微生物酶制剂生产流程
酶的生产
限量
<40mg/kg <10mg/kg 3mg/kg 不准含有 <5 ×104 不准含有 不准含有 <100 不准含有 <30
∆
培养基成分
C源：碳素是菌体成分的主要元素，是细胞贮藏物质
和各种代谢物的骨架，还是能量的主要来源。
酶制剂生产上使用的菌种大都是利用有机碳的异养型微生物。 有机碳主要来源：
一是农副产品中如甘薯、麸皮、玉米、米糠等淀粉质原料及 其水解物； 二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉质资源。 此外，目前研究以石油产品中12-16碳的成分等作碳源.如 以某些嗜石油菌生产蛋白酶、脂酶均已获得成功
产酶促进剂：
于培养基中添加某种少量物质，能显著提高酶 的产率，这类物质叫产酶促进剂。 大体上分为两种： 一是诱导物 二是表面活性剂。如吐温-20的浓度为0.1%时， 能增加许多酶的产量。表面活性剂可能是： （1）增加细胞的通透性； （2）改善氧的传递速度； （3）保护酶活性。通常用非离子型表面活性剂如聚 乙二醇、聚乙烯醇衍生物、植酸类、焦糖、羧甲 基纤维素、苯乙醇等。离子型的表面活性剂对微 生物有害，同时表面活性剂还必须对人、畜无害。
S17，厨房空气中 分离S56，马铃薯 中分离
S114 AS1.357
蛋白酶 L-天门 冬酰胺 酶
目前工业用主要酶的生产菌来源
微生物类 别
菌 名
产生 的酶
葡萄 糖异 构酶 碱性 蛋白 酶 异淀 粉酶
用途
所用菌号分离筛 选来源
D-80,酸泡菜中 分离 209，河南省平 顶山制革晒生皮 场地的土壤中分 离
目前主要商品酶制剂及其来源
葡萄糖氧化酶 半纤维素酶 橙皮苷酶 菊粉酶 脂肪酶 黑曲霉、生机青霉、尼崎青霉 黑曲霉 黑曲霉 假丝酵母、曲霉属 黑曲霉、米曲霉、圆柱状假丝酵母、根 毛霉、无根毛霉、小球菌、类地青霉、 胰脏、山羊舌腺等
第三章酶的生产
2023年5月15日星期一
第三章 酶的生产制备
酶的生产方式
1.提取法: 植物、动物、微生物
2.化学合成法
生物合成法： 利用植物、动物、微生物细胞合成。 上个世纪50年代起利用微生物生产酶
。 1949年细菌发酵生产淀粉酶
上个世纪70年代以来利用植物细胞和 动物细胞培养技术生产酶。
木瓜细胞培养生产木瓜蛋白酶和木瓜 凝乳蛋白酶 人黑色素瘤细胞培养生 产血纤维蛋白溶酶原激活剂
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2.生长偶联型中的特殊形式——中期合成型
酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生 长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。 特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。
所对应的mRNA是不稳定的。
枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线 35
3.部分生长偶联型（又称延续合成型）
酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入 平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。 特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。
所对应的mRNA相当稳定。
黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线 36
4. 非生长偶联型（又称滞后合成型）
只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并 大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。 特点：受分解代谢物的阻遏作用。
所对应的mRNA稳定性高。
黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线 37
总结：影响酶生物合成模式的主要因素
②发酵代谢调节：理想诱导物的添加，解除 反馈阻遏和分解代谢物阻遏（难利用的碳 氮源的使用，补料发酵）。
③降低产酶温度。
二、细胞生长动力学
微生物细胞生长的动力学方程：
Monod方程：
S－限制性基质浓度； μm—最大比生长速率； Ks —Monod常数
国内外常见酶制剂产品及生产方法
国内外常见酶制剂产品及生产方法(饲料酶）摘自中国酶网 05年左右的资料市场上常见的复合酶制剂:生产商代表性产品主要标识酶活种类丹尼斯克动物营养爱维生保安生 ( 木聚糖酶等…复配)德国AB酶制剂艾克拿斯(Econase®) ( 木聚糖酶+葡聚糖酶…复配)法国安迪苏罗酶宝 ( 木聚糖酶等…单菌发酵)帝斯曼动物营养乐多仙VP ( 葡聚糖酶+果胶酶…复配)奥特奇Alltech. 特威宝SSF ( 葡聚糖酶+淀粉酶+植酸酶...固体自然发酵 )美国genmchen 和美酵素® ( 甘露聚糖酶 )建明 kemin 八宝威® W ( 木聚糖酶+淀粉酶…复配)日本新水饲乐酶 ( 木聚糖酶+蛋白酶+淀粉酶+..液体自然发酵 )泛亚太保来康 (复合酶)华芬酶华芬酶 (复合酶)英恒酶制剂英恒酶 (复合酶)溢多利公司溢多酶 (木聚糖酶,植酸酶单酶,复合酶)华扬生物华扬酶 (木聚糖酶,甘露聚糖酶,植酸酶单酶,复合酶)挑战集团特节酶 (木聚糖酶,植酸酶单酶,复合酶)夏盛公司夏盛酶 (木聚糖酶…各种单酶,复合酶)尤特尔公司尤特尔 (木聚糖酶…各种单酶,复合酶)总结:1.绝大多数酶制剂来源于基因工程菌株液体发酵方法生产 ( 特威宝罗酶宝除外)2.绝大多数酶制剂的主要作用成分为木聚糖酶等NSP酶. (和美酵素速美肥除外)3.国内酶工业发展都以购买单酶复配为主, 后来部分企业获得木聚糖等酶生产技术4.部分企业采用自然固体发酵的方法生产酶制剂. (奥特奇) ,部分产品关注于分解豆粕等原料( 和美酵素-甘露聚糖酶速美肥-半乳糖苷酶系)现场效果评估:1.稳定性耐温性改善率, 进口产品明显较好.2.市场反映最好的酶制剂:爱维生.保安生丹尼斯克公司生产 , 效果显著,添加量300-500g罗酶宝安迪苏公司生产, 效果显著添加量500gEconase 德国AB酶制剂公司, 效果显著,添加量15-20g和美酵素美国Genmchen公司, 豆粕含量较高的肉鸡料反映较好.目前市场占有率, 爱维生, 和美酵素在一条龙式企业肉鸡料中液体酶市场占有率较高.酶制剂的生产方法:1) 酶制剂可以由真菌.细菌等产酶微生物来生产. 大部分企业采用基因重组的真菌, 部分企业采用细菌发酵.( Nutrex , 罗氏植酸酶) .2)通常发酵产物经过分离.浓缩.纯化后得到高浓度的单酶, 根据需要复配成不同产品.( 保安生, Econase , 乐多仙等 )3)使用单一菌株生产出多种酶系的多酶复合物 ( 罗酶宝等)4)使用固态发酵技术生产天然的含酶复合物( 特威宝等 )对酶的特性了解—不知道的超过我们已知道的 ?1)用酶活来评估动物生产中的实际效果? 目前酶制剂没有统一的标准, 酶活高低并不能用来预测产品的相对性能.2)来源于不同基因源的酶在分解底物时可能存在较大差异? 例如木聚糖的结构复杂, 存在大量的同工酶. 不同来源的木聚糖酶作用相同底物时也会存在较大差异.3)耐温性的问题 . 最近诺伟司有耐高温的植酸酶推出, AB Enzymes在欧洲上市了耐高温的Econase TX . 目前绝大多数酶制剂耐温性不超过80度, 部分厂家宣传耐温90度以上?4)酶制剂的添加量? 出于商业因素,很多酶制剂的推荐剂量不到标准量的一半,用户由于成本因素选择了偏低的剂量,往往影响到了产品的使用效果.饲用酶制剂经过20多年的反展,正逐步走向成熟. 而且技术的进步使加酶成本大幅降低.然而, 酶制剂的研发和评价相当复杂 . 以上分析, 仅希望饲料厂能更好的应用酶制剂这项技术。
食品级酶和工业级酶
工业常用的酶纯化的方法主要有凝胶过滤、 吸附层析、离子交换层析、选择性热变性 及利用酶和杂蛋白在两个相中的分配系统 不同进行分离等方法。
医学ppt
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凝胶层析又称凝胶过滤，分子排阻层析、分 子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定 相，利用流动中所含各种组分的相对分子 质量不同而达到物质分离的一种层析技术。 其操作简单、方便，不需要再生处理即可 反复使用，适用于不同相对分子质量的各 种物质的分离，已经在实验室和工业生产 中广泛应用。
食品级酶和工业级酶
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微生物酶的生产可以根据市场的需求来进行灵活 的调节。目前对微生物酶的开发品种很多，根据 市场需求，厂家可以提供不同等级的酶制剂。工 业级的酶制剂纯度要求不高，食品级酶和医药级 酶的酶制剂纯度要求很严格，而且要进行产品毒 性和安全性的评价。因为新型微生物在食品和医 药界的应用必须得到法定机构的安全性确认，整 个过程需要大量资金投入，因而，目前大多数食 品工业微生物酶的生产菌还仅限于11种霉菌，8种 细菌和4种酵母菌。
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吸附层析是利用样品中不同分子和吸附剂间 的吸附与解吸性质不同而使混合物各组分 分离的方法，是各种层析技术中应用最早 的技术。由于吸附剂来源丰富，价格低廉, 可以再生，吸附设备简单，至今仍在实验 室和工业生产中广泛应用。
吸附包括物理吸附、羟基磷灰石吸附、离子 交换吸附。
离子交换层析是依据被分离物质与离子交换 剂上活性基团间异种电荷的静电引力的不 同来进行物质分离的一种分离方法。
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·抽提是将酶制剂从原料中抽提出来制成酶溶液；
·纯化则是要将酶和杂质分离开来，或者选择性地将 酶从包含杂质的溶液中分离出来，或者选择性地 将杂质从酶溶液中移除出去。
酶的生产方法.ppt
（五）生产种子的制备
生产种子：由原始保藏菌种，经过活化，扩大培养，用 于发酵罐接种的大量菌体。
1、种子制备工艺过程
养
接种至发酵罐
（1 ）菌种活化
目的：保藏的菌种在用于发酵生产之前，必须接 种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下培养，以 恢复细胞的生命活动能力。
为此，在有些酶的发酵生产过程中，要在不同的发酵阶段 控制不同的温度，即在微生物生长阶段控制在生长的最适温度 范围，而在产酶阶段控制在产酶最适温度范围。
（3）温度的控制方法
一般采用热水升温，冷水降温。因此，在发酵罐中均设有 足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管，夹套、喷淋管等。
4、酵母
啤酒酵母：丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等。
假丝酵母：脂肪酶、尿酸酶、尿囊酸酶、转化酶、醇脱氢 酶等。
工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源
酶 α-淀粉酶
产酶微生物
枯草芽胞杆菌 地衣芽胞杆菌
米曲霉
用途
淀粉液化，织物退浆，消化 助剂，加酶洗涤剂
米曲霉，黑曲霉， 制造葡萄糖，发酵、酿酒等
葡萄糖淀粉酶
此外石油产品中12碳—16碳的碳氢化合物已成功用作微生 物培养基的碳源。
注意：在选择碳源时，应尽量选择对所需酶有诱导作用的 碳源，而不使用或少使用有分解代谢物阻遏作用的碳源。
2、氮源：提供氮元素。
来源：①有机氮：常利用农副产品的籽实榨油后的 副产品，如豆饼、花生饼、菜子饼等；
②无机氮：含氮的无机化合物，如（NH4）2SO4、 NH4NO3 、NaNO3和（NH4）3PO4等。
玉米粉 8%
豆饼粉 4%
磷酸氢二钠 0.8%
硫酸铵
0.4%
氯化钙
0.2%
氯化铵
酶的生产
酶的生产酶的生产是指经过预先设计，并且通过人工控制而获得所需要的酶的过程。
概括地说，酶的生产方法有提取法、发酵法和化学合成法三种。
提取法是最早采用并且一直沿用至今的一种方法。
提取法采用各种技术，直接从动植物或微生物的细胞或组织中将酶提取出来。
提取法虽简单易行，但必须要有充足的原材料，这就使提取法的广泛应用受到了限制。
但是，在动植物或微生物资源丰富的地区，提取法仍然具有应用价值。
例如，在屠宰厂，可从家畜胰脏中提取胰酶；在水果加工厂，可从菠萝皮中提取菠萝蛋白酶。
发酵法是20世纪50年代以来生产酶的主要方法。
发酵法主要通过微生物发酵来获得人们所需要的酶。
发酵法一般包括固体发酵、液体深层发酵、固定化细胞发酵和原生质体发酵等多种方式。
化学合成法是20世纪60年代末出现的一种生产酶的新技术。
1969年，美国科学家首次采用化学合成的方法获得了含有124个氨基酸的核糖核酸酶。
但是，化学合成法的成本比较高，并且只能合成那些已知化学结构的酶。
所以，化学合成法目前仍然停留在实验室内合成的阶段。
溶菌酶（Lysozyme ）是采用生物工程技术, 调节蛋白PH 值及用离子交换树脂吸附分离而得。
分子量为14307 ，是一种糖苷水解酶，可以溶解革兰氏阳性菌的细胞壁，对其有较强的杀灭作用，也可用于结晶蛋白溶菌酶制剂，防止食品变质，在食品保鲜（特别是奶酪、清酒生产）、医药（药片、胶囊、眼药水、润喉液）、日化（牙膏、化妆品）、婴儿食品（母乳化奶粉）及科学研究中有着广泛的应用。
中性蛋白酶是由枯草芽孢杆菌经发酵提取而得的，属于一种内切酶，可用于各种蛋白质水解处理。
在一定温度、PH 值下，本品能将大分子蛋白质水解为氨基酸等产物。
可广泛应用于动植物蛋白的水解，制取生产高级调味品和食品营养强化剂的HAP 和HVP ，此外还可用于皮革脱毛、软化、羊毛丝绸脱胶等加工。
碱性蛋白酶是经细菌原生质体诱变方法造育的2709枯草杆微生物通过深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，属于一种丝氨酸脆外高碱性蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力。
第三章 酶的发酵生产
五、温度的调节控制
1、温度对酶的发酵生产的影响
在发酵初期，细胞吸收营养物质合成自身物质和酶， 吸热反应，培养基中的营养物质被大量分解释放热 反应，但此时吸热反应大于放热反应，培养基需升 温；
当细胞繁殖迅速时，情况相反，需降温维持细胞生 产繁殖和产酶所需的最适的温度。
细胞（微生物）生产繁殖和产酶的最适温度随菌种 和酶的性质不同而异，并且生长繁殖和产酶的最适 温度往往不一致。 一般，细菌为37℃，霉菌和放线菌为28～30℃， 一些嗜温微生物需在40～50℃生长繁殖， 如：红曲霉的生长温度为35℃～37℃，而产糖化 酶的最适温度为37 ℃～40 ℃。
1、划线分离法
将样品制备适当的稀释液，用接种环蘸取样品 稀释液在培养基平板上分区划线分离，然后培养直 至单个菌落出现。
2、稀释分离法
五、菌株产酶性能鉴定
1、平板透明水解圈法
透明圈直径与产酶的关系： lg[E] / D=k· △[C] / lgt R/r·
其中：
[E] ：产酶浓度； D：菌体量； R：水解圈； r：菌落直径；△：琼脂厚度；[C] ：底物浓度； t：培养时间； k：常数。
（一）固体培养发酵（传统的方法）
一般适合于真菌发酵。
（二）液体深层发酵：
①适用性强，可用于各种细胞的悬浮培养和发酵。 ②易于人为控制。 ③机械化程度高，酶产品质量好，酶产率及回收 率较高。
（三）固定化细胞发酵（70年代后期）
1、优点：重复使用、易于分离、易于机械化、 抗逆性强、效率高。 2、缺点：产品质量不够稳定、易受传质和氧 的限制。
4、滞后合成型
只有当细胞生长进入平衡期后，酶才开始合成并大 量积累。许多水解酶类属于此类。 它们在细胞对数期 不合成，可能是受 到分解代谢产物的 阻遏作用，当阻遏 解除后，酶开始合 成，其对应的 mRNA稳定性高。
在食品制造中的主要微生物及其应用
白黎芦醇具有多种保健和 医疗功能，其主要功能 有； ①具有抗动脉粥样硬化、冠心病、缺血性心脏病 及高血脂症的作用。 ②具有明显的抗氧化、清除自由 基 、抗衰老作 用。 ③具有抗血小板凝集、抗血栓作用。
④具有抗癌、抑制肿瘤的作用。
原料：葡萄 主要菌种：葡萄酒酵母
食品制造中的 主要霉菌及其应用
一、酱类 二、酱油 三、柠檬酸 四、苹果酸
生产工艺 P219
葡萄酒
葡萄酒：由新鲜葡萄或葡萄汁通过 酵母的发酵作用而制成的一种低酒 精含量的饮料。
葡萄酒 按含糖量的多少分： 干型葡萄酒： 该酒中含糖量在4g/L以 下，一般尝不除甜味 半干型葡萄酒：该酒中含糖量为（4－ 12）g/L，微弱甜味 半甜型葡萄酒：含糖量为(12-50)g/L， 有明显的甜味 甜型葡萄酒：含糖量在50g/L以上，有 特别浓厚的甜
双歧杆菌的益处：
预消化牛乳中的乳糖、蛋白质，使之分 解为人体容易吸收的小分子物质。
产生双歧杆菌素，杀灭肠道中的致病菌。 能分解积存于肠胃中的致癌物质N－亚硝
基胺，防止肠道癌变
提高免疫能力
发酵乳制品中的风味化物质：
乳糖的乳酸发酵是所有发酵乳制品 所共有的和最重要的乳糖代谢方式， 乳酸则是发酵乳制品中最基本的风 味化合物。一般乳液中含有4.7％～ 4.9％的乳糖，它是乳液中微生物生 长主要的碳源和能源。
微生物酶制剂的生产
（一）、菌种的选择： 条件： 1、酶产量高 2、容易培养和管理 3、产酶稳定性好 4、利于酶的分离纯化 5、安全可靠
（二）、产酶培养： 固体培养法： • 原料：麸皮或米糠 • 辅料：谷糠、豆饼 • 优点：产酶量高，原料简单，不易
污染，操作简便，酶提取容易，节 省能源。
• 不足：不便自动化和连续化作业， 占地多，劳动强度大，生产周期长。
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微生物酶制剂生产流程
中文：微生物酶制剂生产流程
一、晶体育种和细胞培养：
1、从有机物源（如蔗糖）中收集富含微生物细胞的高纯度晶体悬液；
2、将悬液种类到培养皿中，并保持适宜的温度和湿度，以育种和培养微生物细胞；
3、观察晶体生长、菌种育种、液体培养和固体培养；
4、将晶体培养断裂并保存，用于生产。
二、酶制剂的生产：
1、在适宜的温度、湿度和氧气浓度下，在细胞培养液中加入氯化钠，改变液体环境条件，以较低的温度和pH值来代谢酶；
2、将酶回收有结晶体的悬液，收集反应液以获取原细胞培养液；
3、将原细胞培养液调整为适宜的pH，用离心机将其分离，以提取酶；
4、将分离的酶结晶，收集结晶体，用离心机再次分离酶，以获得酶制剂；
5、将酶制剂用水或溶液冲洗，以清除杂质，并使其达到最终生产标准。
三、酶制剂制备前的检测：
1、检查微生物细胞培养液的活力，并分析模拟培养液；
2、检查原细胞培养液中微生物的浓度；
3、检查细胞悬液和酶的浓度，以确定育种过程中酶的生产效果。
四、酶制剂的最终制备
1、使用超过60℃的高温水和酶，使其稳定；
2、按照规定的浓度将酶加入制备液，维持良好的稳定性；
3、加入抗氧化剂，保证酶活性；
4、按照不同的标准要求，将酶制剂装入容器；
5、检查完成的酶制剂，确保纯度和活性，达到生产标准。