纸片法(KB)药敏实验原理及实际操作方法

纸片扩散药敏试验的原理：将含药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。药敏试验根据美国临床标准委员会(NCCLS) 推荐的K–B 琼脂法进行。本实验通过纸片药敏试验法观察多酸化合物对细菌有无抑制作用，为试管二倍稀释法提供有效基础数据。

用无菌棉拭子蘸取已经校正的0.5 麦氏比浊浓度的菌液，挤掉多余菌液。用棉拭子涂布整个MH 培养基表面，每次将平板旋转60°，涂抹三次，最后沿周边擦绕两圈，以保证菌液涂抹均匀。待平板上的水分被琼脂完全吸收后贴含药纸片。用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面，纸片一贴后不可再拿起。每个平板贴5 张纸片，纸片间距不少于24 mm，纸片中心距平皿边缘不少于15 mm。在菌接种后15 min 内贴完纸片。将平板反转，37℃恒温孵育18~24 h 后取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径，由平板背面测量最接近的整数毫米数并记录，每个平板各设三个平行组平板，测量抑菌直径时，应取三个平板的平均值为最终结果。抑菌环边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。

每次药敏试验用大肠杆菌ATCC25922 和金黄色葡萄球菌ATCC25923 做质控。药敏判读标准根据CLSI 标准(2009 年) 所载受试药对质控菌的抑菌环直径范围作为实验质控标准（判读标准见表5-2）[84]。

表5-2 纸片扩散法－用质控菌株抑菌环直径(mm)允许范围监测抗菌药物敏感性试验准确

性

Table 5-2 Disc diffusion test －according the admissible range of quality-control strain’s

inhibition zone diameter to monitor the accuracy of antibiotics susceptibility test (mm)

抗菌药物纸片含药量

（µg）

抑菌环直径(mm)

S I R

大肠埃希菌

ATCC25922

金黄色葡萄球菌

ATCC25923

KF 30 ≥1815–17 ≤1416–22 27–35 AMP 10 ≥1714–16 ≤1328–35 27–28 CIP 5 ≥2116–20 ≤1530–40 22–30 NOR 5 ≥1713–16 ≤1215–21 29–37 KF: 头孢噻吩；AMP: 氨苄西林；CIP: 环丙沙星；NOR: 诺氟沙星；S: 敏感；I: 中介；R: 耐药