黄连指纹图谱研究概况
黄连解毒汤和不同组方部位群的指纹图谱研究_荆婧
士，研究方向： 中药分析，E － mail： zhangzhenqiu@ sina． com。 陈桂荣（ 1980 － ） ，女，辽宁葫芦岛人，副教授，博士，研究方 向： 中药药效物质基础和作用机制，E － mail： cgr800404 @ sohu． com。
JING Jing，LU Yawen，LIU Lu，ZHANG Zhenqiu，CHEN Guirong （ Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，Liaoning，China）
Abstract： Objective： The method was established for researching fingerprint of Huanlian Jiedu Decoction and herb combination with the aid of the high performance liquid chromatography（ HPLC） ． Methods： The solution of Huanlian Jiedu Decoction and herb combination was prepared and treated with a Agilent TC － C18 column（ 4． 6 mm × 250 mm，5 μm） and acetonitrile（ A） and water（ with 0． 2% phosphoric acid，B） was used as mobile phase． Mobile phase followed as 2% － 22% A for 0 － 20 min and then 22% － 24% A for 20 － 80 min at the rate of 1． 0 mL / min． The detecting wavelength was 260 nm and injection volume of each sample was 10 μL and column temperature was 40 ℃ ． Ｒesults： HPLC fingerprint of Huanglian Jiedu Decoction was developed and 27 chromatographic peaks were found and each characteristic peak was attributed． Conclusion： Each chromatographic peak of HPLC fingerprint was from the single Chinese herb and there was no new characteristic peak in the HPLC fingerprint． It is confirmed that there is a considerable difference between Huanglian Jiedu Decoction and herb combination．
黄连指纹图谱研究概况
黄连指纹图谱研究概况黄连HPLC指纹图谱研究进展姓名：方功学号：211134****班级：中药专硕3班摘要：中药质量标准现代化的模式将是中药化学指纹图谱配合有效成分含量测定和必要的检查项目,较全面地整体控制中药质量，中药指纹图谱研究是中药质量标准现代化研究的关键技术。
本文就黄连HPLC 指纹图谱研究的情况进行归纳综述。
关键词：黄连中药指纹图谱中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。
日本汉方药主要生产企业在20世纪80年代就已经在企业内部采用HPLC指纹图谱控制质量。
我国自2000年8月国家药品监督管理局颁发《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求( 暂行) 》以来, 中药指纹图谱的研究已经成为中药研究的热点。
高效液相色谱法( HPLC) 也在中药成份分离、分析中获得了广泛的应用, 特别是三维高效液相色谱近年来发展迅速, 使得HPLC在中药质量控制中占有重要地位, 被认为是目前检测中药指纹图谱的首选方法。
1.中药HPLC指纹图谱定义中药HPLC指纹图谱系指中药材或中成药经适当处理后, 采取HPLC分析手段, 得到能够标示该中药材或中成药特性的共有峰的图谱。
指纹图谱一般包含两层含义:（1）必须反映出该药材(或成药)有别于其他任何物质;（2）对于中药材,指纹图谱还能反应出产地和采收期不同而造成的差异; 对于中成药, 则能反映出同一产品不同批次间的质量差异, 差异越小说明药材(或成药) 的稳定性越好。
2.黄连HPLC指纹图谱的构建2.1黄连HPLC法分离模式黄连HPLC法分离模式有反相色谱法( RPC) , 正相色谱法( NPC) , 梯度洗脱法, 离子交换色谱法, 分子排阻色谱法( SEC) , 手性HPLC法等。
RPC比较简单方便, 柱性能较好, 是应用最广泛的HPLC法。
在HPLC方法建立时, 应首先试用RPC, 若初步试验证明样品不适合使用RPC分离, 则改为NPC。
中药指纹图谱概述
中药指纹图谱概述中国科学院兰州分院甘肃省天然药物重点实验室邸多隆中药与化学药品的根本区别在于，存在于中药中的任何一种活性成分均不能反映中医用药所体现的整体疗效。
运用先进的现代分析分离手段，将复杂的天然产物分析的越细，目标越缩小，可能离中药整体疗效的距离越远。
中医药理论和实践的非线性特点要求综合评价中药的质量。
中药的化学分析由分解、微观分析向宏观、综合分析发展将成为必然的趋势，色谱指纹图谱分析是对中药及其制剂进行宏观分析的可行手段。
在充分利用现代分离分析仪器对复杂的中药多组分体系进行分离检测和表征的同时，结合化学计量学和计算机技术，最大限度地从中抽取不同特性样本中的化学信息，以整体的、宏观的、模糊的概念表达中药的特性，是指纹图谱独具有的优势。
实现中药现代化首先要解决的问题是中药的现代化标准，即中药可控、可量化的问题，解决这一问题的有效手段便是建立中药的指纹图谱。
一、指纹图谱的涵义广义的指纹图谱包括DNA指纹图谱、波谱指纹图谱和色谱指纹图谱。
常见的指纹图谱主要指波谱或色谱指纹图谱：即采用一定的方法（如HPLC，GC，TLC，HPLC-MS，GC-MS，FTIR，X-ray，UV等），建立特定对象如中药材、提取物、饮片、中药注射液等的有特征性的相对稳定的图谱，所得到的图谱可以作为鉴别和质量控制的参照依据。
这种指纹图谱强调的是“共有特征性”，属狭义的指纹图谱范畴，也属化学指纹图谱，是研究的主要对象。
二、中药指纹图谱的提出中药学是一门历史悠久的传统学科，中药是几千年来我国人民赖以防病治病的重要药物。
随着应用面的日益扩大，许多药材已面临供不应求的状况。
面对这种情况，中药市场出现了混乱，混淆品种、伪劣药材以及人为掺杂时有出现。
如平贝充川贝，棉花根充黄芪，海马中灌水泥、石灰，金银花中掺盐等等，不一而足。
因此，如何区分真伪优劣，保证药品质量已成燃眉之急。
在中药分析和研究中发现，植物药是多种化学成分的混合体，其活性成分大部分都是生物体内次生代谢产物，少数为初生代谢产物，药材本身就有它内在的不稳定性，再加上现阶段的中药农业基本不规范现状，如种植粗放，品种资源、栽培地域以及收获时节混乱，农药和化肥残留等问题的普遍存在，造成中药材生产、质量的波动性较大，难以保证中药质量稳定、疗效可靠。
中药指纹图谱
中药指纹图谱（Finger diagram）在前一阶段的课程中，我们已经讨论了很多控制中药质量的方法.今天我们讨论一个新方法“中药指纹图谱”,请翻到教材的360页。
一建立中药指纹图谱的意义1、中药治疗疾病的物质基础是其中含有的化学成分。
2、中药中的化学成分具有多样性和复杂性、3、任何单一的有效成分或指标性成分均不能反映中药所体现的整体疗效。
阐明中药有效成分成为一个极为困难的研究课题。
近百年来，人们力图从中药中得到能代表、反映中药疗效的有效成分、为此从中药中分离得到大量的各种化合物、如从鸦片中分离得到吗啡和可代因、从麻黄中分离得到麻黄素、从黄连中分离得到黄连素、从麝香中分离得到麝香酮、从板兰根中分离得到靛玉红、靛兰，但迄近为至，能反映中药疗效的不过百种、而且是部分的疗效。
如麻黄的主要功效是止咳、发汗，而麻黄素的仅具有止咳的作用、黄连的主要功效是清热燥湿、泻火介毒、而黄连素的主要作用是治疗泻痢。
这种情况不仅是在中药研究中、国外対天然药物的研究中也是如此、如美国用贯叶连翘治疗抑郁症、用金丝桃苷作为控制质量的指标、而近代的研究表明金丝桃苷并不具有治疗抑郁症的作用，中药产生的疗效，不是单一成分作用的结果，也不是一些成分简单作用的加和，很多的研究表明中药的疗效是多种化学成分综合作用的结果、具有多成分（包括已知和未知的成分）、多途径、多靶点的特点。
用一个或几个活性成分的含量作为指标并不能完全说明中药的内在质量。
4、中药材来源的复杂性和中药制剂生产的不规范性造成了中药制剂质量的波动和临床疗效的不稳定性。
5、现有的中药质量控制方法（显微鉴别法、TLC法、光谱法、色谱法等）还很不完善、尚不能真正反映中药制剂的内在质量。
中药在其漫长的发展过程种，其质量主要依靠药材的道地性和炮制的经验来控制，道地药材，遵古炮制、经验鉴别、师徒相承，1963年版的药典只收录了处方和制法，対检验方法未作任何规定。
1977年版的药典，引入了显微鉴别，近近年的药典虽然引入了大量的定量方法，用一个或几个成分作为指标来控制中药的质量并以此了建立中药的质量标准。
中药制剂检测的新技术中药指纹图谱技术概述 中药制剂检测技术课件
全面检测和控制中药制剂质量
中药指纹图谱
概述
药品安全，重于泰山
中药指纹图谱概述
中药指纹图谱（Fingerprints of Traditional Chinese Medicine）是指中药材 、饮片及其制剂经适当处理后，采用一定的分析方法与技术所建立的能够标识 其化学特征的色谱图或光谱图。
●留样应不少于实验用量的3倍。
中药指纹图谱概述
3. 中药色谱指纹图谱建立的方法与技术要求
（2）供试品溶液的制备
供试品制备的每一步骤均必须标准化操作，以保证样品分析具有良好的精密度、 重现性、准确性及样品间的可比性，主要操作过程及数据应详细记录。
（3）参照物的制备
●一般选取样品中容易获得且含量较高的一个主要活性成分或指标成分作为参照 物。 ●参照物主要用于指纹图谱技术参数的确定，如特征峰（共有峰）的相对保留时 间， 峰面积比值等；并有助于图谱的稳定性、重现性的考查。
①系统性 指纹图谱中反映的化学成分应包括该中药有效部位所含大部分成分，或指
标性成分的全部，如中药两头尖中抗肿瘤的有效成分为皂苷类化合物，则其指 纹图谱应尽可能地反映其中的皂苷类成分；银杏叶的有效成分是黄酮类和银杏 内酯类，则其指纹图谱可采用两种方法，针对这两类成分分别分析，达到系统 全面的目的。
中药指纹图谱概述
课堂互动
请分析指纹图谱技术与传统的定性及定量分析方法有何显著差异? 分析色谱及光谱技术在指纹图谱研究中地位差异？ 作为指纹图谱原始数据的获取来源，紫外光谱法存在哪些优劣方面？
中药指纹图谱概述
小结
1．建立中药色谱特征图谱应满足专属性、重现性和可操作性的要求。 2．收集有代表性的样品（中药制剂、中间体、原料药材）各10批次以上，每批样品需重复三次实验，样品应 均匀并具代表性；以确保建立的图谱具有特征性。 3．制备供试品溶液时应选择合适的溶剂进行提取分离，尽可能保证能够充分反映供试样品的基本特性。测定 方法的选择应能确保图谱具有特征性，使制剂中的成分较多地在特征图谱中反映出来，并达到较好的分离。 4．特征图谱中具有特殊意义的峰应予以编号，对供试品中的色谱峰应尽可能进行峰的成分确认。对色谱峰多 的样品，参照物最好能有2～3个，以便与对照图谱定位。 5．为确保特征图谱具有足够的信息量，必要时中药复方制剂可使用2张以上对照图谱。
黄连HPLC Maxplot指纹图谱的建立
570... 天津中医药..Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine 2017年8月第34卷第8期Aug. 2017,Vol.34 No.8DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2017.08.20黄连HPLC M a x p l o t指纹图谱的建立*张春艳u,成睿珍2,刘海2(1.天津中医药大学中医药研究院，天津300193; 2.天津市滨海新区中医医院药学科，天津300451)摘要:[目的]以髙效液相色谱-二极管阵列检测器(H PLC-PDA)M axPlot色谱图为基础，建立黄连指纹图谱分析方法。
[方法]米用高效液相色谱(HPLC)法，色谱柱为AgilentSB-C18(4.6m m x l50mm,3.5|x m);流动相为乙腈-0.1% 三氟乙酸水溶液，线性梯度洗脱;210~400 nm波长下提取M axplot色谱图。
以黄连对照药材随行测定所得M axPlot色谱图作为黄连的标准对照指纹图谱，通过相似度评价黄连药材质量。
[结果]结果显示,PDA M axPlot模式下黄连指纹 图谱共获得11个共有峰，较单一波长345 nm下多1个微量成分峰。
12批样品指纹图谱与对照药材随行对照标准指 纹图谱相似度达0.994以上。
[结论]M axPlot指纹图谱显著提髙了黄连中各类成分检测的灵敏度，有效增加了黄连药材共有峰数量,为该药材多成分的质量控制提供了借鉴。
关键词:黄连;PDA M axPlot;随行对照;指纹图谱;质量评价中图分类号:R284 文献标志码:A文章编号：1672-1519(2017)08-0570-04中药为多成分复杂体系，其所含化学成分种 类、含量及理化性质存在着差异，而中药指纹图谱 是一种综合、可量化的质量控制手段，能够确切地 反映中药有效部位中化合物的化学信息。
目前，高 效液相色谱(HPLC)指纹图谱技术是公认的应用最 广的方法[1]。
中药指纹图谱综述【文献综述】
毕业论文文献综述化学工程与工艺中药指纹图谱综述一、前言中医药作为中华民族科学、文化、和历史的伟大宝库，是我国在自然科学领域最有优势、最有特点、最有希望的科学之一。
中药产业也应对国家的发展做出贡献。
中医药的发展和其指纹图谱的发展密不可分，中药指纹图谱抓住了中药现代化的关键问题之一，对推动中药现代化、产业化和国际化具有重大的作用。
在中药现代化中,采用指纹图谱的意义已是牵动行业进步的关键技术，其应用研究，对保证中成药功效，提高中药工业整体综合水品，带动重要农业现代化，推进中药走向世界，具有非常重要的现实意义[1]。
本文从中药指纹图谱的分类和发展来阐述中药指纹图谱的作用。
二、中药指纹图谱（阐明有关主题的历史背景、现状和发展方向，以及对这些问题的评述）2.1背景中药现代化是当代中药发展中的一个最热门的研究方向，已成为国内外医药界一太热点。
其中中药材、中成药的质量标准现代化是中药现代化的一个重要组成部分。
如何根据中医药的特点，提出一整套具有中医药特点又具有高科技特征的中药材、中成药现代质量标准．是一重要课题，建立中草药单昧药和复方全组成的指纹图谱是种具有先进性的切实可行的方法，现在这方法已成为国际上较勾通用的方法，而且指纹图谱已成勾国际公认的控制中药或天然药物质量的最有效手段。
中国中药指纹图谱的研究已有相当的基础，最早可以追溯到20世纪60 年代，如采用薄层色谱、紫外光谱、红外光谱法来描述中药材主要成分的特征，这是早期的原始的指纹图谱，具有直观、在简单情况下容易比较差异的优点。
随着分析技术的飞速发展和微电脑的广泛应用，基于化学计量法的中药指纹图谱的研究方法向高效、灵敏、专属、智能化、联用型的方向发展，高效液相、高效毛细管电泳、高速逆流色谱、核磁共振、近红外光谱等新兴分析技术的应用和各种数学分析方法的运用，为中药指纹图谱的研究与发展提供了广阔的前景[2]。
2.2 概念指纹图谱就是以对照品药材的完整图谱，用于供试品的鉴别．即某种(或某产地)中药材或中成药中共有的、具有特异性的某类成分的色谱或光谱的图谱。
黄连HPLC数字化指纹图谱研究及7种生物碱含量测定_刘芳
［摘要］ 该文建立了峨眉地区道地药材黄连的 HPLC 数字化指纹图谱，并将其在全国不同主产区的黄连测定中进行了 应用，同时测定黄连中 7 种季胺型生物碱的含量，为科学评价与有效控制黄连质量提供依据。采用 Diamonsil C18 色谱柱（4. 6 mm × 250 mm，5 μm） ，流动相乙腈-0. 025mol·L － 1 KH2 PO4 溶液（ 磷酸调 pH 3. 0） （40∶ 60） ，内含 SDS 1. 7 g·L － 1 ，流速 1. 2 mL· min －1 ，检测波长 345 nm，柱温 40 ℃ 。运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（ 国家药典委员会） 进行分析，10 批次峨眉产黄 连样品得到的指纹图谱相似度均大于 0. 99，标定共有峰 10 个，并对其中 8 个色谱峰进行了归属。全国 5 个黄连主产区样品与 峨眉产黄连进行相似度分析比较，整体相似度高。同时对黄连药材中 groenlandicine，非洲防己碱，药根碱，表小檗碱，黄连碱， 巴马汀，小檗碱 7 种主要生物碱进行了含量测定。该方法灵敏度高、专属性强，HPLC 指纹图谱结合生物碱含量测定能全面反 应其内在质量，为黄连的质量控制提供科学依据。
［收稿日期］ 2013-05-03 ［基 金 项 目］ 科 技 部 国 家 科 技 支 撑 计 划 重 点 项 目 （2007BA140B05） ； 中 国 博 士 后 科 学 基 金 第 6 批 特 别 资 助 项 目 （2013T60863） ［通信 作 者］ * 张 浩，教 授，博 士 生 导 师，Tel： （ 028 ） 85503037， E-mail：zhanghhx@ vip. sina. com
双黄连口服液化学成分含量测定及指纹图谱研究
双黄连口服液化学成分含量测定及指纹图谱研究目的：测定双黄连口服液化學成分含量，建立化学成分指纹图谱的研究，为双黄连口服液质量标准研究提供理论依据。
方法：采用高效液相色谱法，Agilent C18色谱柱（250mm×46mm，5μm），流动相为甲醇（A）-025%冰乙酸（B），流速为10mL/min；柱温为30℃；进样体积为10μL。
结果：测定双黄连口服液中化学成分含量并建立了指纹图谱，标定12个共有峰，以9号峰（即黄芩苷）为参照。
方法学考察符合规定，RSD均小于30%。
结论：建立了以黄芩苷、连翘苷和绿原酸为参照物，测定不同厂家的双黄连口服液的含量及化学指纹图谱方法，结果显示不同厂家制剂的指纹图谱存在差异性，此方法简便，重现性好，精密度高，可以为双黄连口服液质量标准提供一定的依据。
标签：双黄连口服液；高效液相色谱法；含量测定；指纹图谱双黄连口服液是临床抗菌抗病毒常用药，由金银花、黄芩和连翘三味中药提取精制而成，具有抑菌[1]、抗病毒[2-3]、解热抗炎[4]的作用，用于治疗外感风热所致的感冒，症见发热头痛、咳嗽及咽痛等。
此三味中药主要成分为绿原酸、黄芩苷以及连翘苷，绿原酸具有抗菌、抗病毒、抗炎、免疫调节等作用[5]，黄芩苷具有抗菌抗病毒、解热镇痛抗炎、清除氧自由基等作用[6]，连翘苷具有抗菌抗病毒、抗炎、保肝等作用[7]，这三种化合物是双黄连口服液中主要活性及药效成分。
目前用高效液相色谱法来测定双黄连口服液中的有效成分是主要的检测方式[8-10]，且指纹图谱是国内外公认的鉴别中药品种和评价中药质量的非常有效的手段。
因此有必要对不同厂家及批次的制剂中这三种成分的含量及指纹图谱进行研究，为此建立了本文的研究方案，可能会对控制药品质量、保证人民用药的安全有效起到积极的作用。
1仪器与材料11仪器Agilent 1200高效液相色谱仪（包括四元泵，DAD 检测器，柱温箱，工作站，安捷伦科技有限公司）；AR2140型电子分析天平（上海奥豪斯公司）；METTLER AB135-S十万分之一电子天平（瑞士）；超声提取仪（240W，50-60Hz，上海必能超声仪器公司）。
专题10中药指纹图谱的研究现状与进展
中药指纹图谱的研究现状与进展一、中药指纹图谱的含意中药指纹图谱借用了法医学中的指纹鉴定的概念，通常是指借助于现代分析及检测技术来表达中药（主要是次生代产物）化学信息特征的指纹图谱，包括含中药材（原料药材）指纹图谱；中药原料药（包括饮片、配伍颗粒）指纹图谱和中药制剂指纹图谱。
中药指纹图谱是组分群体的特征图谱，能全面反映中药所含化学成份的种类与数量，进而反映中药材及产品的质量。
它是一种十分可行的质量控制模式，运用整体性与模糊性的基本属性，即物种特征的唯一性和同种个体间的相似性，为中药材和中成药提供综合的、宏观的和可量化的质量评价，可使中药质量评价过程更加科学化、标准化。
二、中药指纹图谱的属性中药指纹图谱是以各种分析技术为依托的质量控制模式，通过特定条件下完整图谱的整体信息来鉴别真伪，同时，在定量操作的前提下，用所得到的量的信息来估量被测样品的量的差别。
中药指纹图谱有两个基木属性：整体性和模糊性。
所谓整体性，是指要把所得指纹图谱作为一个整体进行评价，而不是孤立地看其中单一峰的有无、高低来判断药材或成药质量；而模糊性是指个体样品本身就存在着差异，难以精确地进行测量，绝大多数的指纹图谱本身就存在模糊性，不能保证所得的指纹图谱中每个峰都没有重叠，而且也不能保证所得的图谱包含了样品的所有特征，只要能固定图谱中关键部分就可对样品进行质量控制。
三、中药指纹图谱的起源、发展与构建中药指纹图谱按测定手段可分为中药化学(成分)指纹图谱和中药生物指纹图谱。
最先发展起来的，目前最主要和常用的是中药化学指纹图谱。
中药化学指纹图谱首推色谱方法和联用技术。
光谱最常用的是红外光谱(IR)，色谱最常用的是薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)，近来又出现了X-射线粉末衍射指纹图谱。
现代指纹鉴定始于19世纪末的犯罪学和法医学。
每个人的指纹在微小的细节构造上各有不同，可以以此鉴别每个人的特征。
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黄连HPLC指纹图谱研究进展姓名：方功学号：211134****班级：中药专硕3班摘要：中药质量标准现代化的模式将是中药化学指纹图谱配合有效成分含量测定和必要的检查项目,较全面地整体控制中药质量，中药指纹图谱研究是中药质量标准现代化研究的关键技术。
本文就黄连HPLC 指纹图谱研究的情况进行归纳综述。
关键词：黄连中药指纹图谱中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。
日本汉方药主要生产企业在20世纪80年代就已经在企业内部采用HPLC指纹图谱控制质量。
我国自2000年8月国家药品监督管理局颁发《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求( 暂行) 》以来, 中药指纹图谱的研究已经成为中药研究的热点。
高效液相色谱法( HPLC) 也在中药成份分离、分析中获得了广泛的应用, 特别是三维高效液相色谱近年来发展迅速, 使得HPLC在中药质量控制中占有重要地位, 被认为是目前检测中药指纹图谱的首选方法。
1.中药HPLC指纹图谱定义中药HPLC指纹图谱系指中药材或中成药经适当处理后, 采取HPLC分析手段, 得到能够标示该中药材或中成药特性的共有峰的图谱。
指纹图谱一般包含两层含义:（1）必须反映出该药材(或成药)有别于其他任何物质;（2）对于中药材,指纹图谱还能反应出产地和采收期不同而造成的差异; 对于中成药, 则能反映出同一产品不同批次间的质量差异, 差异越小说明药材(或成药) 的稳定性越好。
2.黄连HPLC指纹图谱的构建2.1黄连HPLC法分离模式黄连HPLC法分离模式有反相色谱法( RPC) , 正相色谱法( NPC) , 梯度洗脱法, 离子交换色谱法, 分子排阻色谱法( SEC) , 手性HPLC法等。
RPC比较简单方便, 柱性能较好, 是应用最广泛的HPLC法。
在HPLC方法建立时, 应首先试用RPC, 若初步试验证明样品不适合使用RPC分离, 则改为NPC。
离子交换色谱法现在主要用于生物来源样品, 如氨基酸、肽、核酸等。
SEC是获得聚合物分子量及其分布的基本方法,《中国药典》2000年版规定多糖的分子量分布测定采用这种方法。
手性HPLC可用于具有不同物理化学性质的非对应异构体的分离方法[1]。
2.2 黄连HPLC指纹图谱方法构建2.2.1 色谱条件的选择选择色谱条件时, 首先应考虑到物质成份能在液相色谱中完全显示, 即特征峰数要尽量地多,且分离度要好, 主要的指标成份、活性成份或用于定量的成份的分离度应能达到有效的分离。
进样量也应适宜, 应使最小成份特征峰的面积能达到4～5位数以上。
能用等度洗脱就不用梯度洗脱, 即使用梯度洗脱也应尽量采用线性梯度。
在保证专属性、重复性的前提下, 以选择简单实用, 便于实施的试验条件; 如果能用通用柱, 就不用特殊色谱柱; 为了使指纹图谱规范化, 最好能根据指纹谱评价的实际, 选择标准色谱柱。
除此, 还应使系统适用性试验、稳定性试验、精密度试验等方法学考察内容符合HPLC指纹图谱的要求。
2.2.2 检测器的选择HPLC指纹图谱中应用较多的有紫外检测器( UVD) , 二极管阵列检测器( DAD) , 荧光检测器( FD) , 电化学检测器( ECD) , 蒸发光散射检测器( ELSD) ,示差折光检测器( RID) , 液谱联用技术等。
现今应用较多的是UVD, DAD, 液质联用等技术。
2.2.3 对照品的选择选择参照物计算特征峰对参照物峰的相对保留时间和相对峰面积比, 来考察指纹图谱的稳定性和重复性[2]。
2.2.4 供试品的选择一般来说, 黄连最好是选择规模化、规范化种植的品种, 且应确保所用原料的产地、品种、部位、采集期和加工方法, 同时应收集足够多的、不同批号的样本, 对图谱特征的重现性进行考察, 还应收集一些易混淆或曾出现的伪品, 依所确定的特征若能加以区别和辨认, 则更为理想。
2.2.5 制备方法具体操作时选用有机溶剂或水提取不同的化学成份, 再利用溶剂萃取、柱色谱等手段, 使目标成份富集或与其他成份分离, 以有利于分析过程的顺利进行。
在建立制备方法时,一般要考察提取溶剂、粗分或精制过程, 通过比较, 选择可以避免干扰, 同时又能全面反映成份信息的制备方法, 必要时,针对不同种类的成份分别选用不同的制备方法。
3.黄连HPLC指纹图谱数据处理[3]3.1 直观分析比较根据图谱外观和所得数据, 对供试品与对照指纹图谱的特征进行直观的分析、比较、判断。
此法适用于样品的定性快速鉴别或图谱中数据比较少的情况, 是目前应用较多的方法之一。
3.2 计算机软件分析基于化学模式识别技术, 开发出计算机分析软件。
目前“ 中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件” 已用于中药HPLC指纹图谱研究和实际工作当中。
其它还有诸如量化数据比较、化学模式识别技术、化学计量学方法等处理及评价技术。
4.黄连HPLC指纹图谱普的研究进展4.1 二维HPLC一维HPLC受固定波长的限制,导致中药中很多组分的吸收峰可能未被检出,而利用高效液相色谱二级阵列管检测器(HPLC/DAD)和数字图像识别技术为基础建立的二维高效液相色谱(2D-HPLC)指纹图谱可得到所有波长下的图谱,所以具有更高的可靠性和客观性。
利用2D-HPLC的特征峰,也可对组分进行定量分析。
Hong Lin Zhai 等[4]把2D-HPLC/DAD 法用于不同黄连样品的质量分析中,建立了黄连二维指纹图谱,同时利用灰度图像的密度,对小檗碱、药根碱、巴马汀3个成分进行定量分析。
结果表明,聚类分析结果与样品真实情况一致,其组分浓度与灰度图像密度之间的相关系数大于0.999。
4.2 3D-HPLC指纹图谱运用二极管阵列检测( DAD) 可得到三维图谱, 因而适用于成份比较复杂紫外光区有吸收的药物分析。
马百平[5]和沈嘉[6]等采用三维HPLC指纹图谱, 对双黄连粉针剂和黄连解毒汤制剂进行了质控。
岳清洪[7]等采用3D-HPLC建立了黄连的特征指纹图谱。
4.3 联用技术在建立的指纹图谱基础上,为进一步对各指纹峰进行定性分析,又建立了HPLC-MS法。
盛氏等[8]采用高效液相色谱紫外检测器(HPLC-UV)方法建立了黄连药材指纹图谱,同时用HPLC-MS 联用技术对7个主要色谱峰进行定性分析,并比较不同栽培条件、不同产地和不同炮制方法制备的黄连药材中小檗碱、巴马汀和药根碱含量差异。
HPLC-UV 色谱条件为：C18(150 mm×4.6 mm,5 μm),流动相A 为H20-CH3OH-CH3CN(10∶45∶45),流动相B 为CH3CN 缓冲液(50 mmol/L NH4AC：5 mmol/L SDS 和2%HAc 的水溶液＝40∶60)梯度洗脱,检测波长265 nm,流速0.8 mL/min,柱温30 ℃。
质谱以电喷雾(ESI)正离子模式监测。
对7个主要色谱峰定性结果分别为：5-羟基小檗碱、非洲防己碱、药根碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱。
这是首次用此法从指纹图谱中指认了5-羟基小檗碱的位置。
结果表明,不同的栽培条件中,遮荫条件、生长年限对黄连中小檗碱、巴马汀和药根碱的含量影响较大,而种植密度的影响不显著；不同产地的黄连中这3 种生物碱的含量差别较大；这3种生物碱在用不同炮制方法制备的黄连中的含量差别不明显。
霍氏[9]也用相似的方法建立了黄连指纹图谱,共得到9个共有峰。
色谱条件为C18(150 mm×4.6 mm,5 μm),CH3CN-H2O(0.1%SDS)溶剂体系梯度洗脱,流速1.0 mL/min,检测波长345 nm,柱温30 ℃,分析时间60 min。
质谱以ESI正离子模式监测。
在对9个共有峰一级和二级质谱图进行分析的基础上,推测主要成分的可能结构分别为木兰碱、未知峰、药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱。
4.4 谱效研究黄连具有改善胰岛素抵抗活性的作用。
唐氏等[10]首次把指纹图谱与这种活性结合进行研究,对共有峰的相关性进行探讨。
用RP-HPLC 建立了黄连完整特征指纹图谱,它不仅保证了对生物碱成分(7 个共有峰)的分离,同时也首次对保留时间靠前的大极性非生物碱物质(9个共有峰)进行了有效分离,共得到16 个共有指纹峰。
色谱条件为ODS(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱,流动相A为20 mmol/L KH2PO4(含0.2%H3PO3),流动相B 为CH3CN-H2O(3∶2,含12.5 mmol/L SDS),进行梯度洗脱,检测波长270 nm,流速0.8 mL/min,柱温30 ℃,分析时间60 min。
该指纹图谱1～9 号色谱峰主要为非生物碱成分,色谱峰10～16 主要为生物碱成分。
在此基础上对各指纹峰与体外改善胰岛素抵抗活性进行了相关性分析,以3T3-L1 前脂肪细胞为实验细胞,认为除巴马汀外,峰3、6、7、10 与改善胰岛素抵抗活性相关性较强；同时,药根碱及峰5 与改善胰岛素抵抗活性为显著正相关,而峰9呈显著负相关。
黄连5个主要生物碱的相关性排序由强至弱分别为巴马汀、表小檗碱、药根碱、黄连碱、小檗碱。
由此说明仅仅由小檗碱或几种主要生物碱来控制黄连的质量是片面的,不能代表黄连的整体情况,应同时结合化学分析与生物效应来控制黄连质量。
5.结语中药活性成份都是次生的代谢产物,本身就有内在的不稳定性, 加之种植资源、药材产地、炮制工艺以及贮存条件不同等因素, 即使同一品种的药材内在质量也很难稳定, 这就给指纹图谱的建立带来了更多的复杂性和不规范性。
要将这些不稳定因素降到最低, 这就要求实施中药材规范化种植, 制订客观规范、科学准确的评价标准以保证药材质量的稳定。
[11]实验条件对图谱的制备影响较大，色谱条件和仪器设备的不同产生的图谱也会不同,这给标准指纹图谱的建立带来了困难。
目前还存在的问题有：①指标成分与有效成分可能并不一致,如降压、抗癌等活性成分可能与黄连中主要生物碱成分并无关系；②建立指纹图谱的技术手段有多种,但每种技术均有其优缺点,如色谱检测时往往采用单一波长、光谱法无法进行分离等,如何实现多种仪器联机技术,从而兼顾各自长处,使图谱包容更多信息；③如何实现目标成分定性定量同步进行；④黄连中很多化学成分还不是很清楚,缺乏相应的标准物,无法对相关指纹峰进行分析研究。
因此,要使黄连指纹图谱能较准确代表黄连有效成分,还需结合药效研究,进一步加大黄连的提取分离工作,同时借助多种技术手段,使黄连指纹图谱研究工作目标性更强。
[12]参考文献[1] 谢培山.中药色谱指纹图谱.北京:人民卫生出版社, 2005: 2.[2] 王玺, 王文宇, 张克荣, 等.中药HPLC指纹图谱相似性研究的探讨[J].沈阳药科大学学报, 2003, 20( 5) : 361- 362.[3] .蔡宝昌, 刘训红, 贾晓斌, 等.中药指纹图谱的研究[J].美中医学,2004, 1( 1) : 19- 23.[4] Hong Lin Zhai, Fang Di Hu, Xiao Yan Huang, et al. The application of digital image recognition to the analysis of two-dimensional fingerprints[J]. Analytica Chimica Acta,2010,657：131-135[5]马百平, 张洁, 康利平, 等.双黄连粉针剂高效液相指纹图谱的建立及应用[J].中成药, 2006, 28( 2) : 157- 161.[6] Shen Jia, Cao Xianfeng, LIU Jiufei.Studies on HPLC Fingerprint of several kinds of Huanglianjiedu Decoction [J].Chinese Traditional Patent Medicine, 2003, 25( 6) : 433- 437.[7] 岳清洪,唐策，杨永东，等.黄连3D-HPLC特征指纹图谱研究[j].China Pharmacy 2013 V ol. 24 No. 7：624-626.[8] 盛彧欣,张金兰,孙素琴,等.不同栽培条件黄连的质量分析与评价[J].药学学报,2006,41(10)：1010-1014.[9] 霍达.黄连黄柏指纹图谱及成分研究[D].北京：首都师范大学硕士论文,2009.[10] 唐光曦,黄彦珺,张艺.黄连体外改善胰岛素抵抗活性与HPLC 指纹图谱的相关性研究[J].世界科学技术—中医药现代化,2009,11(6)：828-833.[11] 陈菊.中药HPLC指纹图谱研究进展[j].新疆中医药，2008，26(2)：85-87.[12] 陈红英.黄连指纹图谱研究进展[j].中国中医药信息杂志，2012，19(5)：109-112.。