杯碟法测定抗生素的效价
抗生素效价计算过程
USP Cylinder-plate assay 美国药典 管碟法---（标准曲线法）1、 美国药典规定的管碟法抗生素效价方法简述：首先制备5个标准溶液浓度（U/ml ），分别为S1、S2、S3、S4和S5，其中S3为中间浓度。
除S3外的每个浓度准备3个碟子，每个碟子放置6个牛津杯，其中不相连的三个分别加入Si （i 为1、2、4或5），另外三个不相连的加入S3。
待检样品（Unknown ）加样方式如Si ，具体放置方法如下图1：图1：标准及样品管碟放置方式图例2、在以上方法的基础上以具体数据进行计算举例： 下表2为按以上方法进行抗生素效价检测的一组测量结果：表2：抗生素效价检测测量结果表Replicate1Replicate2Replicate3Set S1 Set S2 Set S4 Set S5 Sample U1备注：Zone1、3、5表示每个平皿中不相连的三个S3的直径值；Zone2、4、6表示每个平皿中不相连的三个Si的直径值；U1表示待测样品1。
2.1 进行初始计算：对于每种浓度的三个平板，分别求出得到的9个中间浓度标准品的平均值以及9 个Si和U1直径的平均值。
例如：15.867=（16.1,15.6,15.8,16.0……15.8）9个数据的平均值14.167=（14.6,14.1,13.5,14.5……14.1）9个数据的平均值2.2 变异性的适用性检查：然后求出每三个平板得到的9个数值的标准偏差（包括标准对照和样品的），进而计算出其相对标准偏差值（RSD，该值应不超过10%）。
例如：标准偏差0.200 = s(16.1, . . ., 15.8)相对标准偏差1.3% = (0.200/15.867) *1002.3 进行平板间的差异校正：计算公式如下。
X C = X S– (X R– P)X C = 标准品平均值的校正值X S = 原始的标准品的平均值X R = 对照值的平均值P = 校正值例如：14.022 = 14.167 – (15.867 – 15.722) = 14.167 – 0.1452.4 建立标准曲线：标准曲线由2.3计算的标准品平均值的校正值Xc和标准品浓度值的对数值构成。
管碟法测定抗生素效价
管碟法测定抗生素效价
原理
抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相
一致、用量少和灵敏度高等优点。
管碟法是琼脂扩散法中的一种，已被各国药典广泛采用，
作为法定的抗生素生物检定方法。
当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度
高而边缘浓度低。
因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑
制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。
根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌
圈直径的平方成线性关系。
实验步骤
1. 配制标准品溶液
2. 配制样品溶液
3. 制备菌悬液。
4. 制备平板：
（1）取6套无菌培养皿，分别加入约20mlLB培养基后，置水平玻璃板上凝固，作为底层。
（2）另取冷却至50?左右的50ml LB培养基，加入1ml试验菌悬液，迅速摇匀后，用10ml破口吸管取6ml混菌培养基倒在底层平板上，作为菌层，并放置在水平玻璃板上凝固。
5. 在培养基平板底部作好相应标记，用弯头镊子在每个培养皿中等距离放入4个牛津杯。
6. 用滴管分别将高、低浓度的标准品和样品溶液加入到牛津杯中，以滴满为度，换上皿盖。
7. 将培养皿平稳送入恒温箱，37?下培养16～18h。
8. 用游标卡尺测量抑菌圈直径。
《生物制药技术》实验五
《生物制药技术》实验指导实验五、四环素生物效价测定（选作）一、实验目的1、了解杯碟法测定抗生素生物效价的基本原理。
2、掌握杯碟法测量抗生素效价的方法。
二、实验原理衡量发酵液中抗生素的含量称效价(titer或titre)，效价是评价抗生素效能的标准，也是衡量抗生素活性成分含量的尺度，它代表抗生素对微生物的抗菌效力，人们以1µg金霉素或四环素标准品为1个单位，0.6µg青霉素G钠盐为1个单位。
抗生素的生物测定方法有三大类：稀释法、比浊法以及扩散法。
扩散法中杯碟法(cup and plate method)或称管碟法(tube and plate method) 一种是常用的方法。
它是将已知浓度的标准抗生素溶液与未知浓度的样品溶液分别加到牛津杯(Oxford cup，一种标准的不锈钢小管)中，置于含有敏感试验菌的琼脂平板上进行扩散渗透，一定时间后抗生素在菌层培养基形成浓度由高到低的自然梯度，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。
测量出抑菌圈的大小，以计算抗生素的浓度。
在一定的浓度范围内，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，且在一定的试验条件下，可直接利用抑菌圈的直径近似地代替其平方，因而从样品的抑菌圈直径可在标准曲线上求得样品的生物效价。
将已知效价的金霉素标准液先制成标准曲线，根据被检品溶液的抑菌圈的大小，就可从标准曲线上查出效价的对数值，从中计算出相应效价，再乘以稀释倍数，即计算出待测样品中抗生素的效价。
因杯碟法是利用抑制敏感细菌的直接测定方法，所以符合临床使用的实际情况，而且灵敏度很高，不需要特殊的设备，故多被采用。
但此法也有缺点，即操作步骤多，培养时间长，获得结果慢。
尽管如此，由于它的独特优点，仍然被世界各国所公认，作为国际通用的方法被列入各国药典中。
三、实验材料及设备（一）实验材料1、菌种：工程菌：金霉素链霉菌（Streptomyces aureofaciens）。
抗生素微生物检定管碟法在中国药典2005版的应用及操作要点
抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法；（2）比浊法；（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。
各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。
管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。
此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。
原理：利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用，依据量反应平行线原理并采用交叉实验设计方法，在相同实验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）大小，来测定供试品效价的一种方法。
管碟法的操作步骤：1、预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在16～17.5mm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm。
2、试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。
3、双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固后，将双碟放入35～37℃培养箱中，待用。
4、供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。
5、菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量，注意制备菌层的速度和平整度。
6、滴加抗生素溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。
7、双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层为宜。
8、抑菌圈的测量：抑菌圈测量仪的使用，每组试验双碟应在相同的测量参数下进行测量。
管碟法（牛津杯法）的注意事项
管碟法（牛津杯法）的注意事项
(1)对于一般的抗生素测定来说,大多数情况下都需要把牛津杯加满,但作者在实际测定中发现,若加满牛津杯,培养24 h后牛津杯内仍有将近一半的残留溶液。
(2)管碟法测定Nisin 效价时,控制检测平板中菌悬液的浓度非常重要,过浓则抑菌作用不明显,过低则菌体生长稀疏,抑菌圈不明显或者不规则,难以准确测量
(3)过高的琼脂质量浓度(2 g/ dL 以上)冷却至50 ℃以下倒平板时,很快就会凝固,不便于制备菌层;而琼脂质量浓度太低时(低于1 g/ dL) ,培养基不容易凝固, ,产生的抑菌圈亦不太规则.
(4) 抗菌肽在牛津杯中的球形扩散过程中上层培养基越薄,越有利于抗菌肽的横向扩散,以及培养基越薄指示菌数相对更少一些故而抑菌圈大。
（5）加注的培养基如果温度太低，就容易结块不能均匀铺开，应为60-80o C.加注培养基底层之后，不应该立即给双碟加盖，以避免形成水蒸气。
（6）可以事先把配制好的培养基分装在具塞试管内，每管5mL，湿热灭菌后放在50o C水浴锅内保温。
试验中，再分别加入菌液混匀，配制成带菌琼脂，继续保温5min使培养基温度回升，倒在底层培养基上，迅速转动双碟使培养基均匀铺开。
（7）放置小钢管时，注意管与管之间、管与双碟边缘不能太靠近。
（8）滴加时离钢管口距离不要太高，一旦滴管中出现气泡或者残留，就重新吸取抗生素溶液进行滴加，滴管口应避免太细。
滴加时若有溅出，可用滤纸片轻轻吸去。
滴加后，液面应与小钢管口齐平，液面反光显黑色。
（8）双碟放入培养箱内，要与箱壁保持一定的距离，双碟叠放不能超过3个。
（10）测量抑菌圈直径时，不易取去小钢管或把双碟翻转过来测量抑菌圈直径。
管碟法抗生素效价测量实验
管碟法抗生素效价测量实验抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相一致、用量少和灵敏度高等优点。
管碟法是琼脂扩散法中的一种，已被各国药典广泛采用，作为法定的抗生素生物检定方法。
当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。
因此，当抗生素浓度达到或高于mic（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。
根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系。
实验简介在管碟法抗生素效价测量实验中需要注意的影响因素分析及对策如下:管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法[1]，利用管碟法测定抗生素效价，具有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用。
但是整个试验过程中影响结果的因素很多，任何一个环节操作不当或者忽略就会造成很大误差，导致整组试验失败。
根据实际操作中的积累经验，对管碟法中影响试验结果的因素进行如下分析及提出解决的方法。
实验器材的准备1.1 实验器材的选择试验应该选择底面平整的玻璃双碟，避免底面的凹凸影响琼脂层的厚度。
可将双碟放置在水平台上，下垫一层白纸，加入3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否深浅一致来判断双碟底面平整程度。
小钢管则应该选择加工精细的同一批产品，这样才能保证管壁厚薄与重量均匀一致，使得小钢管在培养基中下陷相同的深度，抗生素溶液扩散均匀有可比性。
如果小钢管两端不够平，就应予剔除，否则会使抗生素溶液漏出，破坏均匀扩散现象。
1.2 实验器材的清洗抗生素试验中，玻璃双碟、小钢管往往会连续使用。
由于清洗方面的原因，它们还是容易残留上次试验中的抗生素(庆大霉素、争光霉素、链霉素等)或者被清洗用的杀菌剂(如新洁而灭、洗洁精、去污粉等)污染，以至于在下次试验中造成抑菌圈不正常的现象。
因此，在清洗时要尤为注意多用流水冲洗。
160℃干热灭菌2h后备用。
配制试验所需的样品及药品2.1 样品与标准品溶液的配制标准品与样品从冰箱取出后，使与室温平衡。
管碟法抗生素微生物检定法讲座
得较清晰的抑菌圈。再如，泰乐菌素对藤黄微球菌杀灭作用较弱，形成的抑菌圈边缘清晰度 较差，对枯草芽孢杆菌杀灭作用较强，形成的抑菌圈边缘很清晰。
⑵解决办法有： ａ保持菌种新鲜，定期传代，及时更换，定时进行单菌落的分离、纯化。 ｂ增强抗生素的抗菌活性：可以从培养基的成分、pH 值和缓冲液的 PH 值和浓度来控制。 ｃ严格控制操作条件：如严格控制培养基、缓冲液的 pH 和培养温度的均匀性。
②小钢管底部二端面不平，此操作会导致形成卵圆或椭圆形抑菌圈。其原因是抗生素溶 液在琼脂培养基上扩散速度不一致。操作时使用加工相同的小钢管可防止此现象的发生。
③双碟、小钢管或其它器具被抗生素或其它杀菌剂污染。此操作会使抑菌圈破裂，有时 甚至使试验菌大部或全部被抑制，无法形成抑菌圈。因此，操作时一定要防止材料、器具、 环境被抗生素污染。
此为二剂量法效价计算公式，其中 S1、S2、T1、T2 分别为低浓度标准、高浓度标准、低
浓度样品、高浓度样品产生的抑菌圈半径。
实验证明：对数剂量与抑菌圈直径或面积在一定条件下呈直线关系，所以为工作方便在
实际工作中把半径的平方改为抑菌圈直径或面积，公式变为：
Logθ T2- S2+ T1- S1
─── ＝───────
Ⅱ
M1
9.21DT
1
Ⅰ+Ⅱ得： 2Logθ＝───〔(T22- S22)+( T12 - S12)〕
Ⅲ
9.21DT
(①+②)-(③+④)得：
(LogM 2+ LogM 2/)-( LogM 1 + LogM 1/)＝──── (S22+ T22- S12- T12)
管碟法测定抗生素效价详解
管碟法的操作步骤
预试验→试验准备→ 双碟底层的制备→
供试品、标准品溶液的制备→菌层的制备
→滴加抗生素溶液→双碟的培养→ 抑菌圈
的测量→结果的可靠性检验及效价测定
• 预试验：
确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、 使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑 菌圈的大小符合规定：高剂量浓度溶液所 致的抑菌圈直径在18～22mm。高剂量与 低剂量的抑菌圈直径之差最好不小于2mm。 高低剂量之比为2:1（如高、低剂量所致的 抑菌圈差别较小时，可用4:1的剂量比率）。
• 试验准备： 双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭 菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、 缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。
• 供试品、标准品溶液的制备： 估计供试品的效价，根据试验要求设计供 试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供 试品、标准品相关剂量的溶液。
1. 称量 称量前，将标准品从冰箱取出，使与温室平衡； 供试品应放于干燥器内至少30min方可称取。供试品与标准品 应用同一天平；吸湿性较强的抗生素，在称量前1～2 ｈ更换 天平内干燥剂。标准品与供试品的称量最好一次取样称取， 不得将已取出的标准品或供试品倒回原容器内，标准品称量 不可少于 20mg，取样后立即将称量瓶及被称物盖好，以免吸 水。样品的称样量最好不少于50mg。
一、试验前准备
• 双碟的挑选
内径约90mm，硬质玻璃或 塑料培养平皿，水平透明， 无色斑气泡
• 物品的清洗、灭菌
培养皿、钢管、刻度吸管清 洗后160℃干热灭菌2小时或 121℃高压蒸汽灭菌30min， 放置室温备用；陶瓷瓦盖要 定期清洗干燥。
牛津杯的挑选
内径（6.0±0.1）mm，高 （10.0±0.1）mm，外径 （7.8±0.1）菌的来源：检定菌种由中监所所提 供的冷冻干燥品。 检定菌的传代和接种： 芽胞杆菌3～6个月（其他细菌每个月） 用普通琼脂斜面传代1次，将新传代的培养物 代替原有的菌种，作为工作用（阳性对照）菌 种。传代和接种在菌种接种室内按无菌操作要 求进行。
管碟法测定抗生素效价详解
4．放置钢管 用钢管放置器，将干热灭菌的镊子或适宜方法将钢 管装于玻璃管中，放于钢管放置器上，将双碟打开，放入双碟台上， 托起双碟台，使钢管平稳落在培养基上，注意使各个钢管下落的高 度基本一致，钢管放妥后，双碟静置 5 ～10 min, 使钢管在琼脂内稍 下稳定后，再开始加抗生素溶液。 5．滴加抗生素溶液 每批供试品取6~10个双碟，滴加溶液可调式 移液器，在滴加之前须用滴加液洗2~3次。滴加溶液的顺 序:SH→TH→SL→TL。滴加溶液至钢管口平满，注意滴加溶液间隔不 可过长，因溶液的扩散时间不同影响测定结果。
一、试验前准备
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
• 双碟的挑选
内径约90mm，硬质玻璃或 塑料培养平皿，水平透明， 无色斑气泡
• 物品的清洗、灭菌
培养皿、钢管、刻度吸管清 洗后160℃干热灭菌2小时或 121℃高压蒸汽灭菌30min， 放置室温备用；陶瓷瓦盖要 定期清洗干燥。
牛津杯的挑选
内径（6.0±0.1）mm，高 （10.0±0.1）mm，外径 （7.8±0.1）mm，重量差异不超 过±0.01g，光洁平坦
• 磷酸盐缓冲液（pH6.0） 取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢 钾8g，加水使成1000ml，滤过。 • 磷酸盐缓冲液（pH7.0） 取磷酸氢二钠 （Na2HPO4*12H2O）9.39g与磷酸二氢钾3.5g，加水使
缓冲液的制备
成1000ml，滤过。
• 磷酸盐缓冲液（pH7.8） 取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二
3． 双碟的制备 在半无菌室内进行，应注意微生物及抗生素的 污染，培养基应在水浴中或微波炉中融化，避免直火加热。 底层：用灭菌大口吸管（20ml）或其他灭菌分装器，吸取已融化的 培养基20ml注入双碟内，等凝固后更换干燥的陶瓦盖，放于35～37℃ 培养箱中保温，使易于摊布菌层。 菌层 : 取出试验用菌悬液，按已试验妥的菌量 [ 按 (2.2) 法标准品溶 液的高浓度所致的抑菌圈直径在18～22mm；用灭菌吸管吸取菌悬液加 入已融化并保温在水中(一般细菌48～50℃，芽孢可至60℃)的培养基 内，摇匀作为菌层用。用灭菌大口10ml吸管或其他分装器，吸取菌层 培养基5ml，使均匀摊布在底层培养基上，置水平台上并用陶瓦圆盖 覆盖，放置20 ～ 30min，待凝固，备用。
抗生素效价计算过程
Set S1 Set S2 Set S4 Set S5 Sample U1USP Cyli nder-plate assay美国药典 管碟法---（标准曲线法）1、美国药典规定的管碟法抗生素效价方法简述：首先制备5个标准溶液浓度（U/ml ）,分别为S1、S2、S3 S4和S5,其中S3 为中间浓度。
除S3外的每个浓度准备3个碟子，每个碟子放置6个牛津杯，其中不 相连的三个分别加入Si （ i 为1、2、4或5），另外三个不相连的加入S3o 待检样 品（Unknown 加样方式如Si ，具体放置方法如下图1:图1：标准及样品管碟放置方式图例Replicate1Replicate2Replicate3Standard Standard Standard Standard Unknown2、在以上方法的基础上以具体数据进行计算举例:F表2为按以上方法进行抗生素效价检测的一组测量结果:表2:抗生素效价检测测量结果表备注：Zonel、3、5表示每个平皿中不相连的三个S3的直径值;Zone2、4、6表示每个平皿中不相连的三个Si的直径值;U1表示待测样品1。
进行初始计算：对于每种浓度的三个平板，分别求出得到的9个中间浓度标准品的平均值以及9 个Si 和U1 直径的平均值。
例如：=(,,,……)9个数据的平均值=(,,,……)9个数据的平均值变异性的适用性检查：然后求出每三个平板得到的9个数值的标准偏差(包括标准对照和样品的)，进而计算出其相对标准偏差值(RSD该值应不超过10%。
例如：标准偏差=s,...,相对标准偏差% = *100进行平板间的差异校正：计算公式如下。
X C = X S - （X R - P）X C =标准品平均值的校正值X S =原始的标准品的平均值X R =对照值的平均值P =校正值 例如：建立标准曲线：标准曲线由计算的标准品平均值的校正值 Xc 和标准品浓度值的对数值构成。
（使用适宜的计算软件或手动计算）（注意----可以使用自然对数或底数为10 的对数建立标准曲线中以确定回归方程，这样可以得到同样的结果） 例如：下表3是针对下列计算中会用到的数据从表2中截出的部分。