检测技术国产化，它的推广应用将有助于提氨基酸检测质量、促进检测方法标准化和规范化。
附图说明[0023] 图1氨基酸样本处理和检测过程[0024] 图230种氨基酸总离子流图[0025] 图3氨基酸同分异构体基线分离图具体实施方式[0026] 1、适用仪器[0027] 液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS)，配备电喷雾离子源(ESI)。
[0028] 2、样本要求[0029] 血浆样本:采集静脉全血样本，置于抗凝管中，采血后立即颠倒混匀5〜6次，于30min以内离心分离血浆，_20°C冰冻保存待测。
[0030] 尿样、脑脊液:取样后直接-20°C冰冻保存待测。