实验六 鸡蛋清中清蛋白的提取与定量测定
蛋白物质鉴定实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质的鉴定方法。
2. 学会使用双缩脲试剂进行蛋白质鉴定实验。
3. 了解蛋白质鉴定实验的原理及注意事项。
二、实验原理蛋白质是由氨基酸组成的大分子化合物，具有复杂的结构和多种生物学功能。
蛋白质的鉴定主要基于其特有的氨基酸序列和空间结构。
本实验采用双缩脲试剂鉴定蛋白质，原理如下：在碱性条件下，蛋白质分子中的肽键与Cu2+离子发生反应，形成紫红色的络合物。
络合物的颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，从而实现蛋白质的定量分析。
三、实验材料1. 蛋白质样品：鸡蛋清、牛奶、豆奶等。
2. 双缩脲试剂：A液（含0.1g/mL NaOH溶液）、B液（含0.01g/mL CuSO4溶液）。
3. pH试纸、试管、移液器、滴管、白瓷板等。
四、实验步骤1. 准备样品：分别取鸡蛋清、牛奶、豆奶等蛋白质样品，用蒸馏水稀释至适当浓度。
2. 检测蛋白质含量：取3支试管，分别加入0.5mL鸡蛋清、牛奶、豆奶样品，再加入1mL蒸馏水。
3. 添加双缩脲试剂：向每支试管中加入1mL A液，摇匀。
4. 观察颜色变化：静置5分钟，观察溶液颜色变化。
5. 比色：取3支试管，分别加入1mL A液、B液，摇匀。
将上述样品试管与比色管进行比对，观察颜色深浅。
五、实验结果与分析1. 鸡蛋清、牛奶、豆奶样品在加入双缩脲试剂后，溶液颜色均呈紫红色，说明蛋白质含量较高。
2. 比色结果显示，鸡蛋清样品颜色最深，牛奶次之，豆奶最浅。
这可能是因为鸡蛋清中的蛋白质含量最高，牛奶次之，豆奶最低。
六、实验讨论1. 本实验中，双缩脲试剂对蛋白质的鉴定具有较高的灵敏度，能够有效区分不同蛋白质样品。
2. 实验过程中，应注意pH值对蛋白质鉴定的影响。
本实验采用碱性条件，有利于蛋白质与Cu2+离子发生反应。
3. 实验结果受蛋白质样品浓度、试剂比例等因素影响。
在实验过程中，应严格控制这些因素，以确保实验结果的准确性。
七、实验结论通过本实验，我们掌握了蛋白质的鉴定方法，学会了使用双缩脲试剂进行蛋白质鉴定实验。
实验六血清γ-球蛋白的分离、纯化及鉴定幻灯片
故经DEAE纤维素阴离子交换层析流出的第 一局部蛋白质为纯化的γ球蛋白。
纯化前后的γ球蛋白用电泳法进展鉴定。
操作
一、盐析 <1>取1ml血清1ml， <2>取1ml饱和(NH４)２SO４溶液缓慢滴入，
边加边摇。 <3>混匀后于室温中放置10分钟。
<4>然后每分3500转离心10分钟，并小心 吸去上清液，用滤纸条吸除上清夜。
浓缩
刷一个干净的小试管，滤纸上控干。 找一张干净的纸条，折叠，倒入一包葡聚
糖ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ粉，小心的送入试管底部。 参加1号管的样品，小心的震荡混匀，取上
层液体一滴上样。
如果液体太少，小心的滴加2号试管的液体， 混匀，取上清夜点样。
回收！
四、醋酸纤维素薄膜电泳检查
样品：(1) (2) 纯化的γ－球蛋白液(由于此溶液浓度较低，
凝胶有多种，葡聚糖凝胶是最常用的一种人工合 成凝胶。
混合物中各种物质同时进展着两种不同的运动，垂 直向下移动和无定向的扩散运动。
大分子物质(蛋白质)直径大不能入凝胶颗粒的网孔， 垂直向下的速度较快。小分子物质(无机盐)可扩散入 凝胶颗粒网孔之中，
结果小分子物质流出所经的路程较大分子为
长，从而使混合物中各组分按分子大小不同的顺序
〔二〕上样与洗脱：
1、小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上缓冲液面刚 好下降到凝胶床外表(注意不要使液面低于凝胶床 外表以致空气进展凝胶床)。
2、关紧下端出口，用滴管吸取盐析球蛋白液，小 心缓慢的加到凝胶床外表上(注意不要将凝胶粒中 冲起或破坏凝胶床外表的平整)。
3、开下端出口，使样品进入凝胶床，关闭 出口，小心参加适量pH6.3磷酸缓冲液。
操作
人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定
血清白蛋白的纯化——离子交换层析
①装柱：将层析柱固定，保持垂直位。将浸胀的 DEAE- 纤维素装入柱内，至 810cm高度，平衡过夜（装柱时应注意均匀，凝胶内不得有气泡，凝胶床要平整）。 ②准备50-100支试管，置于自动收集器上；洗脱液经核酸蛋白检测仪监视，调节
流速为 1mL/min，蛋白质检测器调零。
编号
1 2 3 4 5 6 总体积
溶液名称
30% Acr –0.8% Bis pH 6.7 Tris- HCI 10%SDS TEMED 10%AP H2O
4%浓缩胶
0.33ml 0.63ml 25ul 2.5ul 12.5ul 1.5ml 约2.5 mL
血清白蛋白相对分子量的测定
c. 样品的处理： 向标准蛋白质或待测样品中按比例加入上样缓冲液（Loading dye），充分溶解后，加盖（不要密闭），置沸水浴3 min， 取出冷至室温。 加样示意图：
盐析过程中温度和pH的 控制不当，可能使得所 得目标产物白蛋白量较 少，影响后续测定。
离子交 换层析
SDS-PAGE法
盐析
可能出现的问题！！！
②4℃，3000rpm离心15min，收集上清液。 ③用5%的柠檬酸缓冲液调节pH至4.5（即白蛋白的等电点），用量筒确定上清液的
体积，确定上清液的体积，计算加入饱和硫酸铵（pH＝4.5）的体积（0.11×V）。
④逐滴加入饱和硫酸铵（pH＝4.5），边加边振荡，4 ℃静置2 h。 ⑤4 ℃，3,000 rpm离心20 min，弃上清，沉淀用0.5 ml pH 7.4的柠檬酸Na2HPO4缓冲液溶解。
③上样：将透析袋剪开，用移液管转至凝胶面上，待样品进入凝胶后再加入少量缓 冲液，使样品完全进入胶内。
实验记录-Western-Blot之蛋白的提取与定量
细胞蛋白的提取与测定蛋白提取原理：蛋白质是一切生命活动的承担者，为了研究及探索蛋白质的功能、特异性蛋白表达水平、翻译后修饰（甲基化磷酸化等）、蛋白-蛋白或蛋白-核酸之间相互作用的研究，进一步阐明众多疾病的机制，同时为疾病治疗提供理论依据，因此需要提取目的蛋白，由于蛋白质种类繁多，结构复杂，需要通过一些步骤使细胞裂解、杂志去除、蛋白纯化来得到目的蛋白。
一、贴壁细胞蛋白的提取：（所有操作均在冰上进行）准备相应数量的EP管标记后放放冰上备用1.裂解液制备：每1ml蛋白裂解液（RIPA）加入10ul蛋白酶抑制剂（如PMSF保护蛋白，使其免于被蛋白酶降解），配好后冰上备用；2.此处以6孔板为例，吸掉培养基后每孔加入1-2ml冰PBS溶液，清洗 2-3次，吸净残余BPS（如果有残留的话有可能使提取的蛋白稀释）；3.加入适当体积的裂解液，让裂解液与细胞充分混匀，冰上裂解30min；4.裂解完成后，用细胞刮刀将细胞刮下，将细胞及裂解液吸入离心管，放离心机4℃12000rpm 离心30min（离心机提前预冷），上清即为蛋白溶液，细胞碎片沉降于底部；5.蛋白提取完成后a.可放置于-20℃保存（长期保存放于-80℃）；b.可取出部分进行BCA 定量分析；c.做western blot，需要对蛋白进行变性处理后储存于-20℃或-80℃的冰箱中保存（根据蛋白变性条件不同有所不同，例如在100℃的高温下水浴锅煮5-10分钟）。
二、组织中总蛋白的提取：1.将已称重的冷冻组织（约50g）放入预冷好的研钵中，用研杵快速研磨组织，（有的需要加入液氮），直至组织被研磨成匀浆（无明显颗粒）；2.裂解液制备：取250ulRIPA裂解液+2.5ul 100mmol/L蛋白酶抑制剂+2.5ul蛋白酶抑制剂复合物Cocktail(多种小分子组成的抑制剂混合物能更好的保护蛋白不被蛋白酶降解)；3.取适量研磨的匀浆放入离心管，加入配好的裂解液，冰上孵育40min；4.离心：4℃ 12000rpm 离心15min 保留上清；5.将蛋白溶液防止于-20℃保存（长期保存放于-80℃）。
纯蛋白提取实验报告
一、实验目的1. 学习掌握从生物材料中提取纯蛋白的基本原理和方法。
2. 了解不同提取方法的适用范围和优缺点。
3. 掌握蛋白质纯度鉴定的基本方法。
二、实验原理蛋白质是生物体内重要的生物大分子，具有多种生物学功能。
从生物材料中提取纯蛋白是研究蛋白质结构和功能的基础。
本实验采用组织匀浆法、盐析法、凝胶层析法等提取纯蛋白，并利用SDS-PAGE、Western Blot等方法鉴定蛋白质纯度。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：小鼠肝脏组织、鸡蛋清、大豆蛋白粉等。
2. 试剂：Tris-HCl缓冲液、NaCl、SDS、β-巯基乙醇、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、Western Blot试剂盒等。
3. 仪器：高速离心机、电泳仪、凝胶成像系统、恒温水浴锅、微波炉等。
四、实验方法1. 组织匀浆法提取蛋白：(1) 将小鼠肝脏组织剪碎，加入适量Tris-HCl缓冲液（pH 7.4），用玻璃匀浆器匀浆。
(2) 将匀浆液在4℃、12,000 rpm下离心10分钟，收集上清液。
(3) 用SDS-PAGE检测蛋白提取效果。
2. 盐析法提取蛋白：(1) 将鸡蛋清加入适量Tris-HCl缓冲液（pH 7.4），搅拌。
(2) 逐渐加入饱和硫酸铵溶液，使蛋白质盐析。
(3) 将混合液在4℃、12,000 rpm下离心10分钟，收集沉淀。
(4) 将沉淀溶于适量Tris-HCl缓冲液（pH 7.4），用SDS-PAGE检测蛋白提取效果。
3. 凝胶层析法提取蛋白：(1) 将大豆蛋白粉溶于适量Tris-HCl缓冲液（pH 7.4），搅拌。
(2) 将溶液通过Sephadex G-100凝胶柱，收集洗脱液。
(3) 用SDS-PAGE检测蛋白提取效果。
4. 蛋白质纯度鉴定：(1) 将提取的蛋白质进行SDS-PAGE电泳。
(2) 将电泳后的凝胶进行Western Blot检测，鉴定蛋白质纯度。
五、实验结果与分析1. 组织匀浆法提取蛋白：SDS-PAGE结果显示，小鼠肝脏组织蛋白提取效果较好，蛋白质条带清晰。
蛋白质的提取及测定
蛋白质的提取及含量测定蛋白质的提取1.藻细胞破碎方法1.1反复冻融法：将藻细胞在20℃以下冰冻，再在4℃左右融解，反复3-4次，利用细胞内冰粒的形成和细胞液盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
在显微镜下观察计数细胞破碎率可达90%以上，将破碎的的藻细胞悬浊液于4000 r/min离心20 min，弃沉淀，上清液加入一定量的壳聚糖，浓度为10g/L，充分搅拌后，4℃静置12 h，离心，取上清液。
该法操作简单、方便，适用于实验室少量藻体材料的处理。
1.2溶胀法：直接用蒸馏水或低盐溶液浸泡藻体细胞，使其溶胀、破裂，释放出藻胆蛋白。
用15 g/ L N a N O3或1 0 m m o l / L CaCl2的浸泡效果好。
余九九等比较了液氮冻融法和超声波法后，认为采用蒸馏水或低浓度CaCl2溶液40℃条件下浸泡螺旋藻的提取方法效果较好。
但溶胀法提取周期较长，用蒸馏水要浸泡10 d，用低浓度CaCl2溶液也需浸泡3~4d。
1.3超声波法：运用超声波破碎藻体细胞的细胞壁，使藻胆蛋白溶出。
在80w的超声清洗仪中超声30min，以破坏藻细胞的细胞壁。
该法常作为藻胆蛋白提取中的辅助方法。
单纯用超声波来破碎藻体细胞壁是不够的，还必须与其它方法合用，以最大限度地破碎藻体细胞。
1.4组织捣碎法：将材料配成稀糊状液，用高速组织捣碎机来破碎藻体细胞。
实际操作中，上述几种方法经常混合使用，以最大限度地破碎藻体细胞，使藻胆蛋白溶出。
2.粗提方法2.1盐析法：取上述藻蛋白粗体液，加入25%梯度饱和硫酸铵溶液，4℃静置12 h，离心，离心，取上清液，追加至55%饱和度，4℃静置12 h，离心。
将2次盐析得到的粗体液置于5%硫酸铵饱和梯度中，4℃静置12 h，离心，取上清液，追加至35% 饱和度，4℃静置12h，离心。
将4次盐析得到的粗体液置于23%硫酸铵饱和梯度中，4℃静置12 h，离心，取上清液，追加35%饱和度，4℃静置12h，离心。
蛋白质的定性实验报告
一、实验目的1. 了解蛋白质的基本性质和鉴定方法。
2. 掌握使用化学试剂对蛋白质进行定性的基本操作步骤。
3. 熟悉蛋白质与某些特定试剂反应的颜色变化，提高对蛋白质的识别能力。
二、实验原理蛋白质是生物体内重要的有机化合物，由氨基酸组成。
蛋白质具有多种功能，如构成细胞结构、催化化学反应、传递信息等。
蛋白质的定性实验主要利用其与特定试剂反应产生的颜色变化来识别和鉴定。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：鸡蛋清、鸡蛋黄、牛奶、大豆蛋白等。
2. 试剂：双缩脲试剂、浓硝酸、氢氧化钠溶液、三氯乙酸、苯酚等。
3. 仪器：试管、烧杯、滴管、酒精灯、显微镜等。
四、实验步骤1. 蛋白质鉴定实验（1）取鸡蛋清、鸡蛋黄、牛奶、大豆蛋白等样品，分别加入试管中。
（2）向每个试管中加入适量的双缩脲试剂，观察颜色变化。
（3）向每个试管中加入浓硝酸，观察颜色变化。
（4）向每个试管中加入氢氧化钠溶液，观察颜色变化。
2. 蛋白质溶解性实验（1）取鸡蛋清、鸡蛋黄、牛奶、大豆蛋白等样品，分别加入试管中。
（2）向每个试管中加入适量的三氯乙酸，观察蛋白质的溶解性。
（3）向每个试管中加入适量的苯酚，观察蛋白质的溶解性。
3. 蛋白质分子量测定实验（1）取鸡蛋清、鸡蛋黄、牛奶、大豆蛋白等样品，分别加入试管中。
（2）向每个试管中加入适量的双缩脲试剂，观察颜色变化。
（3）将每个试管中的溶液用显微镜观察，计算蛋白质分子量。
五、实验结果与分析1. 蛋白质鉴定实验（1）双缩脲试剂与蛋白质反应，产生紫色复合物，表明样品中含有蛋白质。
（2）浓硝酸与蛋白质反应，产生黄色复合物，表明样品中含有蛋白质。
（3）氢氧化钠溶液与蛋白质反应，产生红色复合物，表明样品中含有蛋白质。
2. 蛋白质溶解性实验（1）三氯乙酸与蛋白质反应，蛋白质溶解性降低，表明样品中含有蛋白质。
（2）苯酚与蛋白质反应，蛋白质溶解性降低，表明样品中含有蛋白质。
3. 蛋白质分子量测定实验通过显微镜观察，根据蛋白质颜色深浅和大小，计算出蛋白质分子量。
蛋黄蛋白提取实验报告
一、实验目的通过本实验，了解蛋黄蛋白的提取原理和过程，掌握蛋黄蛋白的提取方法，并对其提取效果进行评估。
二、实验原理蛋黄蛋白是鸡蛋蛋黄中的一种重要蛋白质，具有丰富的营养价值。
蛋黄蛋白的提取方法主要有酸沉法、碱沉法、盐析法等。
本实验采用碱沉法提取蛋黄蛋白，即利用碱性溶液使蛋黄蛋白发生变性，从而使其从蛋黄中分离出来。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：- 新鲜鸡蛋- 蒸馏水- 氢氧化钠（NaOH）溶液- 硫酸铵（(NH4)2SO4）溶液- 乙醇- 无水硫酸钠（Na2SO4）2. 试剂：- 酚红指示剂- 1mol/L的盐酸（HCl）- 0.1mol/L的氢氧化钠（NaOH）溶液- 0.1mol/L的硫酸铵（(NH4)2SO4）溶液四、实验仪器1. 研钵2. 烧杯3. 漏斗4. 滤纸5. 搅拌棒6. 电子天平7. 酸度计8. 离心机五、实验步骤1. 将新鲜鸡蛋洗净，打破，取出蛋黄。
2. 将蛋黄捣碎，加入适量的蒸馏水，搅拌均匀。
3. 用酚红指示剂检测溶液的pH值，调整至pH值为8.0。
4. 向蛋黄溶液中加入适量的1mol/L的氢氧化钠（NaOH）溶液，搅拌均匀。
5. 将溶液静置30分钟，使蛋黄蛋白充分沉淀。
6. 用漏斗和滤纸将沉淀物过滤，收集滤液。
7. 向滤液中加入适量的硫酸铵（(NH4)2SO4）溶液，搅拌均匀。
8. 将溶液静置30分钟，使蛋黄蛋白进一步沉淀。
9. 用漏斗和滤纸将沉淀物过滤，收集滤液。
10. 将滤液置于离心机中，以3000r/min离心10分钟。
11. 取出离心后的沉淀物，用无水硫酸钠（Na2SO4）进行干燥。
12. 将干燥后的蛋黄蛋白进行称重，计算提取率。
六、实验结果与分析1. 蛋黄蛋白提取率：根据实验数据，本实验蛋黄蛋白的提取率为80%。
2. 蛋白质含量：通过比色法测定，本实验提取的蛋黄蛋白中蛋白质含量为70%。
七、实验讨论1. 实验过程中，pH值的调整对蛋黄蛋白的提取效果有重要影响。
pH值过高或过低都会影响蛋白质的溶解度，从而影响提取率。
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实验八：鸡蛋中卵清蛋白的提取和定量测定
分16组，每组两人
一、目的
掌握盐析沉淀法提取鸡蛋卵清蛋白的提取和定量测定（考马斯亮
蓝G-250）
二、原理
沉淀法也称溶解度法。其纯化生物大分子物质的基本原理是，根
据各种物质的结构差异（如蛋白质分子表面疏水基团和亲水基团之间
比例的差异）来改变溶液的某些性质,(如PH，极性离子强度，金属
离子等)，就能使抽提液中有效成分的溶解度发生变化。换句话说就
是，不同物质置入相同的溶液，溶解度是不同的；相同的物质置入不
同的溶液，溶解度也是不一样的。因此选择适当的溶液就能使欲分离
的有效成分呈现最小溶解度，而使杂质呈现最小的溶解度，或者相反，
有效成分呈现最小溶解度，而杂质呈现最大的溶解度，然后经过适当
的处理，即可达到从抽提液中分离有效成分的目的。
盐析法是根据蛋白质再稀盐溶液中，溶解度会随着盐浓度的增高
而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下
降，直到蛋白质析出（盐析），盐析导致蛋白质分子表面电荷被中和，
水化膜被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液析出。
三、实验材料
鸡蛋
四、实验步骤
1.将鸡蛋一端敲一小孔，用吸管吸取卵清蛋白2.5毫升，加生理盐水
2.5毫升得到稀释液
2.逐滴加入饱和硫酸铵溶液5毫升（边加边搅拌）静置10分钟，3000
转每分钟离心10分，弃沉淀，取上清液。
3.再在上清液中加固体硫酸铵，至不能在溶解硫酸铵为止，静置10
分钟
4. 置于离心管中以3000转每分钟离心十分钟，弃上清液，沉淀用5
毫升生理盐水溶解（粗产品）
5. 取1毫升粗产品进行稀释，使其吸光值在0.1-1之间。
6. 用1毫克每毫升的标准牛血清蛋白溶液制作标准曲线及测定上述
稀释后产品的蛋白含量
7.记录结果，数据处理。
实验八、鸡蛋中卵清蛋白的提取和定量测定
分16组，2人一组，
所需仪器：大试管架16个
带塞比色管16组×7支=128支
比色皿6套×4个=24个
722分光光度计6台
1毫升移液管16×2支=32支
2毫升移液管16×2支=32支
5毫升移液管16×2支=32支
10毫升带赛试管16×2支=32支
钥匙6把
吸管16支
吸耳球16×2支=32个
离心管16×2支=32支
离心机4台
所需要药品：
（1）标准蛋白质溶液：0.1mg/ml（每组需6毫升）四个班配500毫升。
称取50 mg牛血清蛋白溶于0.9%氯化钠溶液500毫升。
（2）考马斯亮蓝G-250染料试剂（每组需50毫升）配3000毫升棕色瓶保存
称考马斯亮蓝G-250 0.1克，溶于95%乙醇溶液50 ml，再加入85%
磷酸（50g/L）100 ml，用水稀释至1000 ml，此溶液在室温下可放置1
个月
（3）0.9%氯化钠溶液（每组需8 ml）配1000 ml
（4）硫酸铵饱和溶液（配500毫升）
（5）硫酸铵固体（6瓶）