PCR_DGGE对长江河口八种野生鱼类肠道菌群多样性的比较研究
饲喂蚕豆的草鱼肠道细菌群落的PCR-DGGE 分析
饲喂蚕豆的草鱼肠道细菌群落的PCR-DGGE 分析吴康;胡俊;黄晓声;夏虎;陈亮;李男;张学振【期刊名称】《淡水渔业》【年(卷),期】2014(000)005【摘要】为探讨饲喂蚕豆（Vicia faba）对草鱼（Ctenopharyngodon idellus）肠道菌群的影响，采用PCR-DGGE技术比较了饲喂蚕豆的草鱼（脆肉鲩组）及饲喂配合饲料的草鱼（普通草鱼组）肠道微生物菌群的异同。
结果显示， DGGE图谱上出现了20条明显条带，表明脆肉鲩组及普通草鱼组肠道中均存在大量细菌群落。
对这20条条带测序后，获得了其中17条条带的序列，这17条条带中有9条是尚未被培养的细菌。
经分析发现，这17条条带分属于变形菌门（ Proteobacteria ）、放线菌门（ Actinobacteria ）、厚壁菌门（ Firmicutes ）、拟杆菌门（ Bacteroidetes ）及未分类的细菌，其中变形菌门为两组肠道的优势菌。
实验还发现，饲喂蚕豆对肠内容物菌群的影响大于对肠壁菌群的影响。
结果表明，饲喂蚕豆不改变草鱼肠道菌群的种类，但对肠道菌群的相对丰度有一定影响。
%To evaluate the effect of faba bean on intestinal flora , the intestinal microbiota of crisp grass carp group ( grass carp fed with faba bean ) and grass carp group ( grass carp fed with formula feed ) were investigated using 16S rDNA PCR denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) technology.Twenty DGGE bands appearing in DGGE fingerprint re-vealed that there were numerous intestinal microbiota in the two groups .Seventeen DGGE bands were successfully se-quenced.However, nine of these bands were classified as unculturableaccording to the phylogenetic analysis .The domi-nant bacteria in the fore-gut and mid-gut of the two groups all belonged to Proteobacteria , and other bacteria identified be-longed to actinobacteria, firmicutes, bacteroidetes and unclassified-bacteria.The result also showed that the influence caused by faba bean on intestinal microbiota was more remarkable in intestinal content than in intestinal wall .These results suggested that feeding faba bean did not change the microbial diversity of grass carp intestine , but affected the relative a-bundance of some bacteria .【总页数】6页(P21-26)【作者】吴康;胡俊;黄晓声;夏虎;陈亮;李男;张学振【作者单位】华中农业大学水产学院，武汉 430070; 淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心，武汉 430070;华中农业大学水产学院，武汉 430070; 淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心，武汉 430070;中山市水产技术推广中心站，广东中山528403;华中农业大学水产学院，武汉 430070; 淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心，武汉 430070;华中农业大学水产学院，武汉 430070; 淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心，武汉 430070;中山市水产技术推广中心站，广东中山528403;华中农业大学水产学院，武汉 430070; 淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心，武汉 430070【正文语种】中文【中图分类】S917.4【相关文献】1.基于PCR-DGGE技术的3种植食性叶蜂幼虫肠道细菌群落结构分析 [J], 张帅帅;南小宁;王云果;朱兰芳;贺虹2.粘虫肠道细菌群落多样性的PCR-DGGE指纹图谱分析 [J], 何彩;南小宁;张正青;李孟楼3.三种室内饲养鱼类肠道微生物群落PCR-DGGE指纹分析 [J], 李学梅;余育和;解绶启;颜庆云;陈宇航;董小林4.中华蜜蜂肠道细菌群落的PCR-DGGE分析 [J], 丁进;张国只;苏丽娟5.脆化草鱼与氹仔草鱼的肠道细菌群落PCR-DGGE指纹图谱及多样性分析 [J], 郁二蒙;余德光;毕香梅;谢骏;王广军;龚望宝;王海英;李志斐因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
利用ERIC-PCR和PCR-DGGE技术分析喂服枯草芽孢杆菌肉鸡肠道菌群的多样性
动 物肠道 中寄生 着种 类繁 多和数 量 巨大 的微生
鸡 饲 喂枯草 芽孢杆 菌 Ｄ１制剂 后 可显 著增 加 肠 道 中 乳 杆菌 的数 量和极 显 著 减 少 沙 门 氏菌 的数 量 ， 对 但 大肠杆 菌没 有影 响 。Ｔ ｏ等 口 ｅ 报道 肉鸡饲 喂每 ｔ 含 有 １ 。个枯草 芽 孢杆 菌 的饲 粮 ， 肠 道乳 杆 菌和 双 ０ 对 歧 杆菌 的数量 没有 影 响 ， 可 使有 害菌 如 大肠 杆 菌 但 和梭 菌 的 数 量 减 少 １～ ２ ｌ Ｃ Ｕ／ ） 但 利 用 ｇ（ Ｆ ｇ 。 Ｅ Ｃ Ｐ Ｒ 和 Ｐ Ｒ— ＲＩ ． Ｃ Ｃ ＤＧＧＥ分析 动物 饲喂芽 孢杆 菌 之后 肠道 菌群 结构 及 多样 性 未 见 报 道 ， 此本 试 验 因 拟通 过对 肉鸡 喂服 枯 草 芽孢 杆 菌 Ｐ ｂ ２菌 悬 液后 ， ａ０ 采用 Ｅ Ｃ Ｐ Ｒ 和 Ｐ ＲＩ ． Ｃ ＣＲ． ＤＧＧＥ 方 法 研 究 肠 道 菌
微 生 物 培 养 的 分 子 生 物 技 术 为 研 究 肠 道 微 生 态 提 供
化后 ， 接种于 ２０ ０ｍＬ营养 肉汤 中，７℃、６ ／ ｎ ０ ３ １０ｒｍｉ
振 荡 培 养 １ 。５ ０ ０ｒ ｍｉ 、 离 心 ２ ｎ 收 ８ｈ ０ ／ ｎ ４ｏ Ｃ ０ｍｉ ，
了简便 而 快 捷 的 方 法 ］ 其 中变 性 梯 度 凝 胶 电泳 ， （ ＤＧＧＥ 技术 近年来 逐渐 被应 用于检 测猪 、 、 和 ） 牛 羊
利用PCR-DGGE技术研究不同代乳料对奶公犊粪样细菌区系的影响
犊， 从 直 肠 采 集 粪样 ， 采 用Ｐ Ｃ Ｒ — Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ技 术 测 定 粪 样微 生物 区 系 ， 变性 梯 度凝 胶 电泳 （ Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ） 图谱 用 Ｑ ｕ ａ ｎ ｔ ｉ ｔ ｙ Ｏ ｎ ｅ 软件进 行 分析 。结果表 明： ＋ ｋ Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ图谱 可 以 直 观 反 映 菌 群 的 多样 性 ， 其 中ＭＲ组 和 ＭＲ Ｃ组 都 含 有 代 乳 粉 ， 条 带 数 目为 ２ ２ ． ６ ７， 而 Ｃ组 务 带 数 为 １ ８， 显著 低 于含 有代 乳 粉 的２ 组（ Ｐ ＜ ０ ． ０ ５ ） ； 相 似 性分 析表 明 ， 精 料 组 和 ＭＲ． ＭＲ Ｃ
本研 究 通 过Ｐ Ｃ Ｒ — Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ 技术 研 究不 同代乳 料 对
奶公 犊粪 样 细菌 区系 的影 响 ，揭示肠 道微 生 物菌 群 的 多样性 ，为健康 的奶 公犊 生产 技术 提供 一 定 的科
学依 据 ， 丰 富奶公 犊饲 养技 术
１ 材 料 与 方 法
１ ． １ 试 验设Байду номын сангаас计
生物群 落进行研 究 ，避免 了传统 方法 中的技 术障碍 ， 为肠道微 生物 的研究提供 了可靠 的研 究手段 。
与 宿主间 的相互 作用 ， 对宿 主的生理 状态 和健康产 生
深远 的影 响 ， 一 方面微 生物代 谢产 物为宿 主提供 了生 命 活动 中所必需 的 营养 物质 ， 另一 方面可 以调节 宿主 免疫 功能 。 粪 中微生 物与结肠微 生物 间具 有９ ９ ％的相 似性 ，因此可 以利用 粪样来 研究肠 道微 生物菌群 。 Ｐ Ｃ Ｒ — Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ 技术 可 直 接从 样 品 中提取 核 酸 片段 对 微
添加 １ ％的犊牛 预混 料 ， 营养 成分 见表 １ 。 １ ． １ ＿ ３ 饲养管理 本 试 验 在 中 国农 业 大 学 肉牛 教 学实 习基 地进 行 ， 试验 期 为２ ０ １ ０ 年８ 月５日至 ２ ０ １ １ 年１ 月５日， 共５ 个月 ， 所 有犊 牛 前一 个 月饲 喂鲜奶 ， 一个
ERIC_PCR的研究进展
［7］［8］［9］［10］［11］［12］［13］［14］［15］［16］［17］［18］［19］［20］［21］［22］［23］［24］［25］［26］［27］IWAHANA H ，YOSHI MOTO K ，MIZUSAWA N ，et al ．Multi -ple fluorescence -based PCR -SSCP analysis ［J ］.Biotech -niques ，1994，16（2）：296，300．SOMMER S S ，YAN J ，LI W ，et al ．Candidate gene analyses by scanning or brute force fluorescent sequencing ，a comparison of DOVAM-S with gel-based and capillary-based sequenc -ing ［J ］.Genet Test ，2007，11（3）：235-240．MARUYA E ，SAJI H ，YOKOYAMA S ．PCR-LIS-SSCP （Low ionic strength single -stranded conformation polymorphism ）--a simple method for high-resolution allele typing of HLA-DRB1，-DQB1，and-DPB1［J ］.Genome Res ，1996，6（1）：51-57．BRINKMANN N ，MARTENS R ，TEBBE C C ，et al ．Origin and diversity of metabolically active gut bacteria from labora -tory-bred larvae of Manduca sexta ［J ］.Appl Environ Microbi -ol ，2008，74（23）：7189-7196．SUNNUCKS P ，WILSON A C C ，BEHEREGARAY L B ，et al ．SSCP is not so difficult ：the application and utility of sin -gle-stranded conformation polymorphism in evolutionary bi -ology and molecular ecology ［J ］.Molecular Ecology ，2000，9：1699-1710．李玉梅，姚纪元，吴静，等．PCR-SSCP 技术的研究及应用进展［J ］.生物技术通报，2007（6）：71-74.方美英，姜志华，刘红林，等．应用PCR-SSCPs 、PCR-RFLPs 技术检测猪氟烷基因［J ］.养猪，1997（1）：29．丁家桐，姜勋平，朱猛进，等．母猪FSH β基因对仔猪哺乳期生长影响的研究［J ］.扬州大学学报：自然科学版，1999，2（4）：38-40．李绍华，李爱云，熊远著，等．猪MSTN 基因多态性及其SNPs 的研究［J ］.遗传学报，2002，29（4）：326-331．李婧，杨润清，孟和，等．ESR 与PRLR 基因对民猪产仔数的影响［J ］.黑龙江畜牧兽医，2003（4）：11-17．陈桂芳，谢庄，强巴央宗，等．西藏牦牛、荷斯坦牛三个功能基因部分序列多态性的比较研究［J ］.畜牧兽医学报，2003，34（2）：128-131．王启贵，李宁，邓学梅，等．鸡细胞外脂肪酸结合蛋白基因单核苷酸多态性与腹脂性状的相关研究［J ］.中国科学C 辑：生命科学，2001，31（3）：266-270．王岩，沈锡权，吴祖芳，等．PCR-SSCP 技术在微生物群落多态性分析中的应用进展［J ］.生物技术，2009，19（3）：84-87．任南琪，赵阳国，王爱杰，等．PCR-SSCP 技术分析碱度影响下硫酸盐还原反应器中微生物群落动态［J ］.中国科学C 辑：生命科学，2006，36（1）：51-58．CALLON C ，DELB 魬S C ，DUTHOIT F ，et al ．Application ofSSCP -PCR fingerprinting to profile the yeast community in raw milk Salers cheeses ［J ］.Systematic and Applied Microbi -ology ，2006，29（2）：172-180．OPELT K ，CHOBOT V ，HADACEK F ，et al ．Investigations of the structure and function of bacterial communities associ -ated with Sphagnum mosses ［J ］.Environmental Microbiology ，2007，9（11）：2795-2809．SHINTANI S ，NAKAHARA Y ，MIHARA M ，et al ．Inactivation of the p 14ARF ，p 15INK4B and p 16INK4A genes is a frequent event in human oral squamous cell carcinomas ［J ］.Oral Oncology ，2001，37（6）：498-504．丁建松，曹毅，童建．PCR-SSCP 研究进展［J ］.辐射防护通讯，2004，24（5）：27-31．USHIJIMA T ，HOSOYA Y ，SUZUKI T ，et al ．A rapid methodfor detection of mutations in the lacⅠgene using PCR-single strand conformation polymorphism analysis ：demonstration of its high sensitivity ［J ］.Mutat Res ，1995，334（2）：283-292．李鸿浩，任有蛇，岳文斌．PCR-SSCP 研究进展及其在羊经济性状研究中的应用［J ］.草食家畜，2006（1）：20-22．陈强，陈云贵，王根林．HSP 70基因PCR-SSCP 实验条件的优化［J ］.畜牧与兽医，2008，40（2）：66-67．□ERIC-PCR 的研究进展刘博婷（韶关学院生物科学系，广东韶关512005）摘要：肠道细菌基因间重复序列（enterobacterial repetitive intergenic consensus,ERIC ）是主要存在于肠道细菌的一类基因间重复序列。
【国家自然科学基金】_结构多样性_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140730
科研热词 群落结构 多样性 遗传多样性 物种多样性 生物多样性 群落特征 浮游植物 景观格局 微卫星标记 pcr-dgge 长江口 细菌多样性 种群结构 水质评价 遗传结构 群体遗传结构 生物量 微卫星 多样性指数 变性梯度凝胶电泳 rapd 遗传多态性 群落 细菌 生境破碎化 水稻土 植被恢复 植物群落 植物多样性 新疆野苹果 微生物群落结构 基因表达 地上生物量 土壤纤毛虫c-pcr dgge 16s rdna 黄土丘陵区 鸭瘟病毒感染鸭 零价铁 重要值 遗传算法 遗传分化 调控
107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160
科研热词 推荐指数 遗传多样性 27 群落结构 18 物种多样性 17 微卫星 9 群落特征 8 生物多样性 8 景观格局 8 遗传结构 7 多样性 7 遗传分化 5 线粒体dna 4 种群结构 4 植物多样性 4 景观指数 4 常绿阔叶林 4 多样性指数 4 城市绿地 4 功能群 4 云南 4 pcr-dgge 4 高寒草甸 3 香溪河 3 群落演替 3 群落多样性 3 群落 3 群体遗传结构 3 结构 3 细菌多样性 3 生产力 3 物种组成 3 湿地 3 浮游植物 3 活性污泥 3 植被恢复 3 植物群落 3 微生物群落 3 微生物多样性 3 微卫星标记 3 微卫星dna 3 大型底栖动物 3 基因流 3 土壤纤毛虫 3 土壤养分 3 土地整理 3 土地利用 3 变性梯度凝胶电泳(dgge) 3 功能多样性 3 rapd 3 quickbird影像 3 issr 3 biolog 3 aflp 3
益生菌饮料实验报告总结(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在探究益生菌饮料对肠道菌群的影响，评估其促进肠道蠕动、改善免疫、通便、美容等功效，并探讨其最佳服用时间。
二、实验材料1. 实验对象：20名志愿者，年龄在20-45岁之间，身体健康，无肠道疾病史。
2. 实验产品：某品牌益生菌饮料，每100ml含益生菌数量达到10^8个。
3. 实验设备：益生菌培养箱、电子天平、pH计、酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒等。
三、实验方法1. 将20名志愿者随机分为两组，每组10人，分别命名为实验组与对照组。
2. 实验组志愿者每日服用益生菌饮料100ml，对照组志愿者服用等量纯净水。
3. 在实验开始前、实验过程中及实验结束后，对志愿者进行以下指标检测：（1）肠道菌群：通过粪便培养、显微镜观察等方法，分析肠道菌群数量和种类变化。
（2）肠道蠕动：采用腹部B超检测志愿者肠道蠕动情况。
（3）免疫功能：检测志愿者血清中免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）等指标。
（4）粪便性状：观察志愿者粪便颜色、形状、气味等变化。
4. 实验组与对照组在实验过程中及实验结束后，均进行饮食、运动等方面的干预，以确保实验结果的准确性。
四、实验结果1. 肠道菌群：实验组志愿者在服用益生菌饮料后，肠道有益菌数量明显增加，有害菌数量减少，肠道菌群平衡得到改善。
2. 肠道蠕动：实验组志愿者肠道蠕动频率较对照组明显增加，说明益生菌饮料具有促进肠道蠕动的作用。
3. 免疫功能：实验组志愿者血清中IgA、IgG等免疫指标较对照组明显升高，说明益生菌饮料具有提高免疫力的作用。
4. 粪便性状：实验组志愿者粪便颜色、形状、气味等较对照组明显改善，说明益生菌饮料具有改善便秘、美容等作用。
5. 最佳服用时间：根据实验结果，益生菌饮料在饭后1小时内服用效果最佳，此时胃酸浓度较低，有利于益生菌的存活。
五、实验结论1. 益生菌饮料对肠道菌群有显著的调节作用，能够改善肠道菌群平衡，促进肠道蠕动，提高免疫力。
感染草鱼呼肠孤病毒对肠道菌群多样性的影响
doi: 10.7541/2019.014感染草鱼呼肠孤病毒对肠道菌群多样性的影响朱文根1, 2李星浩1饶刘瑜1黄洁1余育和1肖凡书3颜庆云3(1. 中国科学院水生生物研究所中国科学院水生生物多样性与保护重点实验室, 武汉 430072; 2. 中国科学院大学, 北京100049; 3. 中山大学环境科学与工程学院, 环境微生物组学研究中心, 广州 510006)摘要: 为揭示草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus, GCRV)对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肠道菌群的影响,在通过人工浸泡方式感染GCRV后, 采用针对16S rRNA基因的高通量测序技术对草鱼肠道菌群的组成和多样性进行了研究。
结果显示, 感染组与对照组差异显著(MRPP, Anosim, Adonis, P<0.01), 且感染组肠道菌群的Alpha多样性指数(Shannon-Wienner、Inverse Simpson、Pielou evenness)显著低于对照组(t-test, P<0.05)。
此外, 肠道菌群在感染组个体间差异显著大于对照组(Wilcoxon test, P<0.05), 表明患病草鱼肠道菌群失去原有平衡而变得紊乱。
尽管病毒感染组和对照组草鱼肠道优势菌门均为Proteobacteria、Firmicutes、Bacte-roidetes、Fusobacteria, 但在OTU水平仍表现出明显的变化, 如OTU_69(Pasteurellaceae)、OTU_504(Comam-onadaceae)和OTU_1898(Cetobacterium)在感染GCRV组丰度显著降低(t-test, P<0.05), 也表明GCRV感染可使草鱼肠道微生态发生紊乱。
肠道菌群结构稳定对于宿主健康具有重要意义, 研究患病鱼肠道菌群状况为鱼类常见疾病的防控提供科学依据, 也为健康养殖提供参考。
刺参肠道及养殖池塘菌群组成的PCR-DGGE指纹图谱分析
16S rRNA和COI基因序列对长江口虾虎鱼科鱼类种类鉴定和系统分类的对比研究
16S rRNA和COI基因序列对长江口虾虎鱼科鱼类种类鉴定和系统分类的对比研究宋超;吕杨;赵峰;侯俊利;杨刚;庄平【期刊名称】《水产研究》【年(卷),期】2016(003)004【摘要】为了对比线粒体16S rRNA和COI基因片段在长江口虾虎鱼科鱼类种类鉴定和系统分类研究中的适用性,本文运用PCR技术,扩增了虾虎鱼科7属8种24个个体的线粒体16S rRNA和COI基因片段,并对其种间的序列差异进行比较分析。
经比对后得到16S rRNA基因长度为535bp的序列,共编码178个氨基酸,24条16S rRNA序列共有12个单倍型,共检测到变异位点161个,约占总位点数的30.1%,插入/缺失位点15个,转换与颠换比值(Si/Sv)为1.51;同时,获得COI基因长度641 bp,共编码213个氨基酸,单倍型个数与16S rRNA序列相同,变异位点221个,所占百分比高于16S rRNA序列(约34.5%),无插入/缺失位点,转换/颠换值为1.29。
两种基因的转换/颠换值均小于2,因此对其做了相应的突变饱和性分析,结果显示,两种基因在虾虎鱼科鱼类中不存在突变饱和现象。
遗传距离结果显示,16S rRNA基因种间序列变异程度均小于COI基因,16S rRNA基因的种内和种间平均遗传距离分别为0.002和0.169,种间约为种内遗传距离的84倍,种间遗传距离最小值存在于纹缟虾虎鱼和髭缟虾虎鱼之间为0.100;而COI序列的种内和种间平均遗传距离分别0.001和0.215,种间为种内遗传距离的215倍。
因此,16S rRNA和COI序列均适用于虾虎鱼科的种类鉴定。
基于16S rRNA和COI基因序列获得的UPGMA系统树显示虾虎鱼科鱼类均可形成单系群,不同之处在于16S rRNA基因序列主要表现种、属间序列差异,而COI则突出表现种、属、科间序列差异。
因此,在应用这两种基因片段做系统分类研究时,应根据研究的不同系统水平选择适当的分子标记。
【国家自然科学基金】_菌群多样性_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140730
推荐指数 4 4 3 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2010年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52
热带森林 1 53 烃降解菌 1 54 温度 1 55 淡水鱼 1 56 消化道内含物 1 57 海洋细菌 1 58 海水养殖环境 1 59 活性污泥 1 60 氯仿处理 1 61 毛葱 1 62 植物根际促生菌 1 63 根围土壤微生物 1 64 无性型真菌 1 65 提取 1 66 微生物群落多样性 1 67 微生物群落 1 68 微生物多样性 1 69 形态鉴定 1 70 实验研究 1 71 定向富集 1 72 宏基因组dna 1 73 套作 1 74 多样性研究 1 75 土壤细菌群落结构多样性 1 76 嗜盐菌 1 77 周边地区 1 78 叶际细菌群落 1 79 可培养细菌 1 80 可培养技术 1 81 口腔菌群 1 82 厌氧产氢 1 83 印度洋 1 84 北京市 1 85 刺参(apostichopus japonicus liao) 1 86 刺参 1 87 分子鉴定 1 88 传统发酵乳 1 89 人参 1 90 产氢菌 1 91 云南乳扇 1 92 乳杆菌 1 93 乌梁素海 1 94 中华鳖 1 95 上呼吸道菌群 1 96 terminal restriction fragment 1 length polymorphism) 97 t-rflp(末端限制性片段长度多态性 1 98 rna 1 99 rflp分析 1 100 plfa 1 101 pcr/dgge 1 102 pcr-rflp 1 103 pcr 1 104 its-pcr 1 105 dna提取方法 1 106
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© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net【收稿日期】2006209217
【作者简介】李可俊(19732),博士生,从事微生物分子生态学研究;赵立平,通讯作者,Email:lpzhao@sjtu.edu.en
文章编号:10052376X(2007)0320267203
【论 著】
PCR2DGGE对长江河口八种野生鱼类肠道菌群多样性的比较研究
李可俊1,管卫兵2,徐晋麟3,张延1,赵立平1(1.上海交通大学生命科学技术学院分子生态及生态基因组学实验室,上海 200240;2.上海水产大学海洋科
学与技术学院,上海 200090;3.上海交通大学生命科学技术学院,上海 200240
)
【摘要】 目的 分析长江河口捕获的8种野生鱼类的肠道菌群多样性的差异并观察这种差异与食性的联系。方法 采用PCR2DGGE(denaturinggradientgelelectrophoresis)技术,DGGE图谱用PCA(principalcomponentanaly2sis)方法进行分析。结果 建立了长江口8种鱼野生条件下肠道菌群的DGGE指纹图谱,观察到它们在野生条件下的肠道菌群的差异。其中,营底栖生活的舌鰕虎鱼的肠道菌群和其他7种野生鱼有着明显的差异,其他7种鱼的肠道菌群多样性的差异与它们的食性差异相关。结论 PCR2DGGE技术是一种能够快速有效地分析研究鱼类肠道菌群结构的技术。8种野生鱼的肠道菌群的结构有明显的差别,并且食性差异大的鱼类之间肠道菌群差异也更为明显。【关键词】 鱼类;肠道菌群;PCR2DGGE;16SrRNA
【中图分类号】R378 【文献标识码】A
PCR2DGGEanalysisofbacterialdiversityoftheintestinalsystemineightkindsof2
wildfishesfromtheChangjiangriverestuaryLIKe2jun1,GUANWei2bing,XUJin2lin,ZHANGYan,ZHAOLi2ping(1.SchoolofLifeScienceandBiotechnology,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200240,China)【Abstract】 Objective Toinvestigatethediversitiesofintestinalbacteriaineightkindsoffishesfromthe
Changjiangriverestuary.Methods PCR2DGGE(denaturinggradientgelelectrophoresis)andPCA(principalcom2ponentanalysis)wereused.Results Itwasprovedthattherewereabundantandvariousbacteriainthegutsofeightkindsoffi2shes.Thebacterialcommunitystructuresinthegutsofthesefisheswereobviouslydifferent.Conclusions PCR2DGGEa2nalysisof16SrRNAgenewereprovedtobeapowerfultoolforgainingdetailedinsightintothebacterialdiversityofthein2testinalsysteminfish.Thecorrelationbetweentheintestinalbacteriainfishandfeedwereobvious.【Keywords】 Fish;Intestinalbacteria;PCR2DGGE;16SrRNA
长江河口是一个非常有研究价值的生态环境,对这个环境中生活的各种野生鱼类肠道菌群多样性的比较研究有助于加深对这些鱼类的生态学认识,并且为提高相应鱼种的养殖技术提供参考。提取样品中微生物的总DNA,进行16SrRNA基因的PCR扩增及后续的分子分析(例如denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)已经被证明是研究复合菌群结构的一种有效的研究手段,并被广泛应用于各种生物的肠道菌群和环境复合菌群结构的研究[1～6]。采用DGGE技术研究鱼类及其他水生生物的肠道菌群的研究结果也有报道,例如对虹鳟[7]、对虾[8]的肠道菌群的研究。本研究采用PCR2DGGE分析技术对长江河口捕获的8种野生鱼类(见表1)的肠道菌群的组成进行了研究,建立了它们的DGGE指纹图谱并分析了它们之间的相似性,为研究鱼类肠道菌群和食性的关系、从体内优势菌种群方面对鱼类健康进行评价等工作奠定技术基础。1 材料与方法1.1 实验材料 8种野生鱼(表1)的肠道样品均采集于长江口,置于-70℃冰箱保存备用。1.2 肠道细菌总DNA的提取 使用无菌的牙签将肠道划开,剥取里面的肠道内容物。每种鱼收集5个个体的肠道内容物,混合后作为这种鱼的代表样品。采用QIAamPRDNAstoolMiniKit试剂盒提取样品的总DNA。总DNA溶解于100μl超纯水中。1.3 PCR2DGGE分析 采用引物P2(5’2ATTAC2CGCGGCTGCTGG23’)和P3(5’2GCclamp2CCTACGG2GAGGCAGCAG23’)扩增16SrRNA基因的V3区[9]。25μl反应体系包括2.5μl的10×Buffer,2μl的25mmol/LdNTP混合物,1UTaqDNA聚合酶(TaKaRa,Japan),每种引物25pmol,1μl总DNA。PCR反应程序如下:94℃变性4min进入30个循环,循环为94
℃45s;55℃,45s;72℃1min。最后是10min延伸。然后进行“ReconditioningPCR”[10]。2次PCR
中均采用超纯水作为阴性对照保证PCR过程中没有污染。PCR产物经过琼脂糖电泳检查后,使用Hoef2erRDyNAQuantR200system确定DNA浓度。DGGE指纹图谱的构建采用Bio2RadDCodeTM
mutationdetectionsystem进行。丙烯酰胺凝胶浓度为8%,变性梯度为25%～55%(100%变性剂为7mol/L尿素和40%去离子甲酰胺),PCR产物的上样量为每个泳道约300ng。在200V、60℃条件下电泳160min。电泳后凝胶使用10000倍稀释的SYBR2GreenI进行染色。最后使用UVI2photo照相系统进行紫外照相。1.4 PCA分析 使用ImageJ软件对DGGE胶图进行采点计算,每个泳道采点251个;然后使用Madab
软件进行PCA分析(principalcomponentanalysis)。2 结果2.1 DGGE指纹图谱建立与肠道细菌组成分析 图1显示了8种野生鱼肠道菌群DGGE指纹图谱,每一条泳道代表1种野生鱼的肠道菌群DGGE指纹图谱。因为每条泳道代表的是1种鱼5个个体的混合样品,
所以它反映的是这种鱼肠道菌群的平均状态。不同位置的条带代表不同的细菌,亮度反映出细菌相对量的多少。图1中从不同泳道的条带数量、位置和亮度的差异表明8种野生鱼的肠道菌群的结构组成是不
862ChineseJournalofMicroecology,June2007,Vol119No13© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
一样的,反映了这些鱼的肠道细菌的结构存在明显的多样性差异,同时各种鱼也呈现不同的优势菌条带。图1中条带a～h是8种野生鱼肠道菌群DGGE指纹图谱的主带,代表了各种野生鱼肠道菌群中的优势细菌。但是,条带c、i、,j、f、g虽然处于相似的位置,但并不能认为这些条带所代表的就一定是同样的细菌。这些细菌的分类地位必须采用割胶回收、克隆后用DGGE确认再测序的方法才能确定。因为本研究主要是研究这些野生鱼肠道菌群的多样性的比较,所以没有对单个条带所代表的细菌进行进一步研究。
表1 在长江河口捕获的8种野生鱼类样样品编号中文名 拉丁名 食性 1黄颡鱼Pseudobagrusfulvidraco肉食性为主的杂食性鱼类2牙鲆Paralichthysolivaceus肉食性鱼类,成鱼多以小型鱼类为食3翘嘴红鲌Erythroculterilishaeformes肉食性鱼类,大个体成鱼以鱼类为主要食物4高体鳑鱼皮Rhodeusocellatus以浮游动物为主,同时摄食藻类5棒花鱼Abbottinarivularis以水生昆虫及幼虫、软体动物为主6麦穗鱼Pseudorasboraparva以浮游动物为主要食物,同时摄食大量的藻类7三角鲂Megalobramaterminalis以水生植物为主,同时摄食藻类、水生昆虫8舌鰕虎鱼Glossogobiusgiuris以甲壳类、底栖生物和水生昆虫为主
图1 8种野生鱼类肠道菌群的DGGE图谱图2 8种野生鱼类肠道菌群的DGGE图谱的PCA分析结果
2.2 PCA分析 DGGE图谱的PCA分析结果如图2所示。每个符号代表1种野生鱼的肠道菌群,彼此之间的距离代表了它们的差异大小。如图2,样品8(舌鰕虎鱼)的肠道菌群和其他7种野生鱼有着比较大的差异。而这7种鱼虽然在PC1轴上差异不明显,但是在PC2轴上可以分离开来,其中样品1(黄颡鱼)、样品2(牙鲆)和样品3(翘嘴红鲌)所代表的3种鱼以及样品7(三角鲂)作为两个方向和剩下的3种鱼差别相对明显。而样品1、2和3代表的3种野生鱼都是以捕食小型鱼类的肉食食性为主,样品7代表的三角鲂是以水生植物为主要食物。其他3种鱼的食性都是以水生昆虫或浮游动物为主。另外,样品8所代表的舌鰕虎鱼是以甲壳类、底栖动物和水生昆虫为主,在PC2轴上,和以浮游动物和水生昆虫为主要食物的3种鱼处于一个位置,但在PC1轴上与其他7种鱼差别明显,这一差别可能和舌鰕虎鱼常用胸鳍挖掘与翻搅水底泥沙,寻找底栖无脊椎动物吞食的底栖摄食特点有关。DGGE图谱的PCA分析表明,这8种野生鱼类的肠道菌群组成和它们的食性有着明显的相关关系。3 讨论已有多篇研究报道鱼类肠道菌群的组成和食物有着密切的关系。尹军霞等用细菌培养和计数的方法对乌鳢、鲢鱼、鳊鱼、鲫鱼4种不同食性鱼的后肠菌群进行了分析后,认为后肠内容物中的细菌总数、后肠内容物和后肠壁中的双歧杆菌数都与食性相关[11]。曹志华等用稀释平板计数法对摄食含尿素饲料和对照饲料的健康鲤鱼肠道内菌群进行了分析,证明摄食含尿素饲料的实验组能利用尿素的细菌占细菌总数的比例比对照组高了30%[12]。周文豪等对摄食不同饵料对草鱼肠道菌群的影响进行研究,证明饵料中的菌群在摄食后48小时内可以影响草鱼的肠道中的菌群的数量及组成[13]。但是培养的方法具有高度的选择性,所以大部分采用培养方法的研究报道主要集中于某几类细菌的数量变化上。采用DGGE技术,16SrRNA基因克隆文库技术,