几种常见肠道致病菌多重PCR检测的效果评价
微生物检测之志贺氏菌检测
志贺氏菌的检验（国标法）一、增菌称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内，固体食品用均质器以8000-10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化，于36℃培养6~8h。
培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。
二、分离和初步生化试验取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个；另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板各1个，于36℃培养18~24h。
志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。
挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。
一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经36℃培养18~24h，分别观察结果。
下述培养物可以弃去：a. 在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物；b. 在18~24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物；c. 不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物；d. 产气的培养物；e. 有动力的培养物；f. 产生硫化氢的培养物。
凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。
三、血清学分型挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。
先用4种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查；如果呈现凝集，则用A1、A2、B群多价和D群血清分别试验。
如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。
福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表1。
可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。
4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用1~15各型因子血清检查。
如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌3~12型多价血清及各型因子血清检查。
四、进一步的生化试验在做血清学分型的同时，应做进一步的生化试验，即：葡萄糖铵西蒙氏柠檬酸盐赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶pH7.2尿素KCN生长水杨苷和七叶苷的分解除宋内氏菌和鲍氏13型为乌氨酸阳性外，志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。
妇科炎症感染中几种微生物检验方法的效果评价
妇科炎症感染中几种微生物检验方法的效果评价摘要：目的研究和分析妇科炎症感染中几种微生物检验方法的效果评价。
方法选取我院 2015年 6 月至 2017年 6 月收治的80例妇科炎症感染的已婚妇女作为本次实验对象，使用三根无菌棉签对患者的阴道侧壁上1/3分泌物进行样品采集，同一个患者必须拥有三种相同样品，并运用三种相同的样品进行培养法、凝集法和镜检法的三种检查。
比较三种阴道念珠菌检测方法的阳性率。
结果培养法、凝集法和镜检法的三种检查的概率分别为90.00%、88.75%、87.50%，两两比较差异不大，没有统计学意义（P>0.05）。
结论在妇科炎症感染中运用培养法、凝集法和镜检法微生物检验具有重要的现实意义和作用，值得推广和运用。
关键词：妇科炎症感染；微生物检验方法；效果评价妇科炎症在妇科疾病中是处于比较常见的类型疾病，主要是指女性患者的阴道、宫颈、子宫体、卵巢、外阴等部位出现相应的生殖器官由于致病菌的侵害而出现相应的炎症[1]。
这些炎症严重影响患者的身心健康和生活质量。
在当下的快节奏生活中，由于环境因素、疾病因素、饮食因素、用药因素等因素的影响，导致妇科炎症的发生概率呈现出上升趋势。
对于妇科疾病的患者而言，妇科疾病容易导致患者内分泌失调，皮肤暗黄粗糙，严重影响患者的身心健康和生育健康，降低了患者的生活质量[2]。
在临床中，为了改变这种情况，注重对于妇科炎症感染程度的有效检测一直以来是临床研究的重点内容。
在现代化的医疗技术支撑下，提升妇科炎症感染程度的有效检测，对于妇科炎症的治疗和效果显得尤为重要[3]。
从临床实践中表明，存在于妇女阴道的的阴道念珠菌是比较常见的条件致病菌，与各种妇科疾病的产生有着紧密联系，黏附在女性阴道的任何部位。
若是妇女的阴道内环境发生改变、身体抵抗力严重下降等情况的发生，都会导致引导念珠菌会过度繁殖，从而诱发相应的妇科炎症[4]。
因而，运用微生物检验发现病原菌传染源，对于治疗和控制妇科炎症起到积极作用，同时避免发病菌的传播，避免不良事件的发生。
以肠道致病菌检测为基础微生物学综合性实验论文
以肠道致病菌检测为基础的微生物学综合性实验探索[摘要] 目的:开展微生物学实验教学改革，探讨微生物学实验教学中开设综合性实验的必要性、实施过程及效果评价。
方法：选择生物技术专业2010级本科生作为研究对象，设计肠道致病菌检测的综合性实验，参考中国疾病预防控制中心（cdc）应对突发公共卫生事件微生物检验程序，实施教学改革，由学生自主设计、动手操作、分组讨论并提交实验报告。
结果：通过开设综合性实验，学生巩固了课堂理论知识，掌握了实验操作的基本技能，增强了生物安全意识，并熟悉了肠道致病菌检测的方法和流程。
结论：综合性实验的开设有助于提高学生分析问题、解决问题的能力，对于学生素质的全面提高起到了促进作用。
[关键词] 微生物学实验教学肠道致病菌综合性实验前言实验教学在医学教育中占有重要地位，对培养医学生理论联系实际、动手能力、分析解决问题能力、科学思维方法以及严谨的科学精神均具有重要意义，对实现素质教育和创新人才培养目标也有着不可替代的作用[1]。
综合性实验是实验教学创新的一个重要改革, 它是一种需要学生自拟实验方案、查阅参考资料以及提出设计思路和实验步骤, 并在获得的现象或数据的基础上自己概括出实验结论的类科研实验[2]。
微生物学是生物技术专业的一门重要基础课程，实验教学是微生物学教学中的重要组成部分。
改革实验教学、增加综合性实验、培养学生的科研思维和创新能力是微生物学教学改革的重要课题。
本文以“肠道致病菌检测”这一综合性实验为例，探讨了在生物技术专业微生物学实验教学中开设综合性实验的尝试及效果。
1.微生物学综合性实验开设的必要性医学是实践性很强的学科，人们对于生命现象和疾病发生机制的研究都是通过实验研究来证明，直至今日，实验仍然是医学研究的基本方法。
因此，在医学教育中，实验教学占有重要的比重，部分学科实验教学比重达到了一半以上。
实验教学效果的高低直接影响到学生对课堂理论知识的理解程度。
在通常经典的教学模式中，实验教学大多数是验证性试验，各个实验项目之间相互独立，缺乏必要的逻辑联系，虽然在一定程度上可以增强学生对课本理论知识的理解，但是实验过程自主性差，不利于学生创新思维的培养和对学科的整体把握。
副溶血性弧菌的快速检测技术
3、多重PCR
结果显示，所有的V.p都扩增出tl基因，tl 基因是V.p特异的；54％的V.p扩增出tdh基因； 只有38.73％的V.p扩增出trh基因;该法灵敏度 38.73 V.p trh ; 高，能把10g牡蛎培养肉汤里10～100个V.p 检测出来。与其他常规生化方法相比，多重 PCR更快速，仅8h就能完成检测，结果更为准 确、可靠，而且还可改进成定量竞争PCR，对 标本中靶序列进行定量。
3、多重PCR
由于不是全部副溶血性弧菌都含有tdh基因 或trh基因，所以只针对tdh或trh的单一PCR， 有时会漏检。多重PCR(multiplex-PCR)能全 PCR(multiplex-PCR) 方位高效率地检测V.p。 Bej白等针对tl、tdh、trh设计不同的引物 对，在同一PCR反应体系内同时扩增tl、tdh、 trh。
总结
与传统方法相比较，PCR法更加快速、 灵敏，基本满足了快速检测的要求，但是其 技术含量较高，试剂费用都比较高，而且一 般检测时间也还是要6-8小时左右，离即时 检测的要求还有一定距离，随着分子生物学 和科技水平的不断提高，更加准确、可靠、 方便、快速、经济、安全的检测方法将是食 品安全检测的发展方向。
参考文献
• [1] 张凡非. 副溶血性弧菌及其引起的食物中毒研究进展. 中国 卫生监督杂志, 2003, 10 (1) : 8 -10. • [2] 中华人民共和国卫生部, 中国国家标准化管理委员会. GB/T4789.7—2008. 食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验. 北京: 中国标准出版社, 2008. • [3] 刘秀梅, 陈艳, 王晓英, 等. 1992-2001年食源性疾病爆发资料 分析-国家食源性疾病监测网. 卫生研究, 2004, 33 ( 6) : 725 727. • [4] 朱雪兰,陈艳. 副溶血性弧菌溶血素基因及其检测的研究进 展. 国外医学卫生学分册, 2007, 34 (4) :233-237. • [5] 程苏云,张俊彦,王赞信, 等. 海水产品副溶血性弧菌污染定 量检测分析. 中国卫生检验杂志, 2007, 17 (2) :336-338.
PCR技术在食品药品检测中的应用
PCR技术在食品药品检测中的应用胡孔兴;董菁;陈佳峰;刘丽【摘要】食品和药品的检验工作对提高食品药品安全性具有重要意义.聚合酶链式反应(PCR)技术因具有快捷、灵敏、操作简便等优势被广泛应用在食品和药品检测中.在归纳分析PCR技术在食品和药品检测中的具体运用案例的基础上,总结了PCR技术的应用前景和价值.【期刊名称】《常州工学院学报》【年(卷),期】2018(031)004【总页数】6页(P52-57)【关键词】PCR技术;食品;药品【作者】胡孔兴;董菁;陈佳峰;刘丽【作者单位】芜湖市食品药品检验中心,安徽芜湖241000;芜湖市食品药品检验中心,安徽芜湖241000;芜湖市食品药品稽查支队,安徽芜湖241000;芜湖市食品药品检验中心,安徽芜湖241000【正文语种】中文【中图分类】TS207.4;TQ460.7PCR技术(即聚合酶链式反应技术)的原理是首先让双链DNA 变性成单链，接着将其与特定引物结合，使单链DNA在聚合酶的促使下向3′末端延伸合成，进而产生新的双链，新产生的双链将作为模板，循环重复以上反应，不断扩增出所需DNA双链，最终使目的片段实现指数倍的增加[1]。
由于PCR技术灵敏性高、特异性强，且操作简单，因此在应用范围上得到不断延伸。
随着PCR技术的迅猛发展，近些年来，基于常规PCR技术不停地衍生发展出很多新的技术，如：多重PCR、实时荧光定量PCR、PCR Array技术等。
本文就近些年来PCR检测技术在食品和药品检测领域中的应用进行综述，以期促进PCR技术的进一步普及推广，并为食品和药品的快速鉴定、检测提供参考。
1 PCR技术在食品检测中的应用近些年来，国内的食品安全问题日益凸显，食物中毒事故时有发生，食品安全形势愈发严峻，给国人的身心健康与饮食安全带来严重威胁。
除此之外，食品安全问题还影响和制约了食品工业的发展，因此食品质量的检测环节就显得尤为重要。
由于PCR技术具有快捷、准确等优点，被广泛应用于食源性致病菌、非致病菌、食品成分等检测当中。
2种艰难梭菌感染检测方法的比较与分析
2种艰难梭菌感染检测方法的比较与分析孔建新;蔡心安【摘要】目的比较酶联免疫荧光分析(ELFA)与实时荧光定量PCR(PCR)2种艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection,CDI)检测方法的检验性能,从中选择灵敏度高、特异性好且操作简便的CDI检验方法开展临床检验.方法对来自重症监护病房(ICU)、消化内科及感染科等临床科室的126份粪便标本进行艰难梭菌毒素或基因检测.以产毒培养试验(toxigenic culture,TGC)结果作为参考标准,评价ELFA与PCR方法的性能,同时分析我院及各科室的CDI流行情况.结果 TGC检测126份腹泻患者的粪便标本,阳性率为19.0％ (24/126),其中ICU、消化内科感染率较高.ELFA和PCR方法的检测敏感性分别为66.7％和91.7％,差异有统计学意义(x2=4.55,P＜0.05);特异性、阳性预测值、阴性预测值与准确度差异无统计学意义.结论我院CDI形势较为严峻,以ICU和消化内科最为突出.PCR与ELFA均能够提供更为准确、可靠的检测结果,但前者敏感性较好.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2014(032)008【总页数】2页(P632-633)【关键词】艰难梭菌;毒素;聚合酶链反应;酶联免疫荧光分析;伪膜性肠炎;抗生素相关性腹泻【作者】孔建新;蔡心安【作者单位】解放军第105医院检验科,合肥230031;解放军第105医院检验科,合肥230031【正文语种】中文【中图分类】R516.1艰难梭菌(Clostridium difficile，CD)是抗生素相关性腹泻、院内感染性腹泻及伪膜性肠炎的主要病原菌。
感染患者临床表现不典型，轻者表现为自限性腹泻，重者可出现伪膜性肠炎及中毒性巨结肠，临床诊疗存在较大困难。
因此本研究以金标准产毒培养试验(toxigenic culture，TGC)作为参考[1]，比较分析了酶联免疫荧光分析(ELFA)和实时荧光定量PCR(PCR)两种方法的性能，寻找快捷、经济、优异的艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection，CDI)检验方法以辅助临床诊断。
常见致病菌
沙门菌属 伤寒沙门菌
沙门菌属 鼠伤寒沙门菌
沙门菌属的生物学特性
一、培养特性 二、抗原结构 三、抵抗力 四、分类
培养特性
1、兼性厌氧/需氧 2、普通培养基， 无色半透明S型菌落 3、可根据生化反应的不同区分种与亚种
抗原结构
1、O抗原：已发现58种，据此分42组， A-E组，致病菌
2、H抗原：I 相（特异相）、 II相（非特异相）属
粘质沙雷菌
耶尔森菌属
鼠疫耶尔森菌
肠道杆菌的共同生物学特性
一、结构 二、培养特性 三、抗原结构 四、抵抗力 五、变异
肠道杆菌的形态结构
荚膜
鞭毛
肽聚糖 细胞壁
外膜
LPS侧链
培养特性
1、兼性厌氧/需氧 2、普通培养基 3、中等大小、灰白色、湿润、光滑菌落 4、生化反应活泼， 5、乳糖发酵试验可区别致病菌与非致病菌
培养特性
1、兼性厌氧/需氧 2、普通培养基 3、色素菌落 4、致病菌溶血现象——溶血
抗原结构
1、葡萄球菌A蛋白（SPA）—协同凝集试验 2、荚膜多糖抗原—有利黏附 3、细胞壁多糖抗原—具有群特异性
抵抗力
1、耐干燥 （2-3月） 2、耐热 （60℃ 1h、80 ℃ 30min） 3、耐盐 （10-15%NaCl） 4、抗菌素敏感 （易形成耐药） 5、碱性染料敏感
一、培养特性 二、抗原结构 三、抵抗力 四、分类
培养特性
1、兼性厌氧 2、普通培养基 3、IMViC：+ + - -
抗原结构
1、O抗原 近170种（为血清学分型依据） 2、 H抗原 近60种 3、 K抗原 近100种
抵抗力
1、较强 （水中数周-数月） 2、耐热 （60 ℃ 15min） 3、抗菌素敏感 4、胆盐、煌绿染料等敏感
分子病理学技术
引物浓度：20pmoles/L
PCR方法
反应体系25l (模板DNA 5l, 10PCR缓冲液2.5 l，
10mM dNTP 0.5l, 25mM MgCl2 1.5~4 l, 上下游引物 各20pmoles, Taq酶0.625U, 灭菌双蒸水补足至25l)
PCR循环程序：
94˚C 5min 94˚C 1min 72˚C 1min (35个循环) 72˚C 10min
注意事项
预防污染：隔离不同操作区、分装试剂、
改进实验操作、结果的重复性
污染源的追踪：设立阳性及阴性对照、
选择合适引物、环境污染
污染的处理：稀酸处理法、UV照射法
PCR技术的临床应用
病原体检测 遗传性疾病的基因诊断 肿瘤基因的检测
PCR技术检测病原体
病毒检测：
肝炎病毒、HIV、HPV、 HSV 、 CMV等
PCR原理示意图
PCR技术的发明及发展
1985年Mullis教授发明了PCR技术
PCR技术首先应用于人-珠蛋白DNA的扩增及 镰刀状红细胞贫血病的产前诊断 PCR技术在短短几年内广泛应用于分子生物学、 微生物学、遗传学等生物学的各个领域 1988年PCR技术在我国开展
PCR技术的特点
一般理化性质
变性：DNA分子中的两条链分开形成单链的过程
复性：分开的单链分子按照碱基互补原则重新形成 双链的过程
中心法则---决定生命的法则
DNA是自身复制的模板 DNA通过转录作用将遗传信息传递给中间物质RNA RNA通过翻译作用将遗传信息表达成蛋白质
DNA双螺旋结构示意图
PCR技术原理及特点
表面活性剂裂解法
内分泌科住院患者多重耐药菌感染及抗生素使用情况
内分泌科住院患者多重耐药菌感染及抗生素使用情况摘要：目的:对内分泌科住院患者多重耐药以及抗生素使用情况进行分析，对临床中抗感染控制办法进行指导。
针对我院在2020-2022年期间内分泌科患者的临床资料进行分析整理，采用全自动细菌分析系统鉴定病原菌种类。
并且采用本系统对病菌得耐药性开展实验，采用PCR扩增检测主要多重耐药菌的耐药基因，最终得出多重耐药菌感染患者共分离出多重耐药菌85株，革兰阴性菌60株，其中大肠埃希菌34株，肺炎克雷伯菌17株，鲍曼不动杆菌9株，革兰阳性菌25株，其中金黄色葡萄球菌16株，溶血葡萄球菌9株。
2015年未检出多重耐药菌。
2016-2018年分别分离出1830株和37株，从尿液、痰液、血液和伤口分泌物中分别分离出402413株和8株多重耐药菌。
大肠埃希菌的检出率分别为47.06%、28.24%、15.29%和9.41%，金黄色葡萄球菌的IntI1基因、I类整合子遗传标记基因、､acra基因和､acrb基因的阳性检出率分别为23.53%、73.53%、50.00%、55.88%和47.06%。
acA+ermC､icaA､icaD基因的阳性检出率分别为50.00%、62.50%、43.75%、12.50%、37.50%、43.75%和31.25%。
2015-2018年多重耐药菌总感染率为5.88%，各年多重耐药菌感染率为0.00% 6.19% 5.60。
关键词：内分泌科；多重耐药菌感染；抗生素使用情况引言内分泌疾病多为患者机体内激素分泌过剩或者不足,从而引起患者内分泌功能失调而导致。
在治疗上以药物治疗为主,为了稳定病情患者需要长期服药甚至终身服药。
由于患者多存在基础疾病,同时自身抗力差,因而患者易发感染。
一旦发生院内感染,不但会延长患者治疗周期,还会增加重症和死亡风险。
有研究认为感染是糖尿病的第二大死因,因而对感染的防范和治疗有着重要意义。
由于抗感染治疗过程中使用各类抗生素进行治疗,而内分泌患者自身免疫力差不易恢复,因而常有多重耐药菌检出。
曲霉菌属、新型隐球菌及耶氏肺孢子菌核酸检测试剂盒 (PCR 荧光探针法)说明书
曲霉菌属、新型隐球菌及耶氏肺孢子菌核酸检测试剂盒（PCR荧光探针法）说明书【产品名称】通用名称：曲霉菌属、新型隐球菌及耶氏肺孢子菌核酸检测试剂盒（PCR荧光探针法）【包装规格】24人份/盒，48人份/盒【预期用途】本试剂盒用于体外定性检测人痰液样本中曲霉菌属、新型隐球菌和耶氏肺孢子菌的核酸DNA。
本试剂用于肺部曲霉菌属、新型隐球菌和耶氏肺孢子菌真菌感染的辅助诊断，不能单独作为确诊的依据。
适用人群主要为免疫低下、免疫缺陷人群，其他人群应有肺部真菌感染相关指征。
真菌感染常见于免疫低下或缺陷人群，具有较高的发病率和死亡率，其临床症状表现不具有特异性，易被细菌、病毒等感染掩盖，临床上致病菌包括曲霉菌属、隐球菌、耶氏肺孢子菌等，检测多重真菌可用于辅助临床诊断。
本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状、体征、病史、其它实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。
该产品检测阳性不能确定标本中有活病原菌，检测结果应结合其他临床诊断综合判断。
本产品对于曲霉菌属的检测不能确认具体菌种，如有必要临床应考虑对于曲霉菌属阳性结果进一步确认感染的菌种。
【检验原理】本试剂盒分别选取曲霉菌属18s rRNA基因、新型隐球菌ITS基因和耶氏肺孢子菌mtLSUrRNA基因中保守的区域设计特异性引物和探针，在样本DNA核酸纯化之后采用荧光PCR对DNA进行检测。
本试剂盒采用实时荧光定量PCR技术，PCR扩增过程中，探针与模板结合，其5’端报告基团被Taq酶5’→3’外切核酸酶活性切断，使报告基团远离淬灭基团，产生荧光信号。
荧光定量PCR仪器根据检测到的荧光信号自动绘制出实时扩增曲线，并计算出样本Ct值（每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数）。
曲霉菌属、新型隐球菌、耶氏肺孢子菌荧光标记分别为FAM、VIC、CY5。
本试剂盒反应体系含有dUTP-UDG防污染措施，避免操作产生的假阳性结果；采用内源性内标质控体系，通过内标对待测样本的采集、运输和提取过程进行监控，避免检测结果的假阴性，内标基因选择人源管家基因RP，荧光标记为ROX。
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几种常见肠道致病菌多重PCR检测的效果
评价
作者：傅翔
来源：《医学信息》2016年第01期
摘要：目的 评价几种常见肠道致病菌多重PCR检测的效果。方法 根据大肠杆菌O157、
副溶血性弧菌、普通变形杆菌、单核细胞增生李斯特菌的特异基因作为目的基因，设计相应的
引物，并进行实验优化以确立对4种肠道致病菌的检测体系。并对市售经果汁样品人工随机染
菌后进行模拟样品验证。结果 该多重PCR方法能够有效地扩增出相应致病菌的目的基因片
段，且特异性较强。同时能够检测出模拟样品中随机接种的任意3种细菌。结论 利用建立的
多重PCR可以快速、准确地筛查大肠杆菌O157、副溶血弧菌、普通变形杆菌和单核细胞增生
李斯特菌。
关键词：肠道致病菌；多重PCR检测；效果评价
随着人们健康意识的提升，对于食品安全问题关注度逐渐提升。对于食品安全事件来说，
其中最大的元凶在于食源性致病菌的存在。这些食源性致病菌的组成是多样性的，其中，金黄
色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、志贺氏菌、肠出血性大肠杆菌O157：H7、空肠弯曲杆
菌、副溶血弧菌、沙门氏菌（伤寒沙门菌、肠炎沙门菌）、产气荚膜梭菌及变形杆菌等引起的
食源性疾病居于世界前列。在这种情况下，引起了医学界广泛的重视[1]。在传统的致病菌检
测过程中，常用的方法为生理生化、血清型水平等等，但是，以上种种方法具有测试时间较
长，费时、费力等特点，在灵敏度测试方面具有一定的局限性。故应建立一种较为快速、简便
并具有一定灵敏度的检测方式，其中，以多重PCR检测最具效力，并成为研究的热门。本次
研究拟建一种多重PCR检测方式，可以有效的检测出单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌
O157、副溶血性弧菌及普通变形杆菌4种肠道致病菌，以期达到临床检测效果，现报道如
下。
1 资料与方法
1.1一般资料 菌种以及来源：副溶血性弧菌、普通变形杆菌、蜡样芽孢杆菌等均购于北京
兰博瑞公司。单核细胞增生李斯特菌、伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、志贺
氏、空肠弯曲菌及大肠杆菌O157等均保存于重庆市疾病预防控制中心。
主要试剂及仪器：DNA的提取试剂盒、PCR试剂都是由北京全式金生物有限公司提供。
营养琼脂培养基以及胰酪胨大豆琼脂培养基、血平板以及溶菌肉汤液体培养基、革兰阴性增菌
液等都是由北京陆桥技术有限责任公司成品配置而成。其中，为了有效培育菌群，还准备了恒
温培养箱以及水浴箱，均为德国进口产品，同时，所用的离心机3K30型号、梯度PCR仪器
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ProS型号均为德国进口产品，而PowerPacUniversal164-5070电泳仪以及EC紫外成像系统均为
美国进口产品。
1.2方法
1.2.1菌株培养及DNA提取 在菌株培养过程中，将大肠杆菌以及变形杆菌用营养琼脂培养
基予以培养，并保证其保持在37℃，然后在其中挑选出可用的3～5个菌种，将其接种到LB
液体培养基当中。其他菌株的培养方式亦是如此。在这些菌种的DNA提取过程中，应安全使
用说明予以执行，确保正规提取。
1.2.2引物的设计与合成 将4种细菌的基因序列予以提取，并通过比对，筛选出不同的特
异基因作为靶序列，同时依据靶序列形式设计出相应的引物。其合成则是由北京锐捷生物有限
公司完成。
1.2.3单重PCR扩增及多重PCR体系建立 对上述的4种细菌实施单独扩增，并呈现出反应
体系。其扩增条件在于90℃预变性2.5min；90℃变性30s，65℃退火30s，75℃延伸30s，36
个循环；75℃延伸10min。多重PCR体系的建立是在单重的基础上完成的，多了2个循环模
式，并依据电泳条带的亮度来确定其最佳的退火温度。
1.2.4多重PCR反应特异性、灵敏性检测及模拟果汁中细菌检测。多重PCR反应特异性检
测方法为：将所有的菌群加入在同一个反应体系当中，并加入本次研究中的4种细菌对应的特
异性引物，进而实施多重PCR扩增；多重PCR反应灵敏性检测是将4种细菌予以培养以后的
24h，将其悬液取出，并进行梯度稀释，完成稀释以后按1：3：2的比例提取DNA，按优化后
的多重体系予以反应；模拟果汁中细菌检测，购买不同的果汁，将其作为样品添加，并取一定
量的稀释过的菌悬液予以混合，并过夜培养，取1ml的沉淀物，依据1：3：2的比例提取核
酸，实施多重PCR检测。
2 结果
多重PCR方法效果显著，能够有效地扩增出相应致病菌的目的基因片段，进而展现出独
特的结果形式。其中，单核细胞增生李斯特菌扩增片段为165bp，大肠杆菌O157扩增片段为
357bp，变形杆菌扩增片段为518bp，副溶血弧菌扩增片段为187bp，且特异性较强。对4种目
标菌的检测灵敏度可达到102CFU·mL-1。能够检测出模拟样品中随机接种的任意3种细菌。
3 讨论
多重PCR检测能够有效的检测出常见肠道的致病菌，对于食品安全来说具有一定的保障
[2]。这种检测方式主要的表现在于在同一反应体系中加入不同种类的目的基因引物，以达到
一次反应下实现多种目的基因的有效扩增[3]。在临床实践过程中，因为一个体系当中各个基
因组、引物之间具有一定的排他性，在实施处理过程中，常常会出现一定的影响现象，因此，
应予以实施一定的优化，以完善检测效果。
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本次研究结果显示，对于PCR体系的优化应包括浓度以及退火的温度两个方面。在本次
研究中，通过正交设计的方式，能够有效的将各组间的浓度、退火温度等予以掌握。除此之
外，对于PCR反应的特异性而言，其主要表现在于引物与模板的匹配度，有效的匹配形式是
确保其展现特异性的必要形式。与此同时，在本次研究中，一次性加入了许多不同的菌群引
物，并在试验过程中，分别扩增出相应菌的基因片段，进而实现了一次性检测的目的，体现了
一定的时效性。在灵敏度检测以及模拟果汁检测方面，与前人的研究著作中的数据大致相同，
证实了检测结果的一致性[4-5]。
综上所述，利用建立的多重PCR可以快速、准确地筛查大肠杆菌O157、副溶血弧菌、普
通变形杆菌和单核细胞增生李斯特菌。与传统的检测形式相比，具有高效、快速、准确以及特
异性强的优势，能够有效节省人力、物力以及财力，提高检测水平的同时，进而提高病原菌的
检疫检验效率。
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编辑/金昊天