人脐带间充质干细胞分离培养条件的优化及其生物学特性
人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定
人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定韩华;薛改;张俊勤;闫萍;李艳丽【摘要】目的：探讨人脐带华通胶间充质干细胞体外分离、培养、鉴定及冻存、复苏的方法。
方法收集健康足月新生儿脐带组织，采用组织块贴壁法分离、培养脐带间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞表面抗原，将细胞冻存3个月后复苏，鉴定复苏后细胞的特性。
结果组织块贴壁法获得脐带间充质干细胞成功率高；细胞表面高表达CD29、CD44、CD90和CD105，不表达造血干细胞表型CD34、CD45等；冻存后再复苏细胞活性高达80％～90％。
结论组织块贴壁法可以从人脐带华通胶中较好的分离、培养出间充质干细胞，为干细胞移植实验研究和临床治疗提供了理想的细胞来源。
%Objective To exploreisolating,culturing,identifying,freezing and thawing mesenchymal stem cells(MSCs)approach from Wharton j elly of human umbilical cord.Methods The MSCs were isolated from neonate umbilical cord,cultured by tissue explants adherent method.The surface markers were identified by flow cytometry.Passage cells,frozen 6 months, were thawed,then their biological characteristics were identified.Results MSCs were easily obtained from Wharton j elly of human umbilical cord via the proposed approach of tissue adherence.The flow cytometry analysis showed that MSCs expressed CD29,CD44,CD90 and CD105 positively,but negatively for CD34,CD45.The living cells of MSCs were 80%-90% after having been frozen and the thawed cells had the same characteristics as the previous.Conclusion MSCs can be successfully isolated from Wharton j elly of human umbilical cord by this method. The stem cells derived from Wharton j elly of humanumbilical cord may be a novel alternative source of human MSCs for experimental and clinical applications.【期刊名称】《河北医科大学学报》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】3页(P21-23)【关键词】脐带;间充质干细胞;胎血【作者】韩华;薛改;张俊勤;闫萍;李艳丽【作者单位】河北省人民医院妇产科，河北石家庄 050051;中国人民解放军白求恩国际和平医院药剂科，河北石家庄 050082;河北省人民医院妇产科，河北石家庄 050051;河北省人民医院妇产科，河北石家庄 050051;中国人民解放军第二六○医院病理科，河北石家庄 050041【正文语种】中文【中图分类】R394.2干细胞是一群具有自我更新和分化潜能的细胞，根据发育状态可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。
(完整)胎盘间充质干细胞的分离和培养 2016.07.21
胎盘间充质干细胞的分离，原代与继代培养及鉴定刘亭2016.7。
21目录前言 (2)1分离制备PMSC组织的选取 (4)2脐带，胎盘MSC的分离与纯化 (6)2.1胎盘组织的获取，存储与清洗 (6)2-2 脐带，胎盘MSC的分离及纯化方法 (7)3 原代培养和继代培养 (11)3—1培养基 (11)3-2培养密度 (12)3-3培养条件 (13)3—4换液 (13)3—5 传代培养 (13)3—6细胞形态与生长速度 (14)3—7 MSC的冻存与复苏： (14)4细胞表面抗原检测 (14)5生长曲线 (15)6细胞周期 (15)7分化潜能 (15)参考文献 (15)附件1不同实验室从脐带血,脐带和胎盘等各组织中分离MSC的方法.. 16脐带血 (16)脐带 (17)羊膜 (19)绒毛膜 (19)蜕膜层 (20)胎盘 (21)整体灌注法 (22)附件2 背景知识 (22)附件3 PMSC实验所需试剂 (23)前言干细胞（Stem cell，SC）是一种能够自我更新且未分化并可分化成两个或两个以上其它品系的细胞。
在一定的条件下，干细胞能够分化成为多种成熟细胞类型。
按照来源和分化潜能不同，干细胞可分为胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）和成体干细胞(Adult stem cell，ASC）两类。
胚胎干细胞来源于早期的胚泡和胚胎内层的细胞群，并且具有向3个胚层细胞分化的能力.但是胚胎干细胞应用时产生的免疫排斥、体内实验中引发肿瘤生成以及所涉及的伦理问题等影响并制约了临床应用。
成体干细胞形成于原肠胚形成后的胎儿和成体组织,早期研究认为，成体干细胞主要分化为其来源组织的细胞类型。
然而，近几年来的很多研究表明，成体干细胞具有能够分化成为除来源以外的其他胚层组织的能力。
间充质干细胞(Mesenchymal stem cell， MSC）又称为基质干细胞，是属于成体干细胞的一种，最早从骨髓中分离而来。
临床研究用人间充质干细胞质量评价
临床研究用人间充质干细胞质量评价一、引言人间充质干细胞（MSCs）由于其多向分化潜能、免疫调节特性以及易于体外培养等特点，被广泛用于临床研究。
在众多疾病的治疗中，MSCs 都展现出了巨大的潜力。
然而，要确保其在临床研究中的有效性，首先需要对MSCs的质量进行严格控制和评价。
本文将探讨如何评价临床研究用MSCs的质量。
二、MSCs的质量评价标准1、细胞的纯度和活性：这是MSCs质量评价的核心指标。
纯度是指MSCs中目标细胞的比例，而活性则是指MSCs的增殖能力和分化能力。
2、细胞的遗传稳定性：通过基因测序等方法，可以检测MSCs是否存在基因突变，以及是否存在潜在的致癌风险。
3、细胞的免疫调节特性：MSCs具有免疫调节特性，可以通过抑制免疫反应来降低排斥反应的风险。
因此，评价MSCs的免疫调节特性也是非常重要的。
4、细胞的来源和生产过程：MSCs的来源和生产过程也会对其质量产生影响。
例如，来自患者的自身MSCs可能比来自捐献者的MSCs更适合用于治疗。
同时，生产过程中的质量控制，如无菌操作、细胞培养基的质量等，也会影响MSCs的质量。
三、MSCs质量评价的方法1、细胞形态观察：通过观察MSCs的形态，可以初步判断其是否具有正常的形态学特征。
2、生长曲线测定：通过绘制MSCs的生长曲线，可以评估其增殖能力。
3、细胞表面标志物检测：通过检测细胞表面标志物，可以确定MSCs 的纯度和活性。
4、染色体核型分析：通过染色体核型分析，可以评估MSCs的遗传稳定性。
5、免疫调节特性检测：通过检测MSCs对免疫反应的调节作用，可以评估其免疫调节特性。
6、生产过程质量控制：通过监控生产过程中的关键控制点，可以确保MSCs的生产过程符合质量标准。
四、结论人间充质干细胞（MSCs）在临床研究中的应用前景广阔，但其质量评价是关键环节。
通过对MSCs的纯度、活性、遗传稳定性、免疫调节特性以及生产过程的质量控制等多方面的评价，可以确保其满足临床研究的需求。
脐带来源的华通氏胶间充质干细胞的分离、特性及应用前景
233CARCINO GENESIS ，TERATO GENESIS &MUTA GENESIS脐带来源的华通氏胶间充质干细胞的分离、特性及应用前景丁赛，张红霞，朱海英*(海军军医大学基础医学院细胞生物学教研室，上海200433)收稿日期：2021-11-21；修订日期：2022-05-13基金项目：国家自然科学基金(32171387)作者信息：丁赛，E-mail ：。
*通信作者，朱海英，E-mail ：【摘要】间充质干细胞(MSCs)的来源非常广泛。
虽然各种组织来源的MSCs 生物学特性不尽相同，但在标准培养条件下该类细胞均可以贴壁生长；细胞群体中有95%以上的细胞表达典型的间充质标记分子，如CD73、CD90和CD105，但缺乏造血标记分子CD14、CD19、CD34、CD45和CD79a 的表达；特别是均具有分化为成脂细胞、成骨细胞和成软骨细胞的能力。
这些性质是国际细胞治疗协会给出的定义该类细胞的最低标准。
脐带间充质干细胞是指来源于新生儿脐带组织中的多能干细胞。
目前来看，从脐带不同解剖学部位(区室)获得的MSCs 的生物学性质也存在差异，其中从脐带华通氏胶中分离获得的华通氏胶间充质干细胞，在增殖能力、分化潜能、免疫调节能力等方面均明显优于其他区室来源的间充质干细胞，是用于组织器官损伤修复及免疫调节的一种理想的“种子”细胞，被认为具有更好的临床应用前景。
本文围绕近年来华通氏胶间充质干细胞的分离建系、增殖特性、分化潜能以及临床应用方面的研究进展进行了综述，其中重点介绍了化学诱导分化方案的建立和优化，认为与通过遗传改变诱导重编程方法相比，化学诱导分化方法具有更好的临床应用潜力。
【关键词】脐带；华通氏胶；间充质干细胞；分化潜能；分离；增殖特性中图分类号：R329.2+8文献标志码：A文章编号：1004-616X(2022)03-0233-04doi ：10.3969/j.issn.1004-616x.2022.03.011间充质干细胞最早在骨髓中被发现和鉴定，随后在人体胚胎及成体的多种组织中被陆续鉴定出来，这些组织主要包括成体骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带和脐带血等。
人脐带间充质干细胞的体外免疫调节特性
人脐带间充质干细胞的体外免疫调节特性刘梦婷; 饶巍; 韩兵; 肖翠红; 武栋成【期刊名称】《《中国组织工程研究》》【年(卷),期】2020(024)007【总页数】6页(P1063-1068)【关键词】人脐带间充质干细胞; 免疫调节; 免疫抑制; 炎症抑制; 淋巴细胞增殖; 淋巴细胞亚群【作者】刘梦婷; 饶巍; 韩兵; 肖翠红; 武栋成【作者单位】武汉汉密顿生物科技股份有限公司研发中心湖北省武汉市 430075; 武汉大学基础医学院湖北省武汉市 430071【正文语种】中文【中图分类】R459.9; R394.2; R5930 引言 Introduction间充质干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，是目前临床应用研究较多的一类干细胞[1-2]。
间充质干细胞通过多向分化与旁分泌作用发挥组织再生与损伤保护作用，而间充质干细胞独特的免疫调节功能也是其临床应用的基础之一。
既往的研究显示，间充质干细胞对自然杀伤细胞、树突状细胞以及B、T淋巴细胞等多种免疫细胞的活化、增殖与分化均有调节作用，并能提高调节性T(T regulatory，Treg)细胞的比例，维持体内免疫环境的稳定[3-4]。
间充质干细胞的免疫调节特性已被应用于急性移植物抗宿主病[5-6]、系统性红斑狼疮[7-8]、1型糖尿病[9-10]、类风湿性关节炎[11-12]、炎症性肠病等免疫异常和炎症相关疾病的临床研究[13-14]，初步结果显示了一定的有效性，但其最终治疗效果尚待进一步的研究确定。
此外，间充质干细胞通过何种途径发挥免疫调节作用尚存在不同的研究结果与解释，倾向性意见是通过细胞接触和/或分泌多种调节因子，如转化生长因子β、肝细胞生长因子、前列腺素E2、白细胞介素10、一氧化氮、吲哚胺2，3双加氧酶发挥调节作用[15]。
与其他组织(如骨髓、脂肪)来源的间充质干细胞相比较，人脐带间充质干细胞的免疫原性更低、扩增速率更快、分化潜能更强；尤其是人脐带间充质干细胞取材容易，无道德伦理争议，能够大量产业化扩增存储而被广泛关注[16]。
人脐带间.充质干细胞最适宜培养条件研究
Ｄｅ ｐａ ｒ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｈｕ ｍａ ｎ Ｍｏ ｒ ｐ ｈ ｐ １ ０ ｇ ｙ， Ｎｉ ｎ ｇ ｂ ｏ Ｃｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｈｅ ａ ｌ ｔ ｈ Ｓ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ， Ｎｉ ｎ ｇ ｂ ｏ ３ １ ５１ ０ ４
表面表达 Ｍ Ｓ Ｃ ｓ 相关抗原 Ｃ Ｄ ２ ９ ，但不表达造血细胞相关抗原 Ｃ Ｄ ３ ４ ，表明此种 自脐带 中分离得到并诱 导扩增的成纤 维样细胞 为间充 质干细 胞。结论 ：优化 Ｕ Ｃ Ｍ Ｓ Ｃ ｓ 的培养条件 ，成功地建立稳定 的培养方法 ，可 提高 Ｕ Ｃ Ｍ Ｓ Ｃ ｓ 培养成功率 ，为 Ｕ Ｃ Ｍ Ｓ Ｃ ｓ 的实 验研究 和ｌ 床应用 打下
学 术 探 讨
Ａｃ ａ ｄ ｅ ｍｉ ｃ ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ
中 国 民 族 民 间 医 药
Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ ｊ ｏ ｕ ｍａ ｌ ｏ ｆ ｅ ｔ ｈ ｎ ｏ ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ ａ ｎ ｄ ｅ ｔ ｈ ｎ ｏ ｐ ｈ ａ ｒ ｍ ａ ｃ ｙ ・３ １・
胎儿脐带 ６份 ，分离培养 Ｕ Ｃ ＭＳ Ｃ ｓ ，观察 比较不 同的新鲜程度 、不同分离方法在相同的培养条件下对 Ｕ Ｃ ＭＳ Ｃ ｓ 培养的影响 ，并 对优化条件下 培养的 Ｕ Ｃ ＭＳ Ｃ ｓ 进行扩增 ，评估其贴壁 细胞形成集落数 。对 培养得 到的细胞进行 表面抗原标 志检测及其鉴定 。结果 ：从足月胎儿 新鲜脐带 中采用组织块贴壁的方法 ，在 ５ ％血 清浓度 的 Ｉ ＭＤ Ｍ 培养 基 中，分离 培养 得到 的 Ｕ Ｃ ＭＳ Ｃ ｓ 成 功机 率最 高，且生成 集 落数 最多 为 （ ５ ． ３± ０ ． ２ ８ ） ×１ ０ ／ ０ ． ５ ｃ ｍ脐带组织 ，与双酶法 比较存在明显差异 （ Ｐ＜ ０ ． ０ ０ １ ） ；而胶原 酶法接 种后未见 明显贴壁细胞 。培养 得到 的 Ｕ Ｃ ＭＳ Ｃ ｓ 细胞
脐带间充质干细胞综述转
脐带间充质干细胞概述医学实验班70080103王雪彤脐带是胎儿时期连接母体与胎儿的索状结构，其外被羊膜，内含2条脐动华尔通氏脉、1条脐静脉，在动静脉之间含有特殊的胚胎粘液样结缔组织胶(WhartonpsJelly),从华尔通氏胶分离得到的基质细胞即为人脐带间充质干细胞(HUMSCs)。
1人脐带间充质干细胞(HUMSCs)的形貌分析：倒置显微镜下观察人脐带间充质干细胞贴壁生长，为形态相对均一的梭形细胞，呈平行排列生长或旋涡状生长，低密度时较扁平,密度增加趋于融合时细胞变细长。
扫描电镜下观察呈长条状纤维样，细胞膜表面不光滑，有小结节状物，细胞无明显突起，细胞间无网络状连接。
透射电镜观察核大，不规则，核仁明显，常染色质多，异染色质少，胞浆少。
胞质内细胞器较少，以粗面内质网和线粒体为主，内有大量游离核糖体，部分细胞可见内质网月中胀。
植块法培养获得的人脐带间充质干细胞(X200)例如三代细胞的形态学特征一一人体脐带间充质干细胞离体培养后，培养至第三代。
第三代人脐带间充质干细胞以均一长梭形的细胞为主，细胞周边有较多的丝状伪足，见图1,2;并形成毗邻细胞之间的网状连接，见图3;细胞核较大，核膜清晰，含两三个核仁，核质比较小，见图4。
2人脐带间充质干细胞(HUMSCs)的生物学特性：HUMSCs既非胚胎干细胞又非成体干细胞，是别于两者之间的一类新的多能问充质细胞，它们之间既有联系又有差异。
根据国际细胞疗法间充质与组织干细胞委员会(theMesenchymalandTissueStemCellCommitteeoftheInternation2alSocietyforCellul arTherapy)制定的最低标准,脐带间充质干细胞(MSCs)需满足以下条件：1)MSCs在标准培养条件下呈贴壁生长；2)MSCs表达CD105,CD73和CD90,不表达CD45,CD34,CD14或CD11b,CD79a或CD19和HLA2DR;3)MSCs在体外至少能向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化。
人脐带华通胶间充质干细胞的体外分离培养及鉴定
人脐带华通胶间充质干细胞的体外分离培养及鉴定目的：建立并优化人脐带间充质干细胞分离纯化方法，并对其表面标志与多向分化潜能进行鉴定。
方法：收集健康足月产胎儿脐带组织，采用组织块贴壁法进行原代培养，流式细胞仪对其表面标志进行检测，通过向成骨成脂分化对其多向分化潜能进行鉴定，RT-PCR对其干细胞特性基因Oct4、Nanog、Sox2、Nestin 进行检测。
结果：采用组织块贴壁法可在2周左右获得大量间充质干细胞，培养的细胞经流式细胞仪检测，高表达CD29、CD44、CD105、CD106，低表达CD34、CD45；经成骨成脂诱导2周后可分化为成骨细胞和成脂细胞，RT-PCR检测发现原代细胞表达Oct4、Nanog、Sox2、Nestin基因。
结论：人脐带间充质干细胞可在体外扩增培养，具有多向分化潜能，可作为组织工程种子细胞来源。
标签：人脐带间充质干细胞；原代培养；分离鉴定虽然胚胎干细胞具有全能性，可分化为各个胚层的细胞，但其来源还存在伦理和法律上的争议，且致瘤性目前还无法控制。
与胚胎干细胞相比，间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）则因具有多向分化潜能、易培养、扩增能力强、来源广等优势而被大量用于实验和临床研究。
在各种成人干细胞中，目前研究较多的是骨髓MSC，因其可以作为自体移植的干细胞来源。
但骨髓的获取属于侵入性检查，来源有限，且骨髓MSC的量、增殖效率、分化潜能有着明显的个体差异，会随着年龄的增加而显著减少，因此寻找新的干细胞来源成为当务之急。
研究發现，可以从多种组织如骨髓、脂肪组织、脐带血、胎盘等中分离得到MSC。
相比骨髓，脐带属于医用废弃物，具有较低的免疫原性，容易获得，相对纯净，不会给供者带来痛苦，致瘤性、病毒和细菌污染的可能性均较骨髓MSC 低。
此外，与骨髓MSC相比，人脐带MSC（human umbilical cord MSC，hUCMSC）具有更强的增殖能力，其独特的多潜能特性能在体外保留更长时间，因此成为干细胞研究的重要来源。
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人脐带间充质干细胞分离培养条件的优化及其生物学特
性
人脐带间充质干细胞（Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells, WJ-MSCs）是一种从人脐带Wharton's jelly（脐带的一部分）中
分离得到的多潜能干细胞，具有广泛的应用前景。
为了实现其在临床治疗
和组织工程领域的应用，对人脐带间充质干细胞的分离培养条件进行优化
并探究其生物学特性非常重要。
首先，人脐带间充质干细胞的分离需要选择合适的酶消化条件。
常用
的酶消化方法包括胰蛋白酶（trypsin）、胎牛血清（FBS）和DNase I。
优化的酶消化条件应考虑到最大程度地保持干细胞的完整性和生物学特性，同时实现高细胞产量。
研究发现，使用胰蛋白酶和DNase I混合消化能够
有效分离人脐带间充质干细胞，但酶的浓度和消化时间需要进行调控。
其次，培养基的配方也是优化人脐带间充质干细胞培养条件的重要步骤。
常用的培养基包括DMEM/F12和α-MEM，含有10%的胎牛血清和一些
生长因子，如bFGF（basic fibroblast growth factor）。
优化的培养
基应该能够维持干细胞的增殖和多向分化潜能，同时最小化细胞老化和细
胞凋亡。
最近的研究表明，使用serum-free的培养基可以保持干细胞的
稳定性和功能。
此外，生物学特性的研究也是优化人脐带间充质干细胞培养条件的重
要内容。
研究人员通过研究干细胞的表面标记物、基因表达和细胞功能等
方面来了解其特性。
人脐带间充质干细胞具有多向分化潜能，可以分化成
脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞等。
此外，它们还具有抗炎、免疫调节和组
织修复能力。
这些特性对于人脐带间充质干细胞的应用具有重要意义。
总之，优化人脐带间充质干细胞的分离培养条件和研究其生物学特性是实现其临床应用的基础。
通过合理选择酶消化条件和培养基配方，可以最大限度地保持干细胞的完整性和生物学功能。
此外，深入了解其生物学特性有助于发现其潜在的治疗机制和应用价值。
未来，进一步的研究还需要解决人脐带间充质干细胞的纯度、扩增能力和长期稳定性等问题，以推动其在临床和生物医学领域的广泛应用。