奶粉中三聚氰胺的测定——文献综述

高效液相色谱(HPLC-UV)法测定奶粉中

三聚氰胺的含量

摘要：本文介绍了三聚氰胺对人体的危害，不法厂家向乳制品中掺入三聚氰胺的原因以及各种检测奶粉中三聚氰胺含量的方法，包括液相色谱-紫外法，气相色谱-质谱法，荧光光谱法，电化学方法，毛细管电泳法等。

关键词：三聚氰胺；奶粉；液相色谱；荧光光谱；气相色谱-质谱联用；

三聚氰胺：

三聚氰胺(melamine)化学式为C3H6N6，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，俗称密胺、蛋白精。

三聚氰胺的危害以及不法厂家掺入三聚氰胺的目的：

2008年9月发生了“毒奶粉”事件，很多生产奶粉的公司非法向奶粉中添加三聚氰胺以提升奶粉中的氮含量。由于三聚氰胺(含氮量66%)与蛋白质(平均含氮量16%)相比含有更高比例的氮元素，所以被一些不法分子利用，添加在食品中以造成食品蛋白质含量较高的假象。由于当时国家使用的蛋白质中氮含量的测定方法是凯氏定氮法通过样品消解将样品中所有氮元素转化为氨，通过H2SO4或HCl标准溶液进行滴定，所以无法区分蛋白质氮和非蛋白质氮，掺入三聚氰胺可以提升氮含量从而达到提升“蛋白质含量”的目的[2]。然而三聚氰胺对人体是有危害的，尤其奶粉是给小孩子吃的，危害更大。大剂量的三聚氰胺导致当时很多食用奶粉的婴幼儿出现泌尿系结石。研究表明，三聚氰胺对肾小球、肾小管功能有损害, 且年龄越小、服用三聚氰胺污染奶粉时间越长损害程度越重[3]。

2008 年10 月7 日，卫生部等5 部门联合发布公告，确定了乳与乳制品中三聚氰胺临时管理限量值（即婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值）为1 mg/kg，液态奶(包括原料乳)、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值为2.5 mg/kg。

三聚氰胺含量测定的各种方法：

1.高效液相色谱法:

1.1.实验方法：[4]

以三氯乙酸-乙腈超声提取后离心，取上层清液过滤后定容，转移至混合型阳离子交换固相色谱柱用氨化甲醇洗脱，50℃下氮气吹干，用流动相定容，涡旋，过微孔滤膜后供HPLC 测定，测定条件：C18柱（250mm*4.6mm，5μm），流动相为离子对试剂缓冲溶液-乙腈（90：10），流速1.0mL/min，柱温40℃。测量波长240nm。

1.2.小结：

该法预处理过程略复杂；色谱流动相添加的离子对试剂（己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠等）易与C8 或C18 柱形成化学结合，所以柱平衡时间长，选择性差；而离子对试剂的使用将缩小各物质间的差异，奶粉中多种物质（如水溶性维生素、核酸等）均可与离子对试剂结合并

在色谱柱中形成保留，严重干扰目标成分测定。[1]

而且，该法的检测限为2mg/kg，比国家规定的婴幼儿奶粉的三聚氰胺的限量值1mg/kg 要高，也就是说该法对于婴幼儿奶粉中三聚氰胺含量的检测不达标。只能用于检测非婴幼儿的液态奶、奶粉中三聚氰胺的含量（限量值为2.5mg/kg）。

2.气相色谱－质谱联用法：

2.1.实验方法：[5]

取待测样品放入的聚酯离心管中，再加入0．1 ml 的苯代三聚氰胺做内标,涡旋混匀后加入提取液20 ml再涡旋1 min超声提取，离心10 min。取1 ml 置于2ml的GC进样瓶中氮气吹干，准备衍生化。在吹干的样品残渣中加入200μl含1% TMCS的BSTFA衍生剂及200μl吡啶，充分涡旋混匀后，置(70 ± 5) ℃的烘箱中，衍生反应45 min，冷却至室温后供分析测定。

色谱和质谱条件：DB-5 TH 石英毛细管柱( 15m ×0.25 mm，0.10μm) ; 进样口温度: 280 ℃; 质谱仪接口温度:280 ℃; 程序升温: 初始温度75 ℃，以15 ℃ /min 升至300 ℃，保持5 min; 进样模式: 无分流进样; 进样量: 1 μl; 载气流速:1 ml /min。

2.2.小结：

该法预处理较简单，分析速度快，检出限符合要求。适合用于奶粉中三聚氰胺类有机会含量的测定。

检出限实验结果表明，在0.1 ～ 50.0 mg /L 范围内峰面积( Y) 与浓度( x) 呈现出良好的线性关系，相关系数r = 0.9998。结合质量浓度为0.1 mg /L 的混合标准溶液谱图，根据信噪比( S /N) 为3计算三聚氰胺的检出限。结果表明，该方法的检出限为0.1μg/g，即0.1mg/kg。

回收率实验表明，回收率在101%到106%之间，符合测量要求

3.荧光光谱法：[6]

3.1.实验原理：

三聚氰胺能够与荧光素在水溶液中发生作用, 使荧光素的荧光强度增强, 且在一定浓度范围内, 荧光强度与三聚氰胺的浓度成线性关系, 据此建立了一种新的测定奶制品中三聚氰胺的荧光分析方法。

三聚氰胺呈弱碱性, 荧光素为酸性染料, 二者发生相互作用, 使荧光强度增大。随着三聚氰胺浓度的增大, 与荧光素发生作用的三聚氰胺越多, 荧光强度越大, 且在一定范围内加入三聚氰胺的量与荧光素的荧光强度成线性关系。

3.2.实验条件选择：

a.pH 7.0时, 荧光强度最大;

b.实验选择质量浓度为0.05mg /L的荧光素溶液;

c. pH 7.0时, 质量浓度为0.005mg /L的三聚氰胺溶液和0.05mg /L的荧光素溶液混合, 每隔 2h对其测定一次荧光强度, 可以测得荧光素与三聚氰胺作用需要一定的时间, 体系在12h之后荧光强度达到最大, 即三聚氰胺和荧光素的基本反应完全。

3.3.实验方法：

取1g奶粉样品, 加入5mL三氯乙酸水溶液(10.0g/L)充分振荡, 加入0.5mL乙酸铅水溶液(22.0g/L), 加入2mL三氯甲烷, 充分振荡混合2min,4000r/m in离心2min;取上清液经0.45μm有机系滤膜过滤。

将荧光素和不同浓度的三聚氰胺混合, 将样品溶液放置12 h, 测定荧光强度随浓度的变化关系。样品也做同样的处理，在标准曲线上求出三聚氰胺的含量。

3.4.小结：

该法的最大特点是检测限低，适用于痕量三聚氰胺分析。检测限为0.0985μg/kg。线性范围在0.5~10μg/kg。回收率在95%到96%，符合测量要求。预处理过程也比较简单，但是反应时间较长（12小时），且线性范围不在测量奶粉中三聚氰胺含量的范围内。但是线性范围低，可以稀释后测定，所以仍然符合我们的测量要求。

4.高效液相色谱法（改进）：[1]

4.1.实验方法：

将15.00 g 样品置于50ml 具塞刻度试管中，加入22 g/L 乙酸铅溶液5 ml，加入25 ml 甲醇-水溶液（1+1），漩涡混匀，加水至刻度，漩涡混匀，振摇2 min 后，过滤，取上清滤液，经0.45 μm有机相滤膜过滤后进样。

检测条件：键合磺酸基的强阳离子交换C18 色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以50 mmol/L 磷酸盐缓冲溶液+乙腈（70+30）作为流动相，流量为1.0 ml/min，柱温为25 ℃，检测波长为240 nm，进样量为20 μl。

将三聚氰胺标准储备液（1.00×10^3 mg/L）用甲醇-水溶液（1+1）逐级稀释得到浓度为0.20、0.50、2.00、5.00、20.00、50.00 mg/L的标准系列溶液，以峰面积（y）对浓度（x）绘制标准曲线。

4.2.小结：

该法检出限为0.05 mg/kg，线性范围在0.2～50mg/L。改进了国标法，操作较简单快速，回收率与灵敏度都较高。适合用于分析乳制品中三聚氰胺残留量。

5.电化学方法：[7]

5.1.实验方法：

先用三氯乙酸溶解牛奶样品，通过固相萃取提取其中的三聚氰胺。将玻碳电极在含三聚氰胺的牛奶样品提取液中进行循环伏安法扫描，在0.7V 左右会出现一对氧化还原峰。这一对峰的峰电流的大小与三聚氰胺的含量呈正比，据此可进行三聚氰胺的定量分析。

5.2.小结：

此峰电流与三聚氰胺含量在15～345mg/kg 的范围内呈线性关系，该方法检测三聚氰胺的检测限为5mg/kg，测定方法的回收率和相对标准偏差分别为97.3%～101.2% 和3.5%～

4.5%。检测限偏高，标准偏差也偏高。该法主要还是三聚氰胺的定性检测，用于定量有点不大合适。

6.毛细管电泳法：[8]

6.1.实验方法：

采用高效毛细管电泳法测定，以30mmol/L 磷酸盐缓冲液(pH5.0)为电泳介质，未涂层石英毛细管(75μm× 78cm，有效长度70cm)为分离通道，紫外检测波长240nm，分离电压10kV。

6.2.小结：

在10.0～50.0μg/mL 范围内线性关系良好，r=0.9992。平均加标回收率为97.04%，平均RSD 为1.24%(n=3)。该法快速简便，线性范围略偏高，标准偏差较小，可以用于三聚氰胺含量的定量分析。

7.非线性建模红外光谱法：[9]

7.1.实验方法：

选取1550 cm^-1附近特征吸收峰，依据动力学、数学建模及优化理论[10]，建立非线性定量模型[11]。以吸光度对三聚氰胺浓度作图，建立非线性模型，即可求出待测样品的三聚

氰胺含量。

7.2.小结：

非线性模型具有更高的准确度，用于样品定量的模型相关度为0.9227，样品回收率为96%。该法虽然为一种可行的定量方法，但是我们完全有更合适的方法来测量三聚氰胺的含量。

8.分光光度法：(注：该法不是测定三聚氰胺，而是测定乳制品中真蛋白质的含量）

8.1.实验方法：[12]

样品和试剂自动同时定量，分别同时被注入到超纯水和缓冲液中，以合并带中试样包裹试剂的方式进行汇合、反应，生成的蓝色络合物进入流通检测器，在595 nm 下进行定量分析。得到的最佳测定条件为: 反应试剂中考马斯亮蓝的浓度为150 mg /L，缓冲液中HCl 的浓度为1.0% ( V/V) ，NaCl 的浓度为0.1 mol/L，采样体积为150 μL，显色剂注入体积为30 μL，反应盘管长度为200 cm，系统总流量为2． 65 mL/min，分析速度为60 样/h。

8.2.小结：

方法的线性范围为0.5 ～ 15.0 mg /L; 相对标准偏差小于1.9% (n=11)，检出限为0.05 mg /L，回收率为93.9% ～107.3%.本系统的人为误差小，自动化程度高，重现性好，分析速度快，且不受三聚氰胺、尿素等假蛋白的干扰，实现了对乳制品中真蛋白质含量的简便、快速、准确测定。

总结：

色谱类方法比较适合测定三聚氰胺含量，红外非线性建模与电化学方法可以用来作为大致的定性或半定量判断，此外，荧光法、毛细管电泳法也各具优势。结合实验室仪器以及测定要求，我们选择高效液相色谱法进行测定。

引用：

[1]吕东晋等，《乳制品中三聚氰胺的快速液相色谱测定法的改进》，环境与健康杂志，第27卷，第8期；

[2]冯旭东等，《蛋白质快速检测仪测定乳及乳制品中蛋白质》，Chinese Journal of Analytical Chemistry，第39卷，第10期；

[3]唐骁爽等，《三聚氰胺致泌尿系结石患儿尿肾功测定的意义》，西安交通大学学报（医学版），第32卷，第4期；

[4] GB/T 22388-2008;

[5]娄大伟等，《气相色谱－质谱联用法测定奶粉中的三聚氰胺》，安徽农业科学第40卷，第17期；

[6]刘金彦等，《荧光光谱法测定奶制品中的三聚氰胺》，分析实验室，第29卷，第9期；

[7]金根娣等，《电化学方法快速测定牛奶中的三聚氰胺》，食品科学，第32卷，第18期；

[8]李志伟等，《高效毛细管电泳法测定奶制品中三聚氰胺含量》，食品科学，第31卷，第2期；

[9]张恒等，《非线性建模红外光谱法测定三聚氰胺的研究》，安徽农业科学，第39卷，第1期；

[10]石振东，刘国庆，《实验数据处理与曲线拟合技术》，哈尔滨船舶工程学院出版社，1991: 206－234；

[11]张恒，许兆棠，《红外光谱非线性建模定量分析方法》，中国，CN101368905A［P］.2009 －02－18；

[12] 梁琴琴等，《流动注射分光光度法快速测定乳制品中的蛋白质含量》，分析化学研究报告，第39卷，第9期；