白芨组织培养实施方案

白及组织培养实施方案

一、白及简介

白及为兰科白及属多年生草本植物，又名甘根、连及草、地螺丝、羊角七、皲口药、利知子、刀口药、鱼眼兰等。分布在中国、日本以及缅甸北部，主产于贵州、四川、湖南、湖北、安徽、河南、浙江、陕西等地。其味苦、甘、涩,性凉,归肺、胃、肝经。以块茎供药用，能收敛止血，消肿生肌；治肺结核咳血，支气管扩张咯血、胃溃疡吐血、尿血、便血等症。外用治外伤出血、烧烫伤、手足皲裂等症。块茎含黏液质和淀粉等，可作糊料，在生物医药、保健食品、纺织印染、特种涂料和日用化工等方面有巨大的商业利用价值。又因白及为地生兰的一种，花开艳丽，被作为庭院、居室及园林景观绿化苗木大量应用。

白及一般生于海拔110——3200m的山野、山谷较潮湿处或林下半遮阴地带，喜温暖、稍阴湿的环境，耐阴性强，忌强光直射，需排水良好、富含腐殖质的砂质土壤，稍耐寒，冬季可在地下越冬。白及能产生大量的种子(每个蒴果10～30万粒)，但这些种子没有胚乳，自然萌发率极低，繁殖困难，但白及胚的薄壁细胞贮存大量的蛋白质、油脂和碳水化合物，可作为种子萌发的营养成分，因此白及种子在保湿的情况下可以萌发，是兰科植物中种子易萌发的类型。传统的白及繁殖方法大多以分株为主，即将块茎分成小块种植，但繁殖系数低，大面积发展对种源消耗大，不宜推广且难以满足市场需求。

采用白及组织培养可在短时间内大量获取种苗，且成本相对较低，是提高白及产量的强有力措施。目前，国内研究资料报道的白及组织培养方法各异，所采用的外植体各不相同，且培养基及其中所加的植物生长调节剂种类和规格也千差万别。

二、白及组织培养技术路线

参照植物组织组织培养获得再生植株的方式，可通过4种途径获得白及再生植株：一是由愈伤组织形成不定芽再生植株；二是愈伤组织产生胚状体而再生植株；三是由侧芽或顶芽再生植株；四是由茎尖产生原球茎而再生植株。4种方式各有利弊，传统认为采用侧芽或顶芽发育途径获得的后代性状较稳定，但因为白及原球茎带有大量共生菌，组培过程中容易出现污染。

结合卢氏当地实际，探索采用白及无菌播种的技术路线，通过不同浓度和培方的培养基实现白及组织培养的最佳技术路线，建立白及快繁体系。白及组织培养完整的技术路线如下：

经过试验优化后的技术路线为：白及→种子（采集优质种源蒴果）→表面消毒→无菌播种（MS培养基等）→原球茎（分化诱导）→白及小苗（分株、扩繁）→壮苗生根（炼苗）→完整小植株→炼苗20-25天→移栽→白及

三、实验准备：

种子：白及的蒴果中有大量的种子，并且蒴果的消毒较方便，污染率低。另一方面用种子作为外植体操作较容易，并且组培过程中萌发率高，培养的幼苗生长较为迅速，因此，种子作为外植体应用比较广泛，大部分的组培研究都选用种子。本实验选取卢氏本地优质白及（Bletilla striata(Thunb．)Reichb．f．）蒴果，采收时间为8月下旬至9月中旬，此时间段胚龄大约为第8周至第22周。

器材：高压灭菌锅、超净工作台、电子分析天平（精度为千分之一）、电磁炉、接种消毒器、高效能培养架、医用小推车、日光灯、加湿器、紫外灯、晾瓶架、酸度计（或PH试纸）、试管、容量瓶、胶头滴管、试剂瓶、烧杯、试管架、量筒、玻璃漏斗、移液管、三角瓶、广口培养瓶、称量纸、毛刷、洗耳球、塑料筐、无菌脱脂棉、无菌滤纸、酒精灯、喷壶、橡胶手套、医用白大褂、紫外灯、镊子、接种针、剪刀、解剖刀、器械架、接种托盘等。

（1）通用器械

①烧杯：用来盛放、溶解化学药剂等。常用的规格有50 mL、100mL、250mL、500mL、1000mL。

②烘箱：用来烘干器械。

③恒温水浴：用来溶解琼脂等物质。

④玻璃搅拌棒：用来配制培养基。

⑤洗耳球：用来辅助吸取、转移少量液体。

⑥冰箱：用来贮存化学药剂、植物材料等。

⑦牛角勺：用来转移化学药剂。

⑧玻璃漏斗：用来过滤溶液。

⑨剪刀：用来修剪外植体或剪切嫩茎。

⑩器械架：在无菌操作期间用来放置灭菌的器械。

（2）各种盛具

①搪瓷浅盘：用来承载各种器械容器。

②塑料盆：用于清洗培养容器。

③铁丝筐：用来盛放灭菌容器等物品。

④纯水水桶：用来存放去离子水或蒸馏水。常用的规格有10L、20L。

⑤塑料桶：用来存放洗涤溶液、废弃溶液。

⑥各种规格的磨砂玻璃瓶：用来盛放培养母液，以及各种植物生长物质。

（3）计量器械

①量筒：用来量取一定体积的液体。常用的规格有25mL、50mL、100mL、500mL、1000mL。

②容量瓶：用来配制标准溶液。常用的规格有50mL、100mL、500mL、1000mL。

③大肚移液管：用来吸取定量溶液。常用的规格有1mL、5mL、10mL。

④刻度移液管：用来吸取定量植物生长物质溶液。常用的规格有1mL、5mL、10mL (或可用移液器替换) 。

⑤移液管架：用来放置、固定移液管。

⑥酸度计：用来检测培养基的pH。

⑦药物天平：用来称取配制培养基的药品。

⑧分析天平：用来称取少量有化学试剂，进行化学分析。

（4）灭菌器械

①磨砂口玻璃瓶：用来对植物材料进行表面灭菌。

②酒精灯：用来进行接种器材的表面灭菌。

③细菌过滤器：用来过滤不能进行高温灭菌的试剂溶液。

④无菌滤纸：用来汲取器材、植物材料表面的水分。

⑤无菌脱脂棉：用来进行器械、植物材料表面的灭菌处理。

⑥高压灭菌锅：对培养基、接种器材进行灭菌处理。

⑦紫外线灭菌灯：用来对接种室、培养室、操作室等工作环境进行灭菌处理。

（5）接种器械

①超净工作台：用来过滤通过接种工作台面的空气，以便进行无菌操作。

②小型喷雾器：装载灭菌药液，来给超净工作台等处喷雾灭菌。

③钝头镊子：在接种操作、继代培养时移取植物材料。

④尖头镊子：用来分离植物材料。

⑤解剖刀：用来切割植物材料。

⑥接种针：用来转移细胞团、愈伤组织。

（6）培养器械

①试管：用来作为外植体的培养容器。常用的规格有2cm×15cm、3cm×15cm。

②培养皿：用来作为外植体的培养容器。常用的规格有直径9cm、12cm。

③锥形瓶：即三角烧瓶，主要作为培养器材，常用的规格有50mL、100mL。

④铝箔：用于培养容器封口。

⑤橡皮筋：用来束紧培养容器的封口材料。

⑥空调：用来调节操作间、培养室的温度。

药剂：硝酸铵（NH4NO3）、硝酸钾（KNO3）、氯化钙（CaCl2）、硫酸镁（MgSO4?7H2O）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、碘化钾（KI）、硼酸（H3BO3）、硫

酸锰（MnSO4?5H2O）、硫酸锌（ZnSO4?7H2O）、钼酸钠（Na2MoO4）、硫酸铜（CuSO4?5H2O）、氯化钴（CoCl2?6H2O）、乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA?2H2O）、硫酸亚铁（Fe SO4?7H2O）、甘氨酸（C2H5NO2）、肌醇（C6H12O6）、烟酸（VB5）、盐酸吡哆醇（VB6）、盐酸硫胺素（VB1）、6-苄基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）、腺嘌呤（AD）、赤霉酸（CA3）、蔗糖、琼脂

环境：采用组培快繁技术进行白及的工厂化生产，包括外植体的筛选及获取、外植体灭菌诱导培养、无菌材料繁殖、继代扩繁、单株生根、出瓶炼苗、移栽等工艺程序。由于组培苗生产从进瓶到出瓶都是在无菌条件下完成，所以离不开一个无菌环境，但实验室的规模大小需依据生产规模来确定。组培实验室具体设计包括：

1、准备室：(1)进行药品、器具和实验材料的保存、消毒以及培养基的配制、灭菌、分装等。(2)器具的洗涤、干燥、消毒、储藏。(3)生理生化指标的测定等。

2、接种室：进行材料的接种，内置超净工作台，加装紫外线灯灭菌。外设缓冲间放置拖鞋、工作服、工作帽等。

3、培养室：开展白及幼苗的无菌生长提供场所，室内需要有培养架及控制温度、湿度、光照的各种设备。

四、实验流程

1.准备阶段

查阅相关文献，结合实际制订白及组织培养实施方案，根据实验方案配制实验所需的消毒剂和各类母液，确定不同培养阶段培养基配方。

MS培养基与其它培养基的基本成分相比，硝酸盐、钾和铵的含量高，有较高的无机盐浓度，无机养分的数量和比例比较合适，足以满足植物细胞在营养上和生理上的需要，对保证组织生长所需的矿质营养和加速愈伤组织的生长十分有利。MS固体培养基可用来诱导愈伤组织，或用于胚、茎段、茎尖及花药培养，是目前普遍使用的培养基。白及组培选取的培养基即为MS培养基。配制培养基可分为以下几步：

（1）制备母液

为了避免每次配制培养基都要对几十种化学药品进行称量，应该将培养基中的各种成分，按原量10倍、100倍或1000倍称量，配成母液。这样，每次配制培养基时，取其总量的1/10、1/100、1/1000，加以稀释，即成培养液。MS培养基主要包含5种主要成分：

大量元素：大量元素包括硝酸铵等用量较大的几种化合物。制备时，按表中排列的顺序，以其10倍的用量，分别称出并进行溶解，以后按顺序混在一起，最后加蒸馏水，使其总量达到1L，此即大量元素母液。

微量元素：因用量少，为称量方便和精确起见，应配成100倍或1000倍的母液。配制时，每种化合物的量加大100倍或1000倍，逐次溶解并混在一起，制成微量元素母液。

铁盐：铁盐要单独配制。由硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)5.57g和乙二胺四乙酸二钠(Na—EDTA)7.45g溶于1L水中配成。每配1L培养基，加铁盐5mL。

有机物质：主要指氨基酸和维生素类物质。它们都是分别称量，分别配成所需的浓度(0.1～1.0 mg/mL)，用时按培养基配方中要求的量分别加入。

植物激素：最常用的有生长素和细胞分裂素。这类物质使用浓度很低，一般为0.01～10 mg/L。可按用量的100倍或1000倍配制母液，配制时要单个称量，分别贮藏。配制植物生长素时，应先按要求浓度称好药品，置于小烧杯或容量瓶中，用1 mol/L氢氧化钠溶解，再加蒸馏水稀释至所需浓度。配制细胞分裂素时，应先用少量1mol/L的盐酸溶解，然后加蒸馏水至所需量。

以上各种混合液(母液)或单独配制药品，均应放入冰箱中保存，以免变质、长霉。至于蔗糖、琼脂等，可按配方中要求，随称随用。

（2）配制培养基的具体操作

①根据配方要求，用量筒或移液管从每种母液中分别取出所需的用量，放入同一烧杯中，并用粗天平称取蔗糖、琼脂放在一边备用。

②将①中称好的琼脂加蒸馏水300～400mL，加热并不断搅拌，直至煮沸溶解呈透明状，再停止加热。

③将①中所取的各种物质(包括蔗糖)，加入煮好的琼脂中，再加水至L，搅拌均匀，配成培养基。

④用1 mol/L的氢氧化钠或盐酸，滴入③中的培养基里，每次只滴几滴，滴后搅拌均匀，并用PH试纸（或酸度计）测其PH值，直到将培养基的PH值调到

5.8-

6.0。

⑤将配好的培养基，分装到组培瓶中，盖好瓶盖并做好标记，瓶中培养基的量约为20-25mL。

培养基的成分比较复杂，为避免配制时忙乱而将一些成分漏掉，可以准备一份配制培养基的成分单，将培养基的全部成分和用量填写清楚。配制时，按表列内容顺序，按项按量称取，就不会出现差错。

（3）培养基的灭菌与保存

培养基配制完毕后，应立即灭菌。培养基通常应在高压蒸汽灭菌锅内，在压力0.1-0.15Mpa、温度122℃条件下，灭菌15—20min。期间需排出灭菌锅内的冷空气，具体操作方法为：通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出冷空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。

灭菌后的组培瓶取出后整齐摆放在室内，2h后即可冷却凝固成白色半透明状固体，经过灭菌的培养基要在配制后的一周内使用完，在多数情况下，应在灭菌后两周内用完。

2.外植体选择与消毒

选择合适的部位作为外植体，采回后经过适当的预处理，如清除残留的茎秆、剪去干枯的花序、分类筛选等，然后进行消毒处理。白及组织培养采用白及种子无菌播种的方法，因此要采集无杂菌感染、无病虫害、生长健壮的优良白及品种种子。实验选取白及种植基地的白及蒴果备用,蒴果采收时间为8月下旬至9月上旬。

白及蒴果采回后，先用清水洗净，洗衣粉溶液浸泡10min再用清水冲刷洗净，在超净工作台上采用70%乙醇消毒30s，再用0.1%升汞消毒10-15min，用无菌水冲洗3-4次，在滤纸上吸干水分，从果实中部拨开，快速接种到培养基上。无菌播种培养基配方为：MS+6-BA 0.05 mg/L +NAA 0.1-0.5mg/L，其中含蔗糖3%、琼脂粉0.7%、PH5.8。种子萌发条件为昼温20-25℃，夜温18-20℃，暗培养7d 再转入光培养。观察种子萌发情况，以周围统计单位，统计萌发个数及生长情况，发现染菌需及时清理。

如白及蒴果采集数量较多，无法一次性保存，可用报纸逐个包裹后放入冰箱，每周更换报纸避免发霉，在4℃左右可长期保存。

3.丛生芽诱导

无菌播种培养基中种子萌发出现圆球状绿色芽点，及时转入诱导培养基中，萌发大量丛生芽。诱导丛生芽培养基为：MS+6-BA 0.1 mg/L，其中含蔗糖3%、琼脂粉0.7%、PH5.8。

4.生根壮苗培养

刚形成的白及芽苗往往比较弱小，多数无根，此时可降低细胞分裂素浓度或不加，提高生长素浓度，促进小苗生根，提高其健壮度。

待白及丛生芽长到2cm高后分离成单株转入生根培养基中，以每瓶20-30

株为最佳。培养基为：MS+6-BA 0.05 mg/L，其中含蔗糖2%、琼脂粉0.7%、PH5.8。由于分化形成的芽、原球茎数量有限，为了大量获取幼苗，可采用适当的继代培养基（本实验采用MS+ NAA 0.1—0.5mg/L，其中含蔗糖2%、琼脂粉0.7%、PH5.8），经多次分割转接，当芽苗繁殖到一定数量后，再将一部分用于壮苗生根，另一部

分保存或继续扩繁。采用此方法工序较多，产生的人工成本和材料成本较大，故在本实验中不采用。

（5）炼苗移栽

当白及组培小苗在培养瓶中长到3-5cm高时,即可出瓶。一般来说，春季气温逐渐回升,有利试管苗适应自然环境,最宜移栽。为使试管苗移栽后适应自然环境,移栽前要先揭开瓶盖，放在室内自然光下炼苗3-7d，以提高小苗的抗性和适应性。在组培瓶中时间不宜超过2个月，时间过长

出瓶取苗要小心操作，尽量不要折断根部，可用镊子轻夹根部拔出（镊子头部可用棉花捆绑），用软毛刷洗净根部培养基，正常组培苗先在自来水中洗净培养基，特别要洗掉琼脂，以免琼脂发霉引起烂根，再换自来水清洗一次，然后用800-1000倍百菌清或多菌灵液浸泡根部0.2h，待幼苗放在通风阴凉处晾半天，用湿润毛巾盖住叶片，只把根部裸露，至根部发白时即可栽植，移栽前用1000倍生根剂溶液蘸根，植入土壤基质中。深度不宜过深，以入土3-5cm深为宜，使根部自然伸展，轻轻压实，株行距5*5cm。栽好后，浇足定根水，置于阴凉处。注意保持较高的空气湿度(80%-90%)和适当通风，并使环境温度维持在20-25℃。当移栽小苗新叶展开、苗根伸长后, 每月用MS大量元素1000 倍稀释液或花宝一号1000倍稀释液喷施追肥，促进生长发育。待小苗成活后，再移栽到大田。驯化时间3-5个月后等外界气温逐渐回升,有利组培苗适应自然环境，最宜移栽。

因白及喜湿润，怕积水，积水会使根茎腐烂，叶片脱落而死。因此,移栽过程中基质的透气性和保湿性直接决定了白及苗成活率的高低。对白及组培苗移栽基质可以使用珍珠岩30%+膨化蛭石30%+泥炭10%+炭渣10%+新鲜黄土20%等基质均能达到很好的效果，移栽成活率可达90%以上。另外,苔藓（水苔）的保湿性和透气性良好,可作为移栽基质，将其平铺于白及幼苗根部保湿。

关键点：

1、温度

白及适合在温湿的环境中生长，加之白及组培苗长期在温室里面恒温培养，所以白及组培苗适应外界环境中，温度很关键。全国范围从季节上来讲，春季和秋季驯化最为理想。本地种植，在夏季需要降温措施，冬季需要保温措施方可驯化。温度在10℃以上，30℃以下，都能正常生长，20℃左右最为理想。

2、湿度

白及在驯化过程中保持基质湿润即可，下苗的时候浇透定根水，平时视天气3到5天可以喷雾一次，每次喷水不要过多。

3、关照强度

白及组培苗在培养室的强度一般在3000-4000 lux，而外界环境一般在50000 lux以上，中午时甚至接近100000 lux，所以白及组培苗需要逐步适应外界环境。

4、基质

白及属于根茎类植物，为了有个良好的根域环境，需要选用肥沃疏松的基质作为驯化基质。例如：林下腐殖土、杂草秸秆腐熟土、黑色沙壤土加少量锯末等都可以，推荐主要成分使用珍珠岩30%+膨化蛭石30%+泥炭10%。

为了很好的控制白及组培苗驯化的温湿度，需要搭建大棚（棚高2m以上为宜），棚外覆盖遮阳网，随着驯化时间的推移，逐渐揭去遮阳网。大棚建好后，在棚里开沟起垄，宽1.2m。在翻土的时候，喷两到三次杀虫剂，在翻土中看到害虫捕捉杀灭。将垄整平整细后铺上提前准备的驯化基质，然后将组培苗用2-3d 逐渐开瓶，并放在棚里适应7—10d。棚外覆盖遮阳网，视温度情况确定遮阳网层数，温度过高，注意白天通风。