蚓激酶研究和应用进展
中药《蚓激酶》提取、冷冻干燥设备工艺的探讨
中药《蚓激酶》提取、冷冻干燥设备工艺的探讨科技信息专题论述巾药《蚓激酶》提取,冻干燥设备工艺硇搽i刁济宁华能制药厂张庆奇张震杨福燕[摘要】济宁华能制药厂利用清华大学蚯蚓综合利用专利技术,首先在国内成功研制开发出国家级中药——-弼l激酶制剂芪龙胶囊,荣获了山东省科委授予的科学技术三等奖.该产品很快形成了生产能力并投入市场,给企业带来巨大的发展空间,产生了很大的社会效益.山东省科委组织的技术鉴定结论是:"蚓激酶与中药合理配伍,组方科学,安全无毒,副作用,疗效确切,属国内首创,填补了国内空白.该项目社会效益明显,经济效益可观,建议形成规模生产推广作用.[关键词]蚓激酶冷冻干燥一,蚯蚓有效组份提取设备的研制蚯蚓综合专利技术可以从蚯蚓中获取三种不同的药用组份.第一种是可以用来防治癌症的高分子组份,第二种是可以防治心脑血管疾病,降低血脂,溶解血栓的中分子组份,第三种是可以提高人体免疫功能的小分子组份.蚓激酶就是第二种中分子组份,它是一组可以溶解血栓的纤维蛋白酶.清华大学蚓激酶的提取工作全部是在实验室中完成的,与工业化生产的要求有相当大的距离和差别.实验室的工艺路线与设备根本不适用于现实的生产.它的工序之间与物料的传输过程都是手工操作,无法做到连续,封闭运行,更无法解决人流,物流,环境等外界因素带来的交叉污染,与GMP要求有很大的差距,我们经过半年多的努力,终于解决了这几个制约扩大再生产的瓶颈问题.1,蚯蚓全自动恒温反应釜的研制清华大学蚯蚓提取的工艺方案,先将蚯蚓置人配制好的溶液中,再分别放入医用恒温培养箱中进行反应.这种反应形式及方法有以下四点不足.①医用恒温培养箱有效容积太小,一次只能处理25升原料液,还需分装在几个容器中.按初步设计规模计算最少也需40—50台,无法大规模生产.操作过程全靠人力搬运,劳动强度大,易造成原料液浪费, 容易产生交叉污染.②多台恒温箱,众多原料液容器中的物料反应不均衡,很难保证产品长期稳定,优质的生产,不可控制的因素很难克服.③蚯蚓在恒温反应过程中需要定时搅拌,一个反应周期约2O个小时要搅拌1O次,每搅拌一次都会造成温度波动,几百个容器要短时间内是不可能完成的,人为因素造成产品质量很难掌控.④恒温培养箱的反应过程解决不了物料局部过热问题,温度超限会使产品活性降低,温度过低又造成反应不完全,成品率下降.针对上述不足,在不改变蚯蚓恒温反应各种条件下,自行设计一台全自动恒温反应釜,主要有以下优点:①一台反应釜可替代4O台恒温培养箱,电力消耗相比可节约75%,设备费只相当于培养箱的1/12.②反应釜配置了恒温和定时搅拌控制器.实现了定时自动搅拌,物料温度均衡,生物活性和成品率大幅度提高.③物料传输,工步,工序的衔接实现了全封闭,全自动操作,降低了人为和不可抗拒因素对产品质量的影响.设备构造,材质,设备操作完全符合GMP要求.2,初级分离设备的更新优选清华大学蚯蚓提取工艺方案中初级分离设备采用的是三足式离心机.经实践证明存在以下三个缺点.①三足式离心机给料,出料全部由手工操作,物料流量不易控制,且劳动强度大,操作不安全,还易发生设备,人,环境,物料的交叉污染.②分离因数低,分离液浑浊,加重了后一级精过滤设备的负荷和损耗.③间歇操作,中间要多次停机更换滤布,操作麻烦,生产能力太小.设备,滤布清洗困难,原料液损失大.经过多次反复试验,尝试了板框过滤,蝶式离心机过滤,砂滤等方法,最终选定上海离心机械研究所生产的卧式螺旋沉降离心机,它有如下三大优点.①离心机进料,出料全部管路机械动力输送,流量稳定,可调控,劳动强度低,符合GMP要求.②转子转速高,分离因数高,原料液经离心后清澈,品质好.设备自动排渣清洗.③设备全封闭运行,无原料液损失和交叉污染.设备可连续工作,生产能力大.通过实践证明,上述设备运行良好,操作简单,安全可靠,得到业内人士包括清华专家的好评.二,蚓激酶冷冻干燥工艺的研讨冷冻干燥不同于其它传统的对流干燥,辐射干燥,传导干燥等方式.冷冻干燥是将被干燥的液态物料冷冻到其共晶点温度以下,使物料中的水分冻结为固态的冰,然后再慢慢地将其在高真空度环境下加热, 使冰不经过液态直接升华为水蒸汽排出,最后得到的固态物质即为冷冻干燥产品.我们选用的是上海长江制冷设备厂生产的LGJ—lO大型医用冷冻干燥机.经过运行,总结出整个冷冻干燥可分解为三个过程.1,原料液预冻结这个过程是冷冻干燥的第一步,只有使原料液中的水分完全冻结成冰晶后,才可以进行下一个环节的操作.最重要的一点要使冷冻干燥机的预冻温度低于原料液的共晶温度.因此在冷冻干燥前必须准确地确定原料液的共晶温度,这是冷冻干燥工艺过程中一个非常重要的工艺参数和操作依据.测定共晶点温度的方法很多,如电阻检测法,差热分析仪扫描法,低温显微镜直接观察法,数学公式理论推算法等.经过比较,我们采用电阻检测法.我们都知道100~(2的水蒸汽要比100%的水热的多,因为它载有一部分汽化潜热.同理可知,共晶点温度的水要结成共晶点温度自:J冰也需要补充大量的冷量.开始我们发现,虽然冷冻干燥机的预冻温度已经低于原料液共晶点温度,但并没有使其全部冻结.原料液在冷冻干燥箱内所处的位置不同,导致系数各异,受冷受热极不均匀.实际操作中经过认真观察,谨慎调控,摸索出了克服物料过冷现象最合理,最佳的预冻温度.这是冷冻干燥工艺中又一个非常重要的参数和依据.最确定产品的预冻温度要低于其共晶点温度lO℃左右,而且在这个温度范围内必须恒温保持2—3小时,才能确保物料全部冻结.2,原料液的升华干燥第一个工艺过程完全冻结的原料液,在高真空度环境下受热,使其固体冰晶直接变成水蒸气,最终脱水干燥的过程称为升华干燥.选择加热量和加热速度也是冷冻干燥工艺过程中一个非常重要的步骤和环节.经过长期实践的总结,我们采用递进,分段加热的方法,随时调节保持物料温度与环境高真空度的平衡一致,优化了升华干燥过程.物料的升华是从物料表面的冰晶开始的,逐渐向内部渗透移动.冰晶升华后留下的空隙成为内层升华水蒸汽的逸出通道.根据长期观察, 蚓激酶的升华干燥以约0.5毫米,小时的平均速度从外向内推进,越向里越慢,到最后阶段因为水蒸汽穿透空隙的阻力过大也会造成干燥制品起泡,萎缩,融化的现象.所以料液装填的厚度也是冷冻干燥工艺能否成功的重要因素.升华干燥过程约有90%的水分从物料中排除,最后确定料液厚度不超过10mm为最佳.3,原料液的解吸干燥在升华干燥结束时,冰晶已不存在,大量水分已被排除.解吸干燥过程要排除的是结合水,也称分子水.这种水深藏于物质的细胞之内,其能量相当高,因为它与细胞壁结合的非常紧密,必须提供足够的能量才能把它清除出来.所以这个阶段的加热温度,在不破坏制品的物理和化学性质的前提下越高越好.同时也施加极限真空度,最大限度的用比较短的时间完成全部冷冻干燥过程.这个过程结束后蚓激酶制品最终的水分含量应控制在4%,其有效组份是一组热敏性很高的纤溶酶,温度因素会使其生物活性丧失殆尽.因此,此阶段最高温度,在生产全过程必须严格控制,决不允许超过,这个极限温度是冷冻干燥过程中必须严守的一个关口.三,结束语冷冻干燥机是我厂的关键设备,耗电量大,运行费用高.国内目前完成一批同类型冻干制品要连续运行三十多个小时,这也是清华大学专家们经过无数次试验给定的标准运行时间.经过实践中不断的摸索, 研讨,在这个课题上大胆地对制品的预冷,共晶共溶温度,加热温度,升温速度,三过程分解,残余水分含量,过冷温度等逐项进行反复的试验和分析研究,筛选优化,总结制定了我们自己独有的冷冻干燥工艺曲线.按这个工艺方法现在每个生产周期只需22个小时左右,威品收率比清华大学专利技术确定的标准提高一倍还多,产品质量完全符合规定要求.也就是说耗电量只为原来的61%,增加的生产批次可使年计划产量提高50%.多年来生产一线的工作实践使我们深深地认识到"科学技术是第一生产力"的论述千真万确.它激励我们更自觉地把个人的命运与企业和国家的发展结合起来,是企业和国家给我们提供了展示自己的平台. 要立足本职,刻苦钻研不断地提高自己的学习能力,创新能力,竞争能力和创业能力,争做知识型,技能型,创新型的企业员工.参考文献f1]孙企达编着.冷冻干燥超细粉体技术及应用.化学工业出版社, 2006年2月第一版第一次[2]马旭升主编.制冷,净化,干燥设备原理.结构.维修.上海交通大学出版社,1991年7月第一版一次'[3]徐连英,候世祥主编-制药工艺技术解析.人民卫生出版社,2003年2月第一版第一次[4]李钧主编.药品GMP实施与认证.中国医药科技出版;土,2000年1月第一版第一次[5][美]雷克斯?米勒制冷与空调技术.上海交通大学出版杜,1990 年1月第一版.1993年7月第四次.---——347.--——。
探讨中西医结合治疗偏头痛的临床疗效
数据以（ ±ｓ表示 ， 用 Ｓ Ｓ ３０软件 ） 采 Ｐ Ｓ１．
（ Ｒ 。同时这些 患者在服用 阿司匹林期 间血小板聚集率 Ａ ）” 仍然很高 。 临床试验 Ｍ ｔ分析显 示 ， 司匹林使 每 年预测 冠心 病 ｅ ａ 阿 事件 ＜ ％的 患者 发生 心肌 梗死 和 冠心 病死 亡 的风 险降低 １ ２％， ６ 使每年预测冠心病事件为 １ 一 ％的患者发生心肌梗 ％ ３ 死 和冠 心病死 亡的风 险降低 ２ ％ ， ０ 使每年预测冠心病事件 ＞ ３ ％的患者发生心肌梗死和 冠心病死 亡 的风 险降低 ３％ 。 ５ 然而患者存 在明显的个体差异 ， 部分患者服用 标准剂量 的阿 司匹林并不 能使血小板 聚集下 降， 即发生 Ａ 使得 接受 阿司 Ｒ， 匹林治疗 的患者得不到应有 的保护 ， 仍会发 生血栓事件 。蚓 激 酶是 １８ ９３年美原恒首次发现 Ｌ ｍ ｒ ｉａ ｕ ｂｉ ｄ ｅ科蚯蚓水 提物 ， ｃ 有直接溶解纤维蛋 白及纤溶酶原激活物 作用 ， 心脑血管疾 在 病及外周血管血栓性疾病治疗 中起到抗凝血溶血栓 的作用 。 本结果表 明蚓激 酶能抑 制血 小板 功 能， 改善 Ａ Ｒ现 象。 两者联合应用 的远期疗 效 尚待大样 本 临床试验 的长期 随访
・
１０ ・ ７
中国现代药物应用 ２ １ ０ ０年 １ ， ０． Ｎ ． ｈｎＪＭｏ ｒｇＡ ｐ，ｅ ０ ０ Ｖ １ ４， ｏ３
蚓 激 酶 干 预 冠 心 病 患 者 阿 司 匹林 抵 抗 ２ Ｏ例 临 床 观 察
吴效 芳 【 摘要】 目的 观察蚓激酶对冠心病患者血小板聚集的影响， 探讨其对 Ａ Ｒ的干预作用； 方法 ２ ０ 例患者均停服阿司匹林 ２ 。随机分为阿司匹林联合蚓激酶组 １ ； 酶组 １ 例 ， 药 １ 周 ０例 蚓激 Ｏ 服 个月检验 血小板聚集率 ； 结果 两组 Ａ Ｐ Ａ Ｄ 及 Ａ诱导的血小板 聚集率干预前后 比较均有显著差异 （ ００ ）但 Ｐ＜ ．５ ， 蚓激酶组与阿司匹林联合蚓激酶组干预后血小板聚集率 比较有显著差异 （ ０ ０ ） 结论 蚓激酶能抑 Ｐ＜ ． １ ； 制血小板功能， 改善 临床 阿司匹林抵抗（ Ｒ 现象。 Ａ） 【 关键词】 阿司匹林抵抗 ； 蚓激酶 ； 血小板聚集率
酶学研究的新进展
酶学研究的新进展酶是生命体中的重要组分，可以催化生物反应，因此在许多生物和重要的产业中具有广泛的应用。
近年来，随着分子生物学、结构生物学、生物化学等科学的不断发展，酶的研究也取得了许多新进展。
基于基因组学的酶研究随着基因组学研究的深入，越来越多的序列信息被发现。
这些序列信息的发现为酶学研究提供了更全面的基础。
通过基因组学的方法，我们可以预测和发现数千种新酶，这些酶在生物工程和制药业中具有很大的应用前景。
同时，基于基因组学的方法还可以大规模筛选酶，以选择最适合特定反应、反应条件和底物的酶。
分子动力学的酶研究随着计算机科学和生物技术的不断进步，分子动力学已成为研究酶活性和酶机制的常用方法之一。
利用分子动力学模拟可以获得酶分子结构在时间和空间上的变化情况，从而了解酶的结构和酶活性。
此方法可以帮助酶学家设计新的酶，同时也可以揭示酶结构和机理的奥秘。
高通量分析的酶研究传统的酶研究方法比较繁琐、费时且样品需求量较大，而高通量分析技术可以同时处理多种样品，快速地筛选新的酶和优化酶反应条件。
高通量分析策略中包括光化学和蛋白质芯片技术等。
结合高通量分析技术，酶学家可以更好地理解和控制反应过程，以此提高生产效率和酶的价值。
蛋白质结构研究与酶机制研究酶是由蛋白质组成的，因此研究蛋白质的结构有助于了解酶的机制。
利用蛋白质结晶技术和冷冻电镜技术等方法，已经解析了大量酶的高分辨率结构，这些结构为研究酶的功能和机制提供了重要的信息。
结合蛋白质结构和酶机制研究，科学家可以深入了解酶的功能和机理，开发新的酶及其应用。
总的来说，随着不同科学技术的发展，酶学研究也在不断取得新的进展。
同时，酶作为生命体中的关键组分，在生物工程、制药、食品加工和环境保护等多个领域中具有广泛的应用前景。
相信在不久的将来，酶学研究将会为我们带来更多的惊喜。
溶菌酶的研究现状及应用进展综述
溶菌酶的研究现状及应用进展综述
溶菌酶是一种具有溶菌作用的酶类，能够分解细菌细胞壁，从而导致细菌溶解和死亡。
由于其独特的作用机制和广泛的应用前景，溶菌酶的研究受到了广泛关注。
本文将对溶菌酶的研究现状及应用进展进行综述。
其次，溶菌酶的应用进展主要涉及医药、食品、环境等领域。
在医药领域，溶菌酶具有潜在的抗菌活性，可作为替代抗生素的候选物。
研究人员已经通过体外实验和动物实验，证明了溶菌酶对多种细菌感染的治疗效果。
此外，将溶菌酶与其他抗菌药物联合应用，能够提高抗菌效果，显示出协同作用。
在食品领域，由于溶菌酶对致病菌的特异性作用，可作为一种天然的食品防腐剂。
在环境领域，溶菌酶可以用于废水处理，去除细菌和其他微生物，减少对环境和人体的危害。
此外，溶菌酶还在生物技术领域具有潜在应用价值。
溶菌酶可以用于细胞壁的降解，从而释放出目标物质，如蛋白质、核酸等，用于后续的分析和鉴定。
此外，溶菌酶还可以应用于基因工程和基因治疗中，用于特定基因的表达和传递，具有广阔的发展前景。
正交试验法优选蚓激酶提取工艺研究
中国民族民间医药 ２ ０ １ ７年 １ １月 第 ２ ６卷第 ２ ２期 Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｅ ｔ ｈ ｎ ｏ ｍ ｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ ａ ｎ ｄ Ｅ ｔ ｈ ｎ ｏ ｐ ｈ ａ ｒ ｍ ａ ｃ ｙ ， ２ ０ １ ７ ， Ｖ ｏ １ ． ２ ６ ， Ｎ ｏ ． ２ ２
2021年蚓激酶治疗急性血栓性痔疮疗效观察
打开文本图片集摘要目的观察蚓激酶治疗急性血栓性痔疮的临床疗效，并探讨降纤治疗在痔疮治疗中的临床意义。
方法将96例病例随机分为蚓激酶组36例和地奥思明组32例和非药物组28例，10 d后观察三组患者疼痛缓解程度，缓解天数以及痔核消退时间和程度，纤维蛋白原等情况。
结果蚓激酶组、地奥思明组总有效率均为在90%以上，临床症状的缓解程度也远远高于非药物组（P<0.05）；降纤作用方面，蚓激酶组要高于于地奥思明组及非药物组（P<0.05）。
结论蚓激酶可以作为急性期痔疮发作的非手术用药，降纤治疗可以明显缩小痔疮体积，缓解临床症状，并具有较少的副作用。
关键词痔疮；蚓激酶AbstractObjective To observe the vermis kinase clinical curative effect for the treatment of acute hemorrhoids with thrombosis， and discuss the significance of reduce the fibrinogen treatment for hemorrhoids. Methods A total of 96 cases of acute hemorrhoidspatients were Randomly divided into three groups.Patients in onegroup were treated by vermis kinase， control group were treated by Diosmin Tablets，and blank control group were treated just by wash worm pare the clinical efficacy，the degree of pain， Size fading degree of hemorrhoids， and fibrinogen. Results Vermis kinase group， Diosmin group， the total effective rate was in more than 90%，the clinical symptoms relief degree is higher than that of the non drug group （P < 0.05）； fibrinolytic effect， Vermis kinase groupto higher than in Diosmin group and non drug group （P < 0.05）. Conclusion Vermis kinase can be a non-surgical medicine for acute hemorrhoids. Fiber reduction can significantly shrink thehemorrhoids volume， and relieve clinical symptoms，the side effects are less .Key wordsVermis kinase； Acute hemorrhoids痔疾病诊治指南[1]中认为急性嵌顿痔和急性血栓性外痔是痔的急症。
抗凝血蛋白药物的研究进展
文章编号:100021735(2003)022*******抗凝血蛋白药物的研究进展李旭霞, 李庆伟(辽宁师范大学生命科学学院,辽宁大连 116029)摘 要:除了血液中的抗凝因子外,自然界中还存在大量具有抗凝活性的生物大分子,如水蛭素、蚯蚓纤溶酶等.基础研究证实这些抗凝剂的作用一般是通过三方面得以实现:一是抑制凝血酶及凝血酶活化因子活性;二是水解血纤维蛋白或纤溶酶原;三是抑制血小板凝聚.由于这些活性物质具有高效的抗凝、溶栓作用,它们极有可能发展成治疗血栓性疾病的药物.关键词:抗凝剂;凝血酶;血纤维蛋白;纤溶酶中图分类号:R973.2 文献标识码:A抗凝因子和纤维蛋白溶解系统可以通过抑制凝血因子活性或者水解纤维蛋白来控制凝血平衡,维持血液粘度并且防止因凝血过度对机体造成危害.这两个系统功能障碍可以导致中风、心肌梗死以及外周动脉阻塞性等严重危害人体健康的疾病.尽管有肝素、口服香豆素、链激酶和尿激酶等药物多年应用的历史,但是这些药物自身存在的毒副作用一直是临床治疗中无法解决的问题.随着医药基础研究的不断推进,人们对参与凝血过程的多种酶、活性因子以及相关受体的认识逐渐深入.近年来,开发研制疗效更好、毒副作用更低的抗凝血、溶栓和抗血小板药物的研究工作备受科研人员的关注.迄今为止,除了血液中存在抗凝因子外,人们已经从多种生物组织、体液中提取到各种各样的抗凝血蛋白和溶栓酶,如水蛭素、蚯蚓纤溶酶、蛇毒抗凝血纤溶酶等,其中部分已经开发成抗凝和溶栓类药物.虽然自然界中抗凝物质药效良好并且毒副作用小,但是由于原料缺乏,大量开发势必影响环境资源的保护,因此利用现代先进生物技术获得具有高效抗凝及溶栓作用、价格低廉的生物大分子成药已经成为目前该领域研究热点.笔者概括说明了凝血、抗凝和纤溶系统相互间的关系,着重阐述了抗凝因子的类型、分子结构和作用机理,并且展望了今后抗凝、溶栓药物研究开发的前景.1 凝血、抗凝与纤维蛋白溶解1.1 凝血因子和凝血途径凝血因子是直接参与凝血的物质,迄今为止发现的凝血因子共有14种,包括纤维蛋白原(因子Ⅰ)、凝血酶原(因子Ⅱ)、组织凝血激素(因子Ⅲ)、Ca 2+(因子Ⅳ)、前加速素(因子Ⅴ)、前转变素(因子Ⅶ)、抗血友病因子(因子Ⅷ)、血浆凝血激酶(因子Ⅸ)、S tuart 2Prower 因子(因子Ⅹ)、血浆凝血激酶前质(因子Ⅺ)、接触因子(因子Ⅻ)、纤维蛋白稳定因子(因子Ⅷ)、前激肽释放酶和高分子量激肽原.这些因子中除Ca 2+外,其余均为蛋白质.因子Ⅱ,Ⅶ,Ⅸ,Ⅹ,Ⅺ,Ⅻ和前激肽释放酶都是内切蛋白酶,在血液中以酶原形式存在,当外界刺激因素产生时,这些无活性的酶原被激活,从而引起凝血.血液凝固的过程基本上是一系列蛋白质有限水解的过程,它分为三个阶段:因子Ⅹ激活成Ⅹa ;因子Ⅱ(凝血酶原)激活成Ⅱa (凝血酶);因子Ⅰ(纤维蛋白原)转变成为Ⅰa (纤维蛋白).因子Ⅹ激活可以通过两种激活途径共同完成:内源性和外源性激活途径.完全依靠血浆内的凝血因子逐步使因子Ⅹ激活从而发生凝血的途径,称为内源性激活途径;而依靠血管外组织释放因子Ⅲ来参与因子Ⅹ激活的途径,称为外源性激活途径.一般来说,通过外源性途径凝血比通过内源性途径凝血速度更快[1].1.2 抗凝系统的作用凝血过程是一个级联放大的瀑布效应,加之本身的正反馈作用,可以把最初生成的酶活性增强至百倍.如此高的激活速度会对机体构成危险,就是说,此过程一旦启动,全身血液就会凝固.此外,慢性异常血凝也会导致心肌梗死、脑血栓等严重疾病.因此,机体内的凝血作用必须保持适度.事实上,血浆及血管内皮和其他组织中存在着许多抗凝物质,它们通过抑制或灭活凝血因子的活性达到抵御血液凝固的目的.血浆中最重要的抗凝血物质是抗凝血酶Ⅲ和肝素,它们的作收稿日期:2003201208基金项目:辽宁省科技攻关项目(002057)作者简介:李旭霞(19692),女,辽宁大连人,大连大学医学院讲师,辽宁师范大学在读硕士研究生.李庆伟(19552),男,辽宁大连人,辽宁师范大学教授,博士,博士生导师.第26卷第2期2003年6月 辽宁师范大学学报(自然科学版)Journal of Liaoning N ormal University (Natural Science Edition ) V ol.26 N o.2June 2003用约占血浆全部抗凝血酶活性的75%.抗凝血酶Ⅲ是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂,而凝血因子Ⅱa 、Ⅶ、Ⅹa 、Ⅸa 、Ⅻa 的活性中心均含有丝氨酸残基,都属于丝氨酸蛋白酶.抗凝血酶Ⅲ分子上的精氨酸残基,可以与这些酶活性中心的丝氨酸残基结合,“封闭”了这些酶的活性中心而使之失活.此外,血浆中还有其他抗凝血蛋白,如蛋白质C 是通过灭活凝血因子Ⅴ和Ⅷ、限制因子Ⅹa 与血小板结合等机制起到抗凝血作用;蛋白S 是通过激活蛋白质C 进行抗凝[2].1.3 纤维蛋白的溶解血液中除了有抗凝系统之外还存在纤溶系统.所谓纤溶系统,是指能将血液凝固产生的纤维蛋白重新溶解的系统,由纤溶酶原、纤溶酶和纤溶酶原激活剂组成.纤溶系统对于防止血栓形成和保持血流通畅具有重要意义.纤维蛋白溶解过程分为两个阶段,即纤维蛋白酶原激活和纤维蛋白溶解.纤溶酶原激活剂主要有血管激活物、组织激活物和激肽释放酶三类,它们的作用是水解纤溶酶原,使之成为纤溶酶.纤溶酶则是血浆中最活跃的蛋白酶,它具有水解多种蛋白质,如凝血酶、因子Ⅴ、纤维蛋白原和纤维蛋白等,但其主要作用是水解纤维蛋白原和纤维蛋白,防止血管内出现血栓[3](见附图).附图 血液凝固、抗凝与纤溶注:11实线为凝血途径;21虚线为抗凝血、纤溶途径2 抗凝剂的种类、分子结构和作用方式除了血浆中的抗凝血物质以外,自然界中还存在大量抗凝、溶栓效应的活性物质.尽管这些抗凝剂的来源、分子性质和结构差别很大,但它们的抗凝血作用方式是一致的,这些方式表现为三个方面,即抑制凝血因子活性、溶解纤维蛋白以及阻碍血小板的凝聚.2.1 凝血酶及其相关凝血因子抑制剂在凝血反应过程中凝血酶不仅将纤维蛋白原转化成纤维蛋白凝块,而且调节了血液凝固因子的活性,刺激血小板反应.凝血酶直接影响了血管内皮细胞的止血功能,并调节了血细胞的非止血功能.因而,凝血酶抑制剂是调节血液凝固以及调节各种复杂的凝血酶功能的有效工具[4,5].以凝血酶以及激活凝血酶原的凝血因子为底物的抑制剂,作用方式与抗凝血酶Ⅲ类似,都是通过封闭凝血因子活性位点从而抑制该因子的活性.目前已发现的抑制凝血因子活性的抗凝蛋白有水蛭素、壁虱抗凝肽.2.1.1 水蛭素(hirudin ,H V ) 水蛭素是从吸血动物水蛭的唾液腺分泌液中获取的一种具有抗凝血作用的蛋白质,是目前发现的、最有效的凝血酶抑制剂.天然水蛭素是由65或66个氨基酸组成的单链多肽,其N 末端富含半胱氨酸,半胱氨酸之间相互作用形成3个二硫键,使N 2端结合紧密;C 2末端含有多个酸性氨基酸.水蛭素的N 末端能封阻凝血酶与纤维蛋白原专一性作用的阴离子结合位点R ,而C 末端有6个酸性氨基酸,它们可以与带正电的凝血酶识别位点形成许多离子键.N 末端和C 末端两个功能区域以协同的方式结合到凝血酶上,在凝血酶的活性部位形成一个帽子,阻止凝血酶与底物的结合[6].从发现水蛭素至今,共有3种异构体被纯化并命名:H V 21,H V 22,H V 23.其中从口部提取的H V 22具有高效活性,而从头部提取的H V 21活性是H V 22的22%,从身体其他部位提取的H V 23几乎没有抗凝活性.由于水蛭素的稳定性高,在极端的pH 和热条件下均能保持活性,加之抗凝作用强烈,因此水蛭素在临床医学上有着广泛的应用前景[7,8].近期研究证实,水蛭唾液腺分泌蛋白中还有一些在结构上或者功能上与水蛭素有很大差别的抗凝蛋白,例如Therostasin ,这是一种从Theromyzon tessulatum 中新发现的与H V 结构不同但作用相似的凝血酶抑制剂[9].赵荣乐等人从盐源山蛭和蚌蛙蛭的头部也分离出了抗凝血蛋白,但其抗凝血机制和分子结构还有待进一步的生物化学和分子生物学研究加以证实[10,11].2.1.2 壁虱抗凝肽(tick anticoagulant peptide ,T AP ) 壁虱抗凝肽是从非洲钝缘蜱属壁虱中分离的强效X a 因子抑制剂,其分子大小、结构类似于高效的凝血酶抑制剂水蛭素.它是一个由60个氨基酸组成的单链酸性肽,含有6个半胱氨酸残基,但是在T AP 的N 末端拥有与X a 因子相互作用的关键基团:Asn 2Arg 2leu.T AP 是一种慢速但结合紧密的、有高效选择性的X a 因子抑制剂,它通过与X a 因子的结合来阻止凝血激酶复合物的形成,从而抑制了凝血酶原的激活.对X a 因子潜在188 辽宁师范大学学报(自然科学版)第26卷的和特异性的抑制作用表明T AP 能有效地治疗和预防血管闭塞疾病,可能成为预防血栓形成的有效药物[12,13].2.2 以纤溶酶或纤维蛋白作为底物的抗凝剂天然抗凝血蛋白中种类最多的是以纤溶酶原和血纤维蛋白作为底物的抗凝剂.这类抗凝剂以蛋白酶为主,其分布广泛,从细菌到哺乳动物中都有发现.2.2.1 蚓激酶 蚓激酶即蚯蚓纤溶酶,是一组从蚯蚓体内分离出的具有抗凝血作用的蛋白酶.自80年代初日本M ihara H 等首次发现粉正蚓水提物中有直接溶解纤维蛋白以及激活纤溶酶原的活性物质以来,至今已经从不同种类蚯蚓体内提纯出多种具有抗凝活性的蛋白组分[14].研究发现蚓激酶是一类复杂的蛋白酶,其复杂性表现在组分多样性、结构多样性、酶学特性多样性几方面.同一种蚯蚓体内能分离出至少两种以上具有抗凝活性但是分子量和生化特征不相同的蛋白酶.例如在粉正蚓、赤子胜爱蚓体内均分离出多种纤溶酶组分[15～17].这些蛋白酶不仅分子结构、分子量上不同,而且对底物作用方式和作用位点也有很大差别.粉正蚓的纤溶酶中有的可以水解碱性氨基酸,有的可以水解酸性氨基酸;赤子胜爱蚓纯化的组分中有的可以直接水解纤维蛋白,也有的以纤溶酶原作为水解底物.尽管如此,复杂的蚓激酶仍然具有一些可寻的共性,这些共性表现在以下三个方面:11对凝血过程的影响上,所有的蚓激酶都表现为仅对血液凝固后期阶段起作用,而对凝血因子Ⅴ,Ⅶ,Ⅷ,Ⅸ,Ⅻ无显著的影响;21分子结构上,蚓激酶在分子量、氨基酸组成上有很大的差别,但是它们的N 2末端氨基酸序列显示出蚓激酶与胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶具有一定的相似性,加之其水解底物方式也与这两种酶相似,提示蚓激酶可能属于丝氨酸蛋白酶类[18,19].31稳定性,蚓激酶在pH4～10的范围内都很稳定,同时也是一类热稳定性非常好的蛋白水解酶,50℃以下可以长久保持活性[20].通过对蚓激酶药理学研究证实蚓激酶是一类具有强烈溶栓、抑制血栓形成的蛋白酶,其毒副作用很小,是一种极具开发价值的溶栓药物.2.2.2 蛇毒纤溶酶 蛇毒是含有多种生物活性蛋白质的混合物,其中包含有能够直接溶解纤维蛋白或纤维蛋白酶原的蛋白酶,对于这类酶的研究不仅有助于阐明蛇伤中毒患者的血液变化病理机制,而且也为其应用开发提供理论基础.蛇毒纤溶酶的分布非常广泛,迄今为止在所有的响尾蛇蛇毒中都分离出了具有纤溶作用的组分.此外在蝰蛇科、眼镜蛇科以及游蛇科的多种蛇毒中纯化出纤溶酶[21～23].尽管这些纤溶酶的分子量、等电点及酶学特性各不相同,但是它们对纤维蛋白原和纤维蛋白都有溶解活性.按照蛋白酶对底物作用特异性可以将蛇毒纤溶酶分为两大类:一类为单链锌金属蛋白酶,另一类为丝氨酸蛋白酶.蛇毒纤溶酶主要作用于纤维蛋白酶或纤维蛋白的α2链和β2链,能够专一或优先裂解α2链者称为α2纤维蛋白原酶,均为锌金属原酶,主要存在于蝮亚科的蝮属、响尾蛇属、烙铁头属和矛头蝮属蛇毒中;能专一或优先裂解β-链者称为β-纤维蛋白酶,多为丝氨酸蛋白酶.除了某些带有出血活性的蛇毒纤溶酶具有较为广泛作用底物之外,大部分蛇毒纤溶酶的底物特异性比血纤溶酶更为专一.而且蛇毒纤溶酶比血纤溶酶拥有更高的热稳定性,如从Viperu lebetina 蛇毒中纯化出的纤溶酶,在pH4～11的范围内95℃加热20min ,其活性完全不受影响.这些特性均显示出蛇毒纤溶酶作为一种强溶栓剂的潜在价值[24].此外在蛇毒中还分离出另外一类具有活化作用的抗凝血蛋白,它们可以通过激活纤溶酶原或蛋白质C 来抵御血液凝固.这类蛋白质属于丝氨酸蛋白酶家族,与其他蛇毒丝氨酸蛋白酶有很大序列相似性.蛇毒丝氨酸蛋白酶序列相似性说明这些蛇毒丝氨酸蛋白酶可能来源于共同祖先,最后分化成的一个多基因家族[25,26].2.2.3 纳豆激酶(natto kinase ,NK ) 纳豆激酶是从枯草杆菌属中的纳豆杆菌中提纯出的一种具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶,这种酶的分子量为27.3K D ,是由274个氨基酸组成的一条多肽链.蛋白质的活性中心的催化部位是由Asp32,His64和Ser221组成,底物结合部位由Ser125,Leu126和G ly127组成.纳豆激酶溶栓活性表现在两方面,一是直接溶解纤维蛋白,其二是促进血管内皮细胞产生t 2PA 激活纤溶酶原间接溶解纤维蛋白.由细菌产生的类似纤溶酶还有芽孢杆菌分泌的纤溶酶、粪链球菌中提纯出的一种中性金属内肽酶.这些酶能够直接裂解纤维蛋白,对它们的研究有助于开发微生物来源的新型溶栓药物[27].2.3 抑制血小板凝聚的抗凝剂血小板对于血液凝固有重要的促进作用,其功能表现在以下两个方面,一是在创伤发生后迅速粘附于创伤处并聚集成团形成松软的止血栓子,血小板的粘附主要由血小板膜糖蛋白I ,v onwillebrand 因子和内皮下组织中的胶原纤维参与,而血小板凝聚则由血小板释放ADP 和52羟色胺等活性物质协助完成.血小板的另外一种作用是促进血液凝固,在血液凝固过程中从因子Ⅺ的活化到凝血酶原激活物的形成一系列反应均在磷脂胶粒上进行,这种磷脂胶粒是由血小板提供的富含丝氨酸磷脂脂蛋白,对凝血因子和Ca 2+有较强的亲和力,为凝血酶原的激活提供了极为有利的条件,促进血液进一步凝固.基于血小板凝聚在血液凝固中所起到的作用,抑制血小板凝聚成为抗凝血研究的重要部分.目前从水蛭、蛇毒中提纯出的抗凝血蛋白酶也具有抑制血小板凝聚作用,只是这种作用相对于抑制凝血酶作用来说相对较弱而被忽视[28,29].第2期李旭霞等: 抗凝血蛋白药物的研究进展189 3 新型抗凝血药物的研制与开发我国传统中医在治疗溶栓、抗凝方面已有近千年的历史,但是蛋白质分子溶栓剂和抗凝剂的临床应用仅有四十余年.回顾溶栓蛋白酶药物发展大致经历了三代,第一代溶血栓药出现于70年代,以链激酶和尿激酶为代表.这类溶血栓药物的副作用较明显,主要会引起再出血,并且它们在循环系统中存留时间短暂,因此需要大剂量注射达到药效;第二代溶血栓药物即组织型纤溶酶原激活剂和单链尿激酶.组织型纤溶酶原激活剂与纤维蛋白特异性结合后发挥作用,单链尿激酶有较强的催化作用和组织型纤溶酶原激活剂的协同作用.尽管这两种酶有良好的溶栓性,但是它们在血循环中存留时间同样很短,仍然克服不了出血性副作用.第三代溶栓药物是导向溶栓药,其基本原理是使用与血栓成分纤维蛋白或血小板有高特异性的单抗为载体连接组织型纤溶酶原激活剂或尿激酶使溶栓性药物在血栓处富集,也可以通过磁性化合物为载体使溶栓药在血栓处富集,从而减少用药量.抗凝血药物一直以肝素为主.虽然肝素在体内外都有抗凝作用,但是应用肝素易伴随发生出血和血小板减少,使肝素在临床应用中受到了一定的限制[30].无论是修饰的组织型纤溶酶原激活剂还是尿激酶或者是低分子量肝素,由于无法克服的出血性副作用导致它们临床药用价值的降低.开发和研制新型的抗凝剂、溶栓剂已经成为现代药学的研究重点.尽管自然界中存在大量抗凝、溶栓活性的大分子活性物质,但由于提纯工艺难以工业化,大量提纯不利于资源保护等种种原因,获得天然的抗凝剂仍旧非常困难.现代的分子生物学技术成为解决这一问题的很好媒介,该技术不但可以从分子层次上阐明蛋白质作用机制,而且能够让珍稀的蛋白质资源成为价廉物美的普通产品.自1986年Harvey 等通过该技术成功的表达出有活性的水蛭素后,很多国家开始了天然抗凝血蛋白人工重组的研究,到目前为止已经从水蛭、蚯蚓、蛇毒、蝙蝠等生物体内克隆出很多抗凝血蛋白和溶栓蛋白的cDNA ,其中很多重组蛋白也成功的表达[31～37].随着DNA 重组技术的不断完善,相信在不久的将来会有更多重组抗凝血蛋白问世.参考文献:[1] 周爱儒.生物化学与分子生物学[M].北京:人民卫生出版社,2001.[2] 冯周琴.实用血检病学[M].郑州:河南科学技术出版社,1995.[3] SIDE LM ANN J J ,G RAM J ,J ESPERSE N J ,et al.Fibrinclot formation and lysis :basic mechanisms[J ].Sem in Thromb Hem ost ,2000,26(6):6052618.[4] STRUK OVA S M .Thrombin as a regulator of in flammation and reparative processes in tissues[J ].Biochem istry (M osc ),2001:66(1):8218.[5] COUG H LIN S R.Protease 2activated recedreceptors in vascular biology[J ].Thromb Haem osr ,2001,86(1):2982307.[6] CHANGJ Y.The functional domain of hirudin ,a thrombin 2specific inhibitor[J ].FE BS Lett ,1983,164(2):3072313.[7] M ARAG ANORE J M ,BOURDON P ,JABLONSKI J ,et al.Design and characterization of hirulogs :a novel class of bivalent peptide inhibitors ofthrombin[J ].Biochem istry ,1990,29(30):709527101.[8] 杨潼,李建秋,尹平.我国产日本医蛭水蛭素的分离和分化[J ].水生生物学报,1997,21(2):1692173.[9] VINCE NT CHOPIN ,MICHE L S A LZE ,J E AN 2LUC BAERT ,et al.Therostasin ,a N ovel Clotting Factor X a Inhibitor from the Rhynchobdellid Leech ,Theromyzon tessulatum [J ].The Journal of Biologigal Chem istry ,2000,275(42):32701232707.[10] ZHAO R L.A New P otent Inhibitor of Thrombin from the Leech Haemendipsa yanyuanensis [J ].Journal of Shanghai University (English Edition ),2001,5(1):86288.[11] 赵荣乐,徐建,程新,等.蚌蛙蛭抗凝血蛋白的分离及抗凝血特性的分析[J ].喀什师范学院学报,1999,19(1):60264.[12] VA LE NZ UE LA J G,FRANCISCHETTI I M ,RI BEIRO J M.Purification ,cloning ,and synthesis of a novel salivary anti 2thrombin from the m osquitoAnopheles albimanus [J ].Biochem istry ,1999,38(34):11209211215.[13] FRANCISCHETTI I M ,VA LE NZ UE LA J G,RI BEIRO J M.Anophelin :kinetics and mechanism of thrombin inhibition[J ].Biochem istry ,1999,38(50):166********.[14] MIHARA H ,S UMI H.A novel fibrinolyric enzyme extracted from the earthw orm ,Lumbricus rubllus [J ].Jpn J Physio ,1991,41(3):4612472.[15] S UMI H ,NAKE J ,MIHARAH.A very stable and potent fibrinolytic enzyme found in earthw orm Lumgbricus rubellus autolyzate[J ].C om p Biochemphsio B :C orp Biochem ,1993,106B (3):7632766.[16] 程牛亮,牛勃,张祖询,等.双胸蚓纤溶酶的纯化及性质[J ].生物化学杂志,1990,6(2):1862190.[17] 熊焱,杨四成,刘晓英,等.蚯蚓纤溶酶的纯化及部分序列测定[J ].生物化学杂志,1997,13(3):2922295.[18] 邵承斌.蚯蚓纤溶酶研究与应用进展[J ].渝洲大学学报,1999,16(3):47251.[19] 赵晓谕,静天玉.蚯蚓纤溶酶的成分分析[J ].中国生物化学与分子生物学报,1998,14(4):4072411.[20] 杨嘉树,李令媛,茹炳根.蚯蚓体内一种纤溶酶原激活剂(e 2PA )对ATEE 的部分性质研究[J ].中国生物化学与分子生物学报,1998,14(4):4212426.190 辽宁师范大学学报(自然科学版)第26卷[21] FURT ADO M F ,M ARUY AM A M ,K AMIG UTI A S ,et al .C om parative study of nine Bothrops snake venoms from adult female snakes and their off 2spring[J ].T oxicon ,1991,29(2):2192226.[22] RERZIOS A D ,M ARK LAND F S.Fibrinolytic enzymes from the venoms of Agkistrodon contortrix contortrix and Crotalus basiliscus basiliscus :cleavage site specificity towards the alpha 2chain of fibrin[J ].Thromb Res ,1994,74(4):3552367.[23] SIIG UR E ,M AHAR A ,SIIG UR J.Beta 2fibrinogenase from the venom of Vipera lebetina [J ].T oxicon ,1991,29(1):1072118.[24] M ARK LAND F S J R.Snake venoms[J ].Drugs ,1997,54(Suppl 3):1210.[25] ST OCKER K,FISCHER H ,MEIER J ,et al .Characterization of the protein C activator Protac from the venom of the s outhern copperhead (Agk 2istrodon contortrix )snake[J ].T oxicon ,1987,25(3):2392252.[26] ZHANG Y,WIS NER ANNE ,XIONG YL ,et al.A N ovel Plasm inogen Activator from Snak Venom[J ].J Biol Chem ,1995,270:10246210255.[27] 谢秋玲,郭勇,林剑.纳豆激酶活性测定方法[J ].广东药学,2000,10(6):8210.[28] 郭丹,吴曙光,陈娜娜.中国眼睛蛇毒蛋白酶的抗凝作用[J ].第一军医大学学报,2001,21(31):1902191.[29] 李文,廖福龙,殷晓杰.七种水蛭血小板聚集与抗凝血研究[J ].中药药理与临床,1997,13(5):32234.[30] 杜平中.溶栓药物研究新进展[J ].中国新药杂志,2001,10(8):5732576.[31] HARVEY R P ,DEG RY SE E ,STEFANI L ,et al.Cloning and expression of a cDNA coding for the anticoagulant hirudin from the bloodsucking leechHirudo medicinalis [J ].Peoc Natl Sci US A ,1986,83:1084.[32] 许长蔼,张要武,向开军,等.水蛭素的全基因合成及克隆[J ].华北农学报,2000,15(4):58261.[33] M ANABU S UGI M OT O ,NOBUY OSHI NAK A J I M A.M olecular Cloning ,Sequecing and Expression of cDNA Enocoding Serine Protease with Fibri 2nolytic Activity from Earthw orm[J ].Biosci Biotechnol Bioche ,2001,65(7):157521580.[34] 徐义辉,梁国栋,孙兆军,等.蚯蚓纤溶酶新基因PV242的克隆与表达[J ].生物化学与生物物理进展,2002,29(4):6102614.[35] K ON Y OU 2SE OK,CHUNG K W ANG 2HOE ,KI M DOO 2SIK.Purification and cDNA Cloning of Salm orin that Inhibits Fibrinogen Clotting[J ].Throm 2bosis Reseaech ,2000,99:3892398.[36] LIU Q ,X U W ,CHE NG X ,et al.M olecular cloning and sequence analysis of cDNA encoding haem orhagic toxin acutolysin A from Agkistrodon acutus[J ].T oxicon ,1999,37:153921548.[37] Z A V A LOV A L L ,BAS ANOV A A V ,BASK OV A I P.Fibrin ogen 2fibrin system regulators from bloodsuckers[J ].Biochem istry ,2002,67(1):1352142.The Development in the R esearch of Anticoagulant Protein DrugsLI Xu 2xia , LI Qing 2wei(C ollege of Life Sciences ,Liaoning N ormal University ,Dalian 116029,China )Abstract :In addition to anticoagulant factors in the blood ,there are still a large number of biological macro 2m olecules with anticoagulant activity in the natural field ,such as hirudin and earthw orm plasmin ,etc ..Basic reasearches have dem onstrated that the functioning mechanisms of these anticoagulants are generally realized in the following three aspects :the inhibition of thrombin and thrombin activators ;the hydrolization of fibrinogen or plas 2minogen ;the inhibition of platelet aggregations.Because these active substances possess highly efficient anticoagu 2lation and thrombolysis ,they are much likely to develop into drugs against thrombosis.The review summarizes the recent studies on the variety of anticoagulant proteins for the reference of counterparts concerned.K ey words :anticoagulant ;thrombin ;fibrin ;plasmin本刊进入的国际权威检索系统简介(四)德国《数学文摘》(Zbl )德国《数学文摘》(Zbl )是由德国科学技术信息公司(FIZ )编辑出版的月刊,每年收入世界130多个国家的学术期刊文章.目前,德国《数学文摘》收入的中国高校学报为60余家,《辽宁师范大学学报》(自然科学版)自2000年5月成为Zbl 的指定收录期刊,并于2001年3月成为首次进入Zbl 刊源表的22种中国期刊之一.第2期李旭霞等: 抗凝血蛋白药物的研究进展191。
蚓激酶胶囊治疗脑梗死患者的疗效和安全性
蚓激酶胶囊治疗脑梗死患者的疗效和安全性董强;乔健;史郎峰;吕传真;汪昕;范薇;陈生弟;刘建荣;陈沁;赵忠新;邵福源;黄流清;贺斌;庄建华【期刊名称】《中国新药杂志》【年(卷),期】2004(13)3【摘要】目的:评价蚓激酶胶囊治疗脑梗死的疗效和安全性.方法:采用多中心、随机双盲、安慰剂对照(2∶1)临床试验设计,73例发病3周后用药的脑梗死患者,分治疗组(n=50)和对照组(n=23),分别口服蚓激酶肠溶胶囊60万U和安慰剂2粒,tid,给药28d.统一实验室检测病例的凝血、纤溶、血液流变学指标,并评价患者的神经功能缺损和生活能力缺损程度.结果:治疗28d后,治疗组凝血酶原时间(PT)和部分凝血活酶时间(APTT)延长;纤维蛋白原(Fg)降低,D-二聚体含量增加;组织型纤溶酶原激活物(t-PA)含量提高,纤溶酶原激活物抑制物(PAI)含量降低;血浆黏度和全血黏度改善,且均具有显著性.安慰剂对照组则改变不明显.临床神经功能缺损评价,2组均有改善,但是治疗组恢复明显,治疗组有效率为88%,对照组47.8%.73例患者中,治疗组出现1例轻度上消化道出血(2%),无肝肾功能影响.结论:百奥蚓激酶胶囊治疗脑梗死安全有效,可作为治疗和预防缺血性脑血管病的有效药物.【总页数】4页(P257-260)【作者】董强;乔健;史郎峰;吕传真;汪昕;范薇;陈生弟;刘建荣;陈沁;赵忠新;邵福源;黄流清;贺斌;庄建华【作者单位】复旦大学附属中山医院神经科,上海,200032;复旦大学附属中山医院神经科,上海,200032;复旦大学附属华山医院神经科,上海,200040;复旦大学附属华山医院神经科,上海,200040;复旦大学附属华山医院神经科,上海,200040;复旦大学附属华山医院神经科,上海,200040;复旦大学附属中山医院神经科,上海,200032;复旦大学附属中山医院神经科,上海,200032;上海第二医科大学瑞金医院神经科,上海,200025;上海第二医科大学瑞金医院神经科,上海,200025;上海第二医科大学瑞金医院神经科,上海,200025;第二军医大学长征医院神经科,上海,200003;第二军医大学长征医院神经科,上海,200003;第二军医大学长征医院神经科,上海,200003【正文语种】中文【中图分类】R9694;R743.33【相关文献】1.蚓激酶胶囊联合普罗布考片治疗脑梗死患者颈动脉不稳定粥样斑块的疗效观察[J], 潘晓峰;邵卫;陈国华;张忠文2.蚓激酶胶囊联合普罗布考片治疗脑梗死患者颈动脉不稳定粥样斑块的疗效观察[J], 潘晓峰;邵卫;陈国华;张忠文3.蚓激酶胶囊联合阿司匹林治疗急性期脑梗死患者的疗效和安全性观察 [J], 周永炜;王文安;浦政;陈伟;姚革;王根发4.蚓激酶胶囊治疗脑梗死患者的疗效和安全性 [J], 孙硼朋5.研究与分析蚓激酶胶囊治疗脑梗死患者的临床价值 [J], 丰化微因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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另一个基因为PI242,是新发现的基因,2001年向 GenBank投送了与F-Ⅲ同源性相近的组分 PI239(GenBank,AF433650),并向中国国家知识产权局
英国学者Sturzenbaum在1997年1月向Genbank投送了 与上述序列同源性很高的一个来源于双胸蚓的蚯蚓胰 凝乳蛋白酶的mRNA序列(Genbank,AJ223152),但是没 有发表相关文献。
根据序列比较和同源性分析结果,同种组分日本和韩国 学者研究结果存在差异,可能因为不同地域的蚯蚓基因 发生不同的进化所造成的。这些序列的报道给蚓激酶 更为具体的鉴定提供了可能。
13来源于双胸蚓(Lumbricus bimastus)的蚓激酶
牛勃等[5]经分离纯化获得了一个相对分子质量为 22·1×103的单一蛋白酶组分。梁国栋等测定了一种来 源于双胸蚓蚯蚓纤溶酶的mRNA序列 (Genbank,AF109648),其编码的成熟肽序列N端与F-Ⅱ 一致,但与F-Ⅲ-1和F-Ⅲ-2的序列同源性仅35%左右。
申报了名为《正蚓科双胸蚓属蚓激酶基因核苷酸序列 及其克隆方法》的发明专利(公开号:CN 1208770A)。
赵晓瑜等于2001年11月报道了来源于赤子爱胜蚓 (Eiseniafetida)中的一个纤溶组分的共180个氨基酸残 基的氨基酸序列(GenBank,AF432224—1)。较早的相关 序列报道还有韩国Choi在1995年4月向Genbank投送了 与日本的F-Ⅲ-1和F-Ⅲ-2相应的来源于双胸蚓的2种蚓 激酶的mRNA序列(Genbank,U25648,U25643),但至今 没有发表相关的文献;
其中EFE水解纤维蛋白的活性较强,适用于防治血栓及栓塞 性疾病。因此EFE的分离纯化、理化性质、作用机制及临 床应用受到国内外广泛的重视。
1 蚓激酶的分离纯化
1·1 来源于粉正蚓(Lumbricus rubullus)的纤溶酶 通过层析、电泳、质谱等对氨基酸组成、N-末端序
列等方面的研究,Nakajima等确定了来源于粉正蚓的 EFE含有6个丝氨酸蛋白酶组分:F-I-0,F-I-1,F-I-2,F-Ⅱ,FⅢ-1,F-Ⅲ-2,并测定它们的N端序列,见表1。
梁国栋等则将从我国特有的双胸蚓属 (Lumbricusbimastus)中获得的蚓激酶新基因 PV242,PI239分别在大肠杆菌和杆状病毒中进行了表达。 这些工作为蚓激酶的进一步分子生物学研究和基因工 程开发奠定了基础。
在蚓激酶基因重组和表达方面,Nakajima等报道了来源 于粉正蚓的蚯蚓纤溶组分F-Ⅲ-2基因的克隆和表达。
中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验 室刘俊峰等[9]用逆转录PCR的方法从赤子爱胜蚓中克 隆了编码蚓激酶组分A的cDNA,导入大肠杆菌的表达 载体pQE31和pMAL- c2X构建了相应的表达质粒,并分 别在大肠杆菌菌株M15中诱导表达出了重组蛋白,一种 以包涵体形式存在,而另一种是具有纤溶活性的可溶性 蛋白。
早在1596年我国《本草纲目》对蚯蚓的药用就
有详细记载。1878年法国人发现蚯蚓消化器官的分
泌物能降解纤维蛋白。20世纪70年代以来,中国、
日本和韩国的科学家对蚯蚓提取物进行了酶学组分、
理化性质及临床应用的研究。1979年Pak发现蚯蚓
提取物中含有能降解酪蛋白、明胶和清蛋白的水解
酶
。
1983年Mihara等从粉正蚓(Lumbricus rubullus)中分离出 具有溶纤活力的粗提物,并将其命名为蚓激酶 (lumbrokinase)。随后,蚯蚓纤维蛋白水解酶(earthworm fibrinolytic enzymes,EFE)、丝氨酸内切蛋白酶、蚯蚓磷 脂激酶等相继被分离出来。
14蚓激酶的序列测定和基因组结 构及重组研究
日本学者Nakajima等[6]报道了来源于粉正蚓中的具纤 溶活性的丝氨酸蛋白酶组分F-Ⅲ-1, F-Ⅲ-2的mRNA的 序列测定结果(GenBank, AB045719,AB045720), F-Ⅲ-1 和F-Ⅲ-2的同源性达到90%左右,但是为确切不同的2种 蛋白质。
中国科学院生物物理研究所蚓激酶研究小组从事该领 域研究已经有十几年的时间,最近他们将来自赤子爱胜 蚓的蚓激酶组分A(EFEa)培养出了单晶,并用X-射线衍 射分析其晶系,测定晶胞参数,收集完整的分辨率数据, 测定氨基酸序列,构建完整的结构模型,并提出与底物结 合、剪切机制。
EFEa是第一个被确定三维晶体结构的蚓激酶组分,也是 第一个来源于环节动物的丝氨酸蛋白酶的晶体结构。 序列比较显示EFEa与F-Ⅱ基本一致。
北京百奥药业公司最近也分离出蚓激酶单一组分,体外 溶栓试验和毒性试验均显示好结果,目前尚无进一步 的报道。
李莉[4]采用琼脂糖凝胶-间氨基苯硼酸亲和层析法从 蚯蚓的匀浆中分离纯化出一糖基化组分,经SDS-PAGE 检测为单一成分,质谱测定其相对分子质量为24 193。 N-末端的序列为:Ala-Glu-Val-Cys-Cys-Asp-Ile-,与已知 的纤溶酶都不同。该糖基化组分对纤维蛋白和蛋白酶 底物Chromozym TH具有显著的水解活性。
1·2来源于赤子爱胜蚓(Eiseniafetida) 的纤溶酶
周元聪等发现赤子爱胜蚓提取物中至少含有7组具有溶 解纤维蛋白活性的组分。经FPLC分离,得到3种纯的纤 溶酶,其中1种同工酶N末端是亮氨酸底物专一性研究结 果显示,该酶的专一性不同于尿激酶而与组织型纤溶酶 原激活物相似。
嘉树等报道了来源于赤子爱胜蚓的相对分子质量为 45×103的EFE由2个片断组成(26×103和18×103),其中大 片段有催化活性,其N端序列与日本报道F-Ⅲ-1(或F-Ⅲ2)和F-Ⅱ的相似。