免疫组化技术
建议免疫组化什么意思
建议免疫组化什么意思建议免疫组化，是指对于生物体内所含有的某种物质或生命现象进行鉴定和定位的一种技术手段。
在免疫组化的过程中，利用特异性抗体与待检测物质进行结合，并通过染色或荧光标记的方式进行可视化观察，从而确定待检测物质的存在与定位。
免疫组化技术在医学领域有着重要的应用价值。
首先，免疫组化技术可以辅助病理学家对患者组织、细胞等进行详细的鉴定和分类。
通过检测特定蛋白在组织中的表达情况，可以帮助医生更准确地诊断疾病、确定治疗方案，提高治疗效果。
其次，免疫组化技术可以用于筛查潜在的肿瘤标志物和细胞表面受体，为肿瘤的早期诊断和治疗提供重要的依据。
此外，免疫组化技术还可以用于研究疾病的发生机制、新药的研发等方面，在科学研究上具有广泛的应用前景。
为了充分发挥免疫组化技术的作用，建议在以下几个方面进行优化和改进。
首先，免疫组化技术需要进一步提高检测的灵敏度和特异性。
目前的免疫组化技术在某些情况下可能出现假阳性或假阴性结果，对结果的准确性和可靠性提出了挑战。
因此，需要研发更加敏感和特异的抗体，并针对免疫组化过程中可能出现的干扰因素进行筛查和优化，提高技术的准确性和可靠性。
其次，建议加强对免疫组化技术的标准化和规范化。
由于目前免疫组化技术的操作步骤和分析方法存在较大的差异，不同实验室之间的结果可能存在较大的差异性。
因此，制定统一的实验操作规范和结果评估指标，加强对免疫组化技术的质量控制和质量评估，可以提高技术在不同实验室之间的可比性和可重复性。
此外，建议加强免疫组化技术与其他检测手段的联合应用。
虽然免疫组化技术在一定程度上可以提供定性的信息，但对于定量分析仍然存在一定的局限性。
因此，可以将免疫组化技术与其他定量分析技术（如质谱技术、核酸检测技术等）相结合，以提供更全面、准确的信息。
最后，建议加强免疫组化技术在临床实践中的推广和应用。
虽然免疫组化技术具有重要的应用价值，但在一些医疗机构中仍未得到广泛应用。
需要加强对医生和医学生的培训，提高其对免疫组化技术的认识和应用能力。
免疫组织化学技术的原理及方法
❖单克隆抗体：针对某一抗原决定簇， 由单株淋巴细胞（克隆）所产生的 抗体
多克隆抗体与单多克隆抗体及其产生
多克隆抗体的产生
❖ 以纯化的抗原免疫动物而获得，实际上是针对多个抗原决定 簇的多个抗体组成，检测范围广。在病理诊断 中，有利划归 肿瘤的基本类型。
酶标亲和素
在AB复合物中，酶是标记 在生物素上，而后与亲和素 合成复合物。在标记的亲和 素-生物素方法中是将辣根 过氧化酶直接标记在亲和素 上，辣根过氧化酶与亲和素 间有极强的结合力，因此 LSAB法比ABC法更敏感
多聚物载体
1、 核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分 子，起到载体的作用
2、 一步法多聚物载体试剂是多聚物结合特异性一抗 和辣根过氧化酶，二步法多聚物载体试剂是一种能 与二抗相联结的由HRP标记的多聚物
显示系统
辣根过氧化酶的免疫组化染色的反应过程: HRP + H2O2 →HRP·H2O2 →有色分子终末产
物+ HRP DAB（电子供体） HRP：酶 H2O2：底物 HRP·H2O2：酶·底物复合物
显示系统
免疫过氧化酶染色的多种方法中，其主要的不同点 在于显色系统的差异： ❖ 间接酶标法：利用标记于桥联抗体的酶 ❖ PAP法： 利用PAP复合物 ❖ ABC法： 利用AB复合物 ❖ LSAB法: 利用直接标记于亲和素的酶 ❖ EPOS一步法及EnVision二步法：多聚物载体
标记抗体
1、在抗体上用化学方法联接某种标记物，目的是使抗原抗体 的结合能用肉眼观察到
2、标记物种类：荧光素：异硫氰酸荧光素或罗丹明 酶：辣根过氧化酶，碱性磷酸酶 金属离子：胶体金颗粒
3、标记的方法：化学性结合将降低抗体效价及标记物的活性， 从而使染色敏感性降低
免疫组织化学染色技术
汇报结束
谢谢大家! 请各位批评指正
器官或组织特异性抗原标记物
前列腺标记物： PSA， PSAP，PSMA，P504s 甲状腺标记物：TG，CT，TTF-1 甲状旁腺：PTH 黑色素细胞标记物：MB45，S100，MelanA 肺腺癌的标记物：TTF-1，SP-A和B， Napsin A 肝细胞癌标记物：Hep-1 乳腺： Mammaglobio，GCDFP15 结肠： CDX2，B-catenin 宫颈癌：P16
免疫胶体金技术
1.标记物：特殊的 金属颗粒-胶体金
2.特性：特别适用 于电镜的单标记 或多标记。也适 用于光镜研究。
电子显微镜胶体金包埋后染色
四、免疫组化技术特点：（熟悉）
3.形态、代谢和功能三结合 4.定性、定位和定量三位一体 5特异性强
原始位置的反应：细胞层面—膜、核、浆 细胞器层面
根据标记的种类不同，显色效果不同： 荧光标记-荧光素显色 酶标记-酶底物显色 胶体金技术—光镜、电镜均显色
癌可能的起源
❖较常见的临床情况：
▪ 淋巴结或其它部位不明起源的转移癌 ▪ 卵巢腺癌，怀疑为胃肠道癌转移 ▪ 膀胱腺癌，怀疑为侵犯/转移的前列腺癌或结肠癌 ▪ 有结肠癌病史的患者肺部有一孤立性结节：结肠癌转
移还是新的肺原发性肿瘤？
卵巢腺癌：原发还是肠起源
CK7 CK20 CDX-2
卵巢起源
肠起源
+
两大特性：免疫原性、免疫反应性。
外源性抗原：微生物、花粉等
抗
内源性抗原：隐蔽的自身抗原、
原 处
肿瘤相关抗原等
处
同种异型抗原：人类白细胞抗原
免疫组化,免疫荧光
免疫组化,免疫荧光
免疫组化（Immunohistochemistry，简称IHC）和免疫荧光（Immunofluorescence，简称IF）是常用于研究细胞和组织中蛋白质分布和定位的实验技术。
免疫组化：免疫组化是通过使用特异性抗体来检测和定位组织切片中特定蛋白质的技术。
它包括将组织切片与特异性抗体结合，然后使用染色试剂使抗原-抗体复合物形成染色反应，从而可视化目标蛋白质的位置。
该技术常用于研究细胞分化、组织病理学和肿瘤学等领域。
免疫荧光：免疫荧光是利用荧光染料（荧光标记的二抗或直接标记的一抗）结合目标抗原的方法来检测和定位组织或细胞中的蛋白质。
通过特异性的抗体与目标蛋白质结合，然后使用荧光标记的二抗或直接标记的一抗与抗原-抗体复合物结合，使目标蛋白质在显微镜下产生荧光信号，以观察其位置。
免疫荧光技术广泛应用于细胞生物学研究、免疫学和医学诊断领域。
这两种技术在原理上非常类似，但在应用上有一些区别。
免疫组化主要用于固定的组织切片，可用于定量和定位分析。
而免疫荧光通常用于固定的细胞，可以提供更高分辨率的蛋白质定位信息，并可以进行多色荧光共标记以研究多个蛋白质的相互作用和定位。
无论是免疫组化还是免疫荧光，都依赖于合适的抗体选择和样本处理步骤来确保结果的准确性。
技术的选择应根据研究
的目的和样本的性质进行评估和决策。
免疫组化sabc法原理
免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种常用的组织学技术，用于检测组织切片中特定蛋白质的表达和定位。
SABC法（Streptavidin-Biotin Complex）是免疫组化中常用的一种放大方法，用于增强目标物抗原与抗体之间的相互作用信号。
SABC法的原理如下：
1. 标本处理：组织切片首先经过脱脂、脱水和抗原修复等预处理步骤，以恢复抗原的免疫表位和提高抗体的渗透性。
2. 抗体结合：将特异性一抗体（primary antibody）加入组织样本中，一抗体会与目标蛋白质的表位结合。
3. 生物素化二抗：加入经过生物素化的二抗体（biotinylated secondary antibody）。
这种二抗体能够识别并结合在一抗体上，产生一抗体-二抗体复合物。
4. 孵育期间的缓冲洗涤：经过一定周期的孵育，使一抗体-二抗体复合物与目标物结合，并去除未结合的二抗体。
5. 锚定生物素化二抗体：加入链霉亲和素（streptavidin）与复合物中的生物素化二抗体结合，形成一抗体-二抗体-链霉亲和素复合物。
6. 辐射性表记物：加入辐射性或发光性标记的链霉亲和素。
这些标记物能够与链霉亲和素结合。
7. 显色/可视化：使用辐射性或发光性探针，对标记的链霉亲和素进行可视化分析，通过显色或成像技术观察标记物的分布。
通过SABC法，可以增强目标蛋白质与抗体之间的相互作用信号，提高免疫组化的敏感性。
链霉亲和素和生物素的高度特异性结合是SABC法的关键步骤，这一复合体结合使得目标蛋白质能够更好地被可视化和检测。
免疫组化技术
Mart-1 抗原修复前
抗原修复后
抗原修复
加热法的注意事项 ：
✓达到规定的温度(92～95 C以上) ✓维持一定的时间； ✓避免切片干涸 (抗原可能完全丢失)； ✓加热后必须经过室温自然冷却20～30分钟，使 未折叠的蛋白分子链恢复天然构型； ✓修复液：最常用的是pH6.0的0.01mol抗原修复液的容器 中，加热至沸腾，持续10～15分钟。
优点：操作简单、经济，适用于所有的实验室， 缺点：对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。
抗原修复
微波照射法 ：将玻片放入装有抗原修复液的容器 中，置微波炉加热至95℃以上，持续l0～15分钟， 冷却后，按免疫组化染色步骤进行。
量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中
生物素——抗生物素染色法最常用（ABC法）。
常用的染色方法
➢ 免疫荧光法:最早建立的免疫组织化学技术。
• 基本原理：它利用抗原抗体特异性结合的原理， 先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞 或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗 原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发 出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的 定位，进而还可进行定量分析。
抗体
✓ 抗体的结构：
每个抗体都含有两个较小的 蛋白质 （轻链）和两个较大的 蛋白质（重链）。组成 抗体 的这四个蛋白质通过二硫键 （ S-S ）结合在一起。
➢ Fab（fragment antigen binding）： 该端是抗体与抗原特异性结合的部位
➢ Fc（fragment crystalline）：
常用固定剂
丙酮： 对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少 用于组 织标本。
组织学切片制作
冰冻切片和石蜡切片是免疫组化中最常用的制片 方法。
免疫组化结果判读标准
免疫组化结果判读标准
免疫组化技术用于检测和定量特定蛋白质在组织或细胞中的表达情况。
免疫组化结果的判读标准会因所检测的蛋白质和研究目的的不同而有所不同。
以下是一般免疫组化结果判读的一般原则：
1. 强阳性（Strong positive）：细胞或组织中存在大量的目标蛋白表达，通常显示为强烈的染色信号。
2. 中阳性（Moderate positive）：细胞或组织中存在适度的目标蛋白表达，染色信号强度介于强阳性和弱阳性之间。
3. 弱阳性（Weak positive）：细胞或组织中存在轻微的目标蛋白表达，染色信号强度较弱。
4. 阴性（Negative）：细胞或组织中不存在目标蛋白的表达，通常显示为无或非特异性染色。
需要注意的是，免疫组化结果的判读可能还需要结合组织或细胞的生理背景、对照组样本以及其他实验数据进行综合分析。
与实验室或领域专家进行讨论和解释结果也是非常
重要的。
此外，具体研究领域和目的可能会有特定的判读标准，因此建议参考相关的研究文献和指南以确定适用的判读标准。
免疫组化技术
组织石蜡切片制作 组织冰冻切片制作 细胞爬片制作 细胞涂片制作
免疫组化技术
切片的制作
组织的固定 组织石蜡包埋 切片
免疫组化技术
组织材料的固定
目的:
使细胞内蛋白质凝固，终止胞内酶活 化反应，防止细胞自溶，保持细胞固有形 态与结构，防止细胞脱落，去除干扰抗原 抗体反应的类脂，最主要的是保存组织细 胞的抗原性，在染色和反复清洗的过程中 使抗原不致释放。
切片粘合剂的使用：
多聚赖氨酸（分子量200KD）：0.05%浓度， 浸泡5分钟，60℃烤箱烘烤一小时或室温过夜 干燥备用。
免疫组化技术
切片：
石蜡切片：
(1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。 (2)60℃烤片3-8h。 (3)切片厚2～4μm。 (4)切片刀要快 (5)编上号 (6)切片可在4℃保存数年
免疫组化技术
影响固定的因素
1. 温度 一般固定液固定效果随温度升高而 加强，以室温22 ℃ 为常用。
2．浓度 10％中性甲醛，4％多聚甲醛固定液 3. 固定时间 要视组织块的厚薄，固定液的
种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大 小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓 度与固定时间成反比。 组织固定后，必须彻底冲洗以去除固定液
免疫组化技术
组织的脱水
脱水就是用某些溶剂将组织中的水分置换 出来的过程。
免疫组化定位
免疫组化定位
免疫组化定位是一种生物化学技术，用于检测和定位细胞或组织中特定蛋白质的存在和分布。
其原理是利用特定抗体与目标蛋白质结合，然后通过染色或荧光标记等手段进行可视化，从而确定目标蛋白质在组织中的位置。
免疫组化定位可以在细胞和组织级别上进行蛋白质定位分析。
一般的步骤包括固定细胞或组织样品、抗原修复、孔隙堵塞、抗体孵育、洗涤等，最后使用染色剂或荧光标记进行显色或荧光显微镜观察。
通过可视化的结果，可以确定目标蛋白质在细胞器、细胞膜、细胞核等位置的分布和表达情况。
免疫组化定位在生物医学研究中广泛应用，如研究细胞分化、细胞增殖、蛋白质相互作用等。
此外，免疫组化定位还可用于诊断疾病，如肿瘤细胞表面标记物的检测、病毒感染细胞的鉴定等。
通过免疫组化定位，可以在细胞和组织水平上观察和研究蛋白质的空间分布和功能定位，为生物医学研究和临床诊断提供重要信息。
免疫组化标准
免疫组化标准免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种常用的实验技术，用于检测组织样本中特定蛋白质的表达水平和定位情况。
它结合了免疫学和组织病理学的原理和技术，通过特异性抗体对目标蛋白质进行识别并标记，使其在组织切片中可视化。
在进行免疫组化实验时，需要使用一系列试剂和设备。
以下是常见的免疫组化标准及相关参考内容：1. 标本制备：- 收集组织样本并将其固定在适当的组织固定剂中，如10%中性缓冲福尔马林溶液，并在适当时间内进行固定。
- 将固定的组织样本加工成薄切片，通常为4-5微米厚。
- 将切片贴附在玻片上，通常使用聚-L-赖氨酸涂层的玻片。
2. 抗原恢复：- 如果抗原已被固定或掩盖，需要进行抗原恢复步骤，以增强蛋白质的可检测性。
- 常用的抗原恢复方法包括热诱导抗原恢复、酶诱导抗原恢复和化学诱导抗原恢复。
3. 抗体选择：- 选择合适的一抗体，具有高度特异性和亲和力。
- 需要对一抗体进行充分的优化实验，包括适当的浓度和反应时间。
4. 标记物选择：- 常用的标记物有酶标记、荧光标记和金标记等。
- 选择合适的标记物需要考虑可视化要求、信号持久性和试剂耐久性等因素。
5. 染色步骤：- 彩色染色法：通常使用二抗（与一抗特异结合）来增强免疫反应，并使用染色剂如二亚甲基蓝（DAB）或新洋红等来产生可视化信号。
- 荧光染色法：使用荧光标记的二抗，通过荧光显微镜观察标志物的定位。
6. 阳性和阴性对照：- 需要同时进行阳性和阴性对照实验，以验证免疫反应的特异性和可重复性。
- 阳性对照通常是已知表达目标蛋白的组织样本，而阴性对照则是将一抗体或二抗体替换为非特异的抗体。
7. 图像分析：- 使用合适的显微镜观察和记录免疫组化染色结果。
- 可使用计算机软件进行定量和定位分析。
8. 数据分析和结果呈现：- 对结果进行统计学和图像分析。
- 将结果以数据表格、图形和图片的形式呈现。
以上是免疫组化标准及相关参考内容，这些步骤和指南可用于免疫组化实验的设计和执行，以确保获得准确、可靠和重复性的结果。
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免疫组化技术
赵醒
承德医学院附属医院病理科 ０６７０００
病理学的理论和技术被视为一辆车的两个车轮，缺一不可，互相依存，互相促进，两者的结合
决定着病理学的发展。病理技术是病理学的一个重要分支，是病理学研究中的方法学，是病理诊断
的基础。有些时候，单凭形态学很难判断肿瘤的组织来源，尤其是低分化肿瘤，于是人们得到了一
些与肿瘤相关的抗原，存在于肿瘤细胞的胞核、胞浆和胞膜上，它的存在或量变可以提高肿瘤的性
质，借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，以有助于肿瘤的诊断、鉴别诊断、分类、判
断预后和指导临床治疗，所以免疫组化技术在病理学中得到了广泛应用。
：原抗体反应
抗体反应产
立控制在５８“Ｅ
旁使组织发脆
，长、抗体、浓
Ｅ的一条；
体易出现非
酶和生物素
ｉ或孵育时间过长
高或Ｈ２０２太多；
ｆ洗不干净。
‘以我们应该在做