植物染色体的标本制备

植物染色体的标本制备目前，国内外常用的植物染色体制片技术可以分为两种，即压片技术和去壁低渗技术。

Belling(1921)提出植物染色体压片技术后，压片已成为植物染色体研究中最广泛应用的常规技术；但是由于植物细胞有坚实的细胞壁，染色体很难象动物染色体那样平整地贴在载玻片上，Omura 和Kurata(1978)把植物原生质体技术应用到水稻染色体研究之中，用纤维素酶、果胶酶和0.075mol.L-1氯化钾处理取得了一定的进展，陈瑞阳等人（1979、1982）提出了植物染色体标本制备的酶解去壁低渗技术，并在多种植物上得到广泛应用，成为当今植物染色体研究中的重要方法。

压片技术和去壁低渗技术在取材和预处理要求及其操作都是相同的，即两者的材料基础条件是相同的，但它们所采用的染色体分散方法是不同的。

压片法是以人工外加机械压力使染色体分散，而去壁低渗法是用酶分解细胞壁，低渗液使细胞膜吸胀、水表面张力使染色体分开。

两种技术各有其优缺点，前者操作快速简便、省材省时，后者染色体易于展开、且真实不变形，尤其是对成熟细胞多的植物组织，如芽、愈伤组织等材料有独到效果，本实验主要介绍去壁低渗染色体制片技术。

一、实验原理植物根尖的分生细胞的有丝分裂，每天都有分裂高峰时间，此时把根尖固定，经过染色和压片，再置放在显微镜下观察，可以看到大量处于有丝分裂各时期的细胞和染色体。

二、实验目的根尖染色体压片法，是观察植物染色体最常用的方法，也是研究染色体组型、染色体分带、染色体畸变和姊妹染色单体交换的基础。

学习醋酸洋红染色的具体操作方法，掌握植物有丝分裂制片技术，通过大量的制片观察，能比较快速准确地判断细胞有丝分裂前、中、后、末期的染色体图象，并对其典型制片照像。

三、实验材料大蒜（Aillumsativum）、洋葱（Aillumcepa）的鳞基或蚕豆（Viciafaba）的种子。

四、实验内容1、植物染色体制片技术训练，独立完成植物根尖、茎尖及幼叶的取材、预处理、固定、制片、染色等染色体制片全过程，并获得图象清晰、完整、高度分散的染色体典型图象制片；2、染色体显微照相技术训练，用生物摄影显微镜，摄制某新资源植物种典型的染色体图象照片40张，并从中挑选确定清晰的图片；3、细胞有丝分裂典型时期识别技能训练，通过大量的染色体图象观察，能比较快速准确地判断细胞有丝分裂前、中、后、末各个时期的。

五、实验器具和药品1、设备：普通生物显微镜、NIKON数码摄影显微镜、数码相机及打印机、培养箱、恒温水浴锅；载玻片、盖玻片、镊子、不锈钢剪刀、单面刀片、磨口三角瓶、移液管、棕色试剂瓶（200ml）、凹型孔白瓷板、玻璃板、烧杯(200ml)、天平、电炉、染色缸、扩大镜、游标卡尺、滤纸片、玻片标签纸、小台秤（200g）、量筒（10ml、50ml、100ml、1000ml）容量瓶（1000ml）、滴瓶、滤纸、牙签、切片盒等；2、药品及配制8－羟基喹啉、秋水仙素、KCl、甲醇、冰乙酸、对二氯苯(白色结晶，有樟脑气味、密封保)、α-溴萘、NaCl、KH2PO4、Na2HPO4、甘油、HCl、CaCl2、醋酸洋红、45%醋酸、卡宝品红等试剂。

试剂配制：0.002mol.L-18－羟基喹啉（染料中间体）配制：取8-羟基喹啉0.029g，先用少许乙醇溶解，用鲜蒸馏水定溶100ml。

0.01%秋水仙素配制：称取1g秋水仙素，用少许乙醇溶解后，用鲜蒸馏水定溶至100ml。

⑶饱和对二氯苯溶液配制：鲜配鲜用，称取5g对二氯苯结晶，用40-45℃蒸馏水100mL溶解，振摇5min，静置1 h，取上清液，10-20℃下预处理。

0.075mol.L-1KCL溶液配制：称KCL 5.592g，加少许鲜蒸馏水溶解后，定溶至1000ml。

⑽45%醋酸溶液配制：95%冰乙酸，稀释成45%浓度。

所需浓度（45%）=冰乙酸体积／溶液体积=45ml冰乙酸×0.95／（45+50）0.1mol.L-1盐酸溶液配制：用移液器取浓盐酸0.85ml，加蒸馏水至100ml。

浓盐酸的质量分数为36.5%1：250ml溶液中含HCL为0.25＊0.1＝0.025mol2：Hcl 的摩尔质量为36.5g／mol那么需Hcl的质量为0.025*36.5＝0.9125克3：算出总共需要浓盐酸的质量为：0.9125／0.365＝2.5g4：已知密度为1.18g/mL 那么需要浓盐酸的体积为2.5/1.18=2.12（毫升）铁醋酸洋红染液配制：先将50 mL 45%的醋酸水溶液放入150mL的锥形瓶中煮沸，然后移去火源，慢慢地加入0.5-1g洋红粉末（注意不要一下倒入，以防溅出），过1-2min后，加入一锈铁钉，再过几分钟后取出铁钉（使染色剂略含铁质，以增强染色性能），继续用微火加热1h后，冷却过滤，即可使用，保存于棕色瓶中（避免阳光直射）。

如无洋红也可用地衣红代替，配制方法同前。

此液常用于植物细胞核，特别是花粉母细胞的涂抹和压碎法染色，效果良好。

卡宝品红（Carbor fuchsin）试剂（石碳酸品红）的配制: 称3g碱性品红，溶于100ml70%的乙醇中，称为A原液（此液可以长期保存），取10mlA液，加入90ml15%的石碳酸溶液（两周内使用），称为B原液。

使用前，取B原液10ml，加入90ml45%的醋酸和1.8克山梨醇，充分溶解后备用。

此液适用于植物核型分析、染色体形态观察。

六、实验步骤1、取材一般来讲，凡是能进行细胞分裂的植物组织或单个细胞，都可以作为染色体制片材料；如根尖、茎尖、幼花、幼叶、幼胚、愈伤组织及正在分裂的大、小孢子母细胞等；正确取材就是强调取材部位一定要准确，取材数量一定要少而精、切忌多而杂，材料新鲜、尽可能是活材料。

先将种子浸泡1天，待吸水膨胀后移到铺有几层吸水纸的培养皿内，上面盖两层湿纱布加不少许，置于18-20℃（黑暗）培养40-50小时。

待根长至1-2cm时，于上午10时左右剪取。

⑴根尖用能见根冠的根尖材料作为实验材料比较适宜；植物根尖不同部位的细胞，其分裂细胞频率有明显的差别；根冠是由不同分化程度的薄壁细胞组成，且常含淀粉粒，根冠细胞已经停止细胞分裂，染色体制片时应该切除根冠；但因根冠很容易识别，且根冠后1-2mm长的根段就是根尖分生区细胞，所以，根冠是确定根尖分生细胞区的重要标志；染色体制片时，比较重视能见根冠的根尖材料作为实验材料比较适宜。

根尖分生细胞区多为等直径的分裂细胞，其细胞质浓，细胞核大、细胞核体积约占整个细胞体积的3/4，是染色体制片的好材料；染色体制片取材如果不是在根尖分生细胞区取材，即使制片全过程每一环节都作得很好，也是徒劳的。

根尖分生区上端是伸长区，该区的细胞主要是细胞体积增加，基本上已停止分裂。

所以，根尖染色体制片的取材部位是根冠末端1-2mm的根段为宜。

以洋葱为例，根冠区约0.5mm，分生区1－2mm，3mm之后为伸长区（图9-1）。

物种不同根冠及分生区的长度也不同，一般而言，用于染色体制片的根尖长度，以根冠末端1-2mm为宜。

图9-1 洋葱跟尖纵切面，各部分细胞分裂的频率差异植物体细胞染色体的研究中，根尖分生组织是主要的染色体制片材料；因为它取材方便，分生区易于区别，如果用种子发芽取根，还不受季节的影响，这是其他材料所不及的。

根尖材料获得的方法很多，常有种子发芽、鳞茎水培、扦插取根、引发气生根等。

①种子萌发取根：生长健壮的根尖不仅细胞分裂频率较高，而且染色体形态也比较平直，也就是所谓的“硬染色体”；而根尖生长势差的材料，不仅细胞分裂频率低，而且染色体形态也多是扭曲的，也就是所谓的“软染色体”。

所以，种子萌发取根，不仅要求种子的饱满度、生活力等品质性状好之外，还要求种子萌发条件最佳，获得最佳的“硬染色体”。

②鳞茎水培：洋葱、水仙、蒜、风信子等材料多用此方法；在水培过程中，注意经常更换新鲜的同温水，是获得良好材料的关键。

③扦插取根：杨、柳、桑、葡萄、菊花等扦插繁殖植物多用此方法；在扦插繁殖过程中，注意保湿通气，可以获得良好的根尖材料。

⑵茎尖用能见生长锥的茎尖材料作为实验材料比较适宜；茎尖一般包括有生长锥和叶原基两部分，广义上讲的芽，还包括有幼叶和腋芽原基。

生长锥是茎的顶端分生细胞组织区，不同植物或同一植物的不同发育阶段，其生长锥的大小和形状都有较大的变化，他们可以是下凹、园丘、园锥或极端伸长（如禾本科）等多种不同的形状；生长锥的宽度，因物种不同也不同；丁香生长锥宽度<40μm，苏铁生长锥宽度达300μm。

生长锥不同部位的细胞，其细胞分裂的频率及细胞周期长短有明显的差异。

一般来讲，生长锥则面的叶原基细胞比生长锥中心区细胞的分裂周期短一倍左右；如曼佗罗生长锥中心区及叶原基区细胞分裂周期分别为76、36h，菊花生长锥中心区及叶原基区细胞分裂周期分别为140、70h。

也就是说，生长锥则面的叶原基细胞也是染色体制片取材的好材料。

茎尖取材以生长锥顶开始1.0-1.5mm为宜，休眠芽不宜用作染色体制片的材料。

茎尖取材工作是比较繁复的，需要细心地剥掉全部幼叶，用扩大镜观察，能见生长锥时方可（图9-2）。

9-2 茶叶叶芽纵切面图物种不同，生长锥的形状及宽度，因物种不同也不相同，且易受季节影响；所以，茎尖取材技术难度比根尖取材技术要高。

茎尖的正确取材，更需要强调取材部位一定要准确，取材数量一定要少而精、切忌多而杂，应在扩大镜下，尽可能地剥除幼叶、尽可能地减少木质分子结晶的干扰。

2、预处理⑴目的及作用：植物有丝分裂中期染色体高度浓缩，形态和结构都比较清楚，但因纺垂体的作用，染色体紧密地排列在赤道板上，很难将其分开,尤其是染色体数目较多的植物材料，很容易产生染色体严重重叠；而且因细胞分裂中期维持的时间短，一般仅10-30min，使中期染色体细胞出现频率不高。

为了克服上述矛盾，常用化学或物理方法对材料进行预处理。

这些方法的作用机理及其作用是：①阻止或破坏纺垂体微管的形成，由于没有纺垂体的作用，细胞有丝分裂过程，被阻抑在细胞分裂中期阶段，从而累计比较多的处于细胞分裂中期的染色体图象。

②促进染色体浓缩变短，减少染色体之间相互缠绕重叠，有利染色体的高度分散。

③改变胞质粘度，促进染色体清晰，促进细胞质清洁。

所以预处理是否适宜，是染色体制片技术中最关键的操作步骤；如果预处理的效果良好，即使是初学者也不难制作出优良的染色体标本，反之，如果预处理失败，即使是很有经验的人也难以制作出好的制片。

⑵处理药剂可以用作染色体预处理的化学药品，主要有生物碱、甙类、酸类及其他物质；最常用的化学药品有秋水仙素、8－羟基喹啉及对二氯苯。

①秋水仙素（Colchicine）：是从石蒜科秋水仙素属秋水仙(Colchicum autumnale)种子或鳞茎中提取的一种生物碱，其分子式为C22H25NO6+1.5H2O，分子量为399.45。