一株高产蛋白酶芽孢杆菌的鉴定

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木糖
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甘露糖
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淀粉水解
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马尿酸盐
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柠檬酸利用
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b
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丙酸盐利用
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还原硝酸盐
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酪素分解
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酪氨酸分解
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注 :“ + ”表示阳性反应 ,“ - ”表示阴性反应 。
对供试菌 BLSY - 1 进行镜检观察和革兰氏染色 ,可 以初步认定该菌属于革兰氏阳性芽孢杆菌 。其各项生理 生化指标检测结果与芽孢杆菌属的其他种 [6 - 7 ]进行比较 情况见附表 。
蛋白酶 ( p rotease)是催化肽键水解的一类酶 ,广泛存 subtillis) CCTCC AB93151:购于武汉大学中国典型培养物
在于动物 、植物和微生物中 ,执行许多不同的生理功能 。 保藏中心 ,经驯化处理保存于本校微生物实验室 ;感受态
蛋白酶种类的多样性和水解活性的专一性 ,使其在食品 、 大肠杆 菌 E. coli DH5a: 由 本 实 验 室 提 供 并 保 存 ; 质 粒
收稿日期 : 2008 - 12 - 25
基金项目 :中国博士后基金项目资助 (20060390775)
作者简介 :刘海军 (1984 - ) ,男 ,在读硕士研究生 ;乐超银 3 ,副教授 ,通讯作者 ,研究方向为分子生物学 。
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最高生长 温度 / ℃
50～55 45～55 45～50 35～45 40～50 60
最低温度 / ℃
15 5～20 5～15 5～10 5～20 10～20
卵磷脂酶
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抗溶菌酶
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b
a
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b
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在 pH5. 7中
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NaCl( 7% )
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抗叠氮化钠
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葡萄糖
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阿拉伯糖
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Abstract: An isolated B acillus strain w ith higher - yield p ro tease was identified system atically through the physio logical and biochem ical detection method and the 16S rRNA sequence analysis. The results showed that the B acillus strain had higher hydrolytic ability and showed positive lecithin2 ase, hippurate. The p rotease activity was still available under 60℃. The homology of 16S rRNA sequence of this strain was up to 99. 63% com2 pared w ith B acillus subtilis EHFS1 - S02Hc. Therefore, the identified B acillus strain m ight be a new subspecies or a biovariety of the species. Key words:m icrobial identification; B acillus strain; 16S rRNA; p ro tease; hydrolytic ability
1 材料与方法 1. 1 材料
1. 2. 1 生理生化试验鉴定 参考细菌鉴定的方法 [1 ] ,并作相应的改进 。
1. 1. 1 菌种
1. 2. 2 16S rRNA 鉴定
BLYS - 1: 筛选自宜昌本地土壤 ; 枯草杆菌 (B acillus
BLSY - 1菌株的总 DNA 的提取 :采用 SDS法 。 [3 ]
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2009 No. 9
1 8 S e ria l No. 210
C h ina B rew ing
Research Report
一株高产蛋白酶芽孢杆菌的鉴定
刘海军 1 ,乐超银 1 3 ,邵 伟 2 ,王 健 1 ,李金鞠 1 ,梁 薇 1
(1. 三峡大学生物技术中心 ,湖北 宜昌 443002; 2. 三峡大学 化学与生命科学学院 ,湖北 宜昌 443002)
由附表可以看出 ,将供试菌的生理生化指标和其他的 几种典型芽孢杆菌相比 ,发现该供试菌和枯草芽孢杆菌 、 地衣芽孢杆菌 、短小芽孢杆菌 、多粘芽孢杆菌及浸麻芽孢 杆菌有很大的相似性 ,而且更接近于枯草芽孢杆菌 。仅单 纯的生理生化指标而言 ,供试菌和枯草芽孢杆菌的生理特 性极其相似 ,但供试菌对马尿酸盐和卵磷脂酶的利用呈阳 性 ,而枯草芽孢杆菌是呈阴性的 。初步认为该供试菌可能 为芽孢杆菌属下的一个种或亚种 。 2. 2 供试菌蛋白酶水解能力的测定结果
Iden tif ica tion of h igh - y ield prote in produc ing B a c illus stra in
L IU Haijun1 , YU E Chaoyin13 , SHAO W ei2 , WAN G J ian1 , L I J inju1 , L IAN G W ei1
研究报告
中 国 酿9
16S rRNA 序列的 PCR 扩增体系 : 以 BLSY - 1 的总 DNA 为模板 , 引 物 见 1. 1. 3, 反 应 体 系 为 25μL: 双 蒸 水 15. 5μL ,Mg2 + ( 25mmol/L ) 2. 0μL , dNTP ( 2. 5mmol/L ) 2. 0μL ,引物 一 ( 25μmol/L ) 1. 0μL , 引物 二 ( 25μmol/L ) 1. 0μL , TaqDNA 聚合酶 ( 5U /μL ) 0. 5μL , 10 ×buffer solu2 tion ( 20mmol/L ) 2. 5μL。反应条件 : 94℃预变性 5m in, 30 个 循 环 ( 94℃、30 s、53℃、1m in, 72℃、2m in ) 72℃ 延 伸 10m in。 2 结果与分析 2. 1 生理生化实验结果及分析
附表 供试菌 BLS Y - 1 和其他芽胞杆菌的生理生化比较 A tta che d ta b le. Com p a riso n o f p hys io lo g ica l a nd b io chem ica l inde x be 2
tw e e n BLS Y - 1 a nd o the r B a c illu se s
菌种 特征
地衣芽 枯草芽 短小芽 多粘芽 浸麻芽 供试菌
胞杆菌 胞杆菌 胞杆菌 胞杆菌 胞杆菌
运动性
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过氧化氢酶
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厌氧生长
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V. P反应
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V. P中的 pH值 5. 0～6. 5 5. 0～8. 0 4. 8～5. 5 4. 5～6. 8 4. 5～5. 0 5. 6
将 YSBL - 1 和枯草芽孢杆菌分别接种于水解酪蛋白 培养基上 , 37℃培养 ,并于不同时间观察其菌落直径和水 解透明圈的大小 ,结果见图 1。
图 1 菌落和透明圈随时间变化 F igu re 11C ha nge o f the s tra in co lo ny a nd tra n sp a re n t c irc le
用不同的蛋白酶或相关的产酶微生物可以制备各种活性 0. 5g,琼脂 2g, 蒸馏 水 100mL , 1mol/L NaOH 调 pH 值 为
多肽 。有关研究表明 ,利用蛋白酶水解大豆蛋白 (或是直 7. 0, 121℃灭菌 30m in。
接用微生物发酵 [2 ] ) 获得的大豆多肽能够有效抑制血管
皮革 、洗涤剂等工业生产领域成为具有重要商业价值的工 pMD18 - T:购自 Takara生物公司 。