人脑胶质瘤干细胞的体外培养及鉴定

新疆医学２０１２年第４２卷　论著·　免疫磁珠法分选人脑胶质瘤干细胞的体外培养及鉴定　

张永辉昝向阳　李敏李大志蔡宁　于晓晨林琳　

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摘要　目的：旨在从人脑胶质瘤组织和细胞株中分离脑胶质瘤干细胞、进行体外培养并对其干细　胞特性加以鉴定，以期对后续个体化敏感药物化疗奠定基础。方法：采用以ＣＤ１３３为标志的免疫磁珠　法从人脑胶质瘤组织和细胞株中分离脑胶质瘤干细胞并进行体外培养，通过免疫荧光技术检测干细胞　标志物ＣＤ１３３、Ｎｅｓｔｉｎ，干细胞特性加以鉴定。结果：新鲜人脑胶质母细胞培养得到悬浮生长的肿瘤干　细胞球，其能在体外自我更新、增殖，形成新的克隆性细胞球，保持连续稳定的传代，能表达神经千细胞　表面标志物ＣＤ１３３。在含血清培养基中能够分化为与原肿瘤组织相似的贴壁生长的细胞。结论：胶质　母瘤细胞株中存在的一小部分ＣＤ１３３＋胶质瘤细胞具有干细胞的属性，并能稳定传代增生。　关键词免疫磁珠法；脑胶质瘤干细胞；培养；鉴定　

Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｌｉｏｍａ　Ｓｔｅｍ　ＣｅＨｓ　ｗｉｔｈ　Ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｂｅａｄｓ　ＺＨＡＮＧ　Ｙｏｎｇｈｕｉ　，ＺＯＵ　Ｘｉａｎｇｙａｎｇ　，ＬＩ　Ｍｉｎ　，ＬＩ　Ｄａｚｈｉ　，ＣＡＩ　Ｎｉｎｇ　，ＹＵ　Ｘｉａｏｃｈｅｎ　，ＬＩ　Ｍｉｎ２ＬＩＮ　

Ｌｉｎｌ’　（１．Ｔｈｅ　４ｔｈ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆＸｉｎｊｉａｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕｒｕｍｑｉ，８３００５４，Ｃｈｉｎａ　ＺＨＡＮＧ　Ｙｏｎｇｈｕｉ，　ＺＯＵ　Ｘｉａｎｇｙａｎｇ，ＬＩ　Ｄａｚｈｉ，ＣＡＩ　Ｍ　，ＹＵ　Ｘｉａｏｃｈｅｎ，ＬＩＮ　Ｌｉｎ；２．Ｔｈｅ　１ｓｔ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆＸｉｎｊｉａｎｇ　Ｍｅｄｉ—　ｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕｒｕｍｑｉ，８３００５４，Ｃｈｉｎａ　．Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　Ａｕｔｈｏｒ）　ＡＢＳＴＲＡＣＴ　ＢＡＣＫＧＲＯＮＤ＆ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ：Ｔｏ　ｓｏｒｔ　ｂｒａｉｎ　ｇｌｉｏｍａ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ（ＢＧＳＣｓ）ｆｒｏｍ　ｇｌｉｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ａｎｄ　ｆｒｅｓｈ　ｇｌｉｏｍａ　ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ，ｃｕｌｔｕｒｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｉｔｓ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ　ａｓ　ａ　ｓｔｅｍ　ｃｅｉｌ．ＭＥＴＨＯＤＳ：ＢＧＳＣｓ　ｗｅｒｅ　ｓｏｒｔｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｒｔｉｎｇ（ＭＡＣＳ，ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂｅａｄｓ　ｍａｒｋｉｎｇ　ｂｙ　ＣＤ１３３）ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ，ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ　ａｓ　ａ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｍａｒｋｅｒ８（ＣＤ１３３　ａｎｄ　Ｎｅｓｔｌｎ）ａｎｄ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｍａｒｋｅｒｓ．ＲＥＳＵＬＴＳ：Ｏｎｌｙ　ａ　ｓｍａｌｌ　ｓｕｂｓｅｔ　ｏｆ　ＣＤ１３３＋ｇｌｉｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｇｌｉｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ａｎｄ　ｆｒｅｓｈ　ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ　ｆｒｏｍ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ　ｇｒａｄｅ　ｃｏｕｌｄ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｍａｒｋｅｒｓ　ＣＤ１３３　ａｎｄ　Ｎｅｓｔｉｎ，ｖｉｅｗ　ｕｌｔｒａ—　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ａ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ａｎｄ　ｂｅ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｏｆ　ｓｅｒｉａｌ　ｐａｓｓａｇｅ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ．ｔｈｅｙ　ｃａｎ　ｇｅｎｅｒａｔｅ　ａｎｄ　ｆｏｒｍ　ｔｕｍｏｒｓ　ｔｈａｔ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ　ｒｅｓｅｍｂｌ　ｔｈｅ　ｔｕｍｏｒ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｐａｔｉｅｎｔ．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ：Ｔｈｅ　ｓｍａｌｌ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＤ１　３３＋ｇｌｉｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｇｌｉｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ａｎｄ　ｆｒｅｓｈ　ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ　ｆｒｏｍ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ　ｇｒａｄｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｉｓ　ＢＧＳＣｓ．ＳＯ　ｃａｌｌｅｄ　ａｓ　ｔｕｍｏｒ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｇｌｉｏｍａ．　ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ　ＭＡＣＳ；ＢＧＳＣｓ；Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　

作者单位：８３００５４新疆鸟鲁木齐新疆医科大学第四附属医院（张永辉，咎向阳，李大志，蔡宁，于晓晨，林琳）　８３００５４新疆乌鲁木齐新疆医科大学第一附属医院（李敏）　通讯作者：林琳　１８　目前，胶质瘤干细胞的分离多采用酶消化法，　也有用长期选择性培养筛选得到肿瘤干细胞，虽　然均可成功从胶质瘤中分离、培养出肿瘤干细胞，　但其步骤烦琐，耗时长，且纯度得不到保证，我们　改进了脑肿瘤干细胞的分离方法，用免疫磁珠分　选法分选出高纯度的ＣＤ１３３＋细胞，成功培养出　胶质瘤干细胞，方法简便，成功率较高，现报道如　下。　１资料与方法　１．１　标本来源　标本６例均来自新疆医科大学第四附属医院　神经外科于２００８年１２月～２０１０年经术后病理　证实为胶质母细胞瘤患者，在新疆医科大学第一　附属医院细胞室完成细胞培养。　１．２主要试剂　ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培养基、胎牛血清、２％　Ｂ２７、表皮生长因子（ＥＧＦ）、成纤维细胞生长因子　（ｂＦＧＦ）、红细胞裂解液、兔抗人巢蛋白（Ｎｅｓｔｉｎ）、　兔抗人胶质纤维酸性蛋白质（ｇｌｉａｌ　ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ　ａｃｉｄｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＡＰ）、二抗异硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ）标记　羊抗兔免疫球蛋白（Ｉｇ）、免疫磁珠（ＣＤ１３３间接　标记）。　１．３实验方法　１．３．１胶质瘤干细胞分离与培养均于术中取　肿瘤深部无囊变、无坏死的瘤组织块置于盛有　Ｈａｎｋ　ｓ液的小瓶中备用。在平皿中用Ｈａｎｋ　８液　冲洗肿瘤组织块２～３次，无菌条件下用眼科剪剪　成约ｌ　ｍｍ　大，吸管反复吹打，悬液过４００目细胞　筛后１　０００　ｒ／ｍｉｎ离心５　ｍｉｎ。离心管中留２　ｍｌ上　清液，作用３　ｒａｉｎ，１　０００　ｒ／ｍｉｎ离心５　ｍｉｎ，除去上　清液。收集细胞　，染色法计数活细胞数。然　新疆医学２０１２年第４２卷　后分为两组，一组用少量缓冲液（０．５％牛血清白　蛋白、２　ｍＭ乙二胺四乙酸，ｐＨ　７．２的磷酸盐缓　冲溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＰＢＳ），　０．２２　ｍ过滤除菌，保持４￣Ｃ一８￣Ｃ）充分混悬细　胞（按０．３　ｍｌ／１×１０８细胞浓度即可），加入　ＣＤ１３３抗体包被的超微磁珠，混匀后置４￣Ｃ孵育　３０　ｍｉｎ。将分离柱安装人磁场中，加人０．５　ｍｌ缓　冲液，在重力作用下自然流尽，以预处理分离柱。　将孵育完的细胞悬液加到分离柱中，自然流尽。　洗柱两次。从磁场中取下分离柱，插在管口，加１　２　ＩＩｌｌ的缓冲液，用针芯推尽液体，冲出阳性结　合的细胞，用无血清培养基洗一次，离心１０００　ｒｐｍ，５　ｍｉｎ，接种到含ＥＧＦ（２０　ｎｇ／ｍ１），ｂＦＧＦ（　２０　ｎｇ／ｎ￣），ＵＦ（１０　ｎｇ／ｍ１），ｂ２７（ｉｘ）的无血清培　养基中，置人３７℃，５％ＣＯ　，饱和湿度培养箱中　培养，对照组台盼蓝染色计数后不进行磁珠分选，　直接接种到上述培养基中。两组视具体情况每２　４　ｄ换液一次。　１．３．２胶质瘤干细胞的鉴定分别取第３代活　力良好的细胞球，植入经多聚赖氨酸包被的玻片　上，３７℃晾干，用ＰＢＳ反复漂洗３次，每次１Ｏ　ｒａｉｎ，以除去残存培养基，室温下４％多聚甲醛固　定３０　ｍｉｎ，ＰＢＳ洗３次，５％山羊血清封闭液３７ｏＩ＝　封闭３０　ｍｉｎ，加人巢蛋白（１：２ｏｏ）一抗，于湿盒内　４￣Ｃ过夜，次日ＰＢＳ冲洗后加人ＦＩＴＣ标记二抗　（１：５ｏ），３７ｃ【＝孵育３０　ｍｉｎ，ＰＢＳ漂洗３遍后，显微　镜下镜检。　１．３．３诱导分化及免疫细胞化学鉴定　取第三　代活力良好的细胞球，轻轻吹打后。植入预先放有　多聚赖氨酸包被好的盖玻片的６孔板中，用含　１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ／ＦＩ２（Ｉ：１）培养液培养５　力；应用特异标志物分选目标细胞是近年来兴起　并逐渐推广的技术，常用的有免疫磁珠分选术　（ＭＡＣＳ）和流式细胞分选术（Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｒｔｉｎｇ，ＦＡＣＳ），它们基于抗体对　抗原的特异性识别，将磁性微珠或荧光染料直接　或者间接偶联在特异抗体上与细胞相连，再利用　磁力学（ＭＡＣＳ）或荧光识别（ＦＡＣＳ）技术将相　应的目标细胞分离出来，从而达到迅速富集目标　细胞的目的，可以大大加快实验进程，因而逐渐　为众多研究这采用。我们以ＣＤ　１３３为标志，经　用免疫磁珠法分选后，从６例脑胶质母细胞瘤组　织新鲜手术标本质瘤细胞株中成功地分离获得了　含较高比例ＣＤ　１３３＋细胞的标本，通过分选达到　了迅速富集ＣＤ　１３３＋细胞的目的，但该类方法　前期购买磁珠或荧光染料交联的特异抗体投入相　对较大。　本研究采用免疫磁珠法成功进行纯度较高的　胶质母细胞瘤干细胞培养，建立了理想的胶质瘤　细胞体外试验模型，为进一步深入研究胶质瘤的　生物学特性、体外药物敏感性试验来快速筛选化　疗药物、实现个体化化疗奠定了实验基础。　参考文献　［１］Ｃｌａｕｓ　Ｅ　Ｂ，Ｂｌａｃｋ　Ｐ　Ｍ．Ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅｓ　ａｎｄ　ｐａｔ—　ｔｅｒｎｓ　ｏｆ　ｃａｒｅ　ｆｏｒ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｄｉａｇｎｏｓｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｕｐｒａｔ—　ｅｎｔｏｒｉａｌ　ｌｏｗ　－ｇｒａｄｅ　ｇｌｉｏｍａｓ：Ｄａｔａ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ＳＥ—　ＥＲ　ｐｒｏｇｒａｍ，１９７３—２００１［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ，２００６；　１０６：１３５８—１３６３．　［２］Ｂｏｎｎｅｔ　Ｄ，Ｄｉｃｋ　Ｊ　Ｅ．Ｈｕｍａｎ　ａｃｕｔｅ　ｍｙｅｌｏｉｄ　ｌｅｕ．　ｋｅｍｉａ　ｉｓ　ｏｒｇａｎｉｚｅｄ　ａｓ　ａ　ｈｉｅｒａｒｃｈｙ　ｔｈａｔ　ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ　ｆｒｏｍ　ａ　ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｃｅｌｌ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ　堑墅　堂　生箜垒　鲞　Ｍｅｄ，１９９７；３（７）：７３０－７３７．　［３］Ｍａｔｓｕｉ　Ｗ，Ｈｕｆ　Ｃ　Ａ，Ｗａｎｇ　Ｑ，ｅｔ　ａ１．Ｃｈａｒａｅ·　ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｍｙｅｌｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ，２００４；１０３（６）：２３３２－２３３６．　［４］Ａｌ—Ｈａｊｊ　Ｍ，Ｗｉｃｈａ　Ｍ　Ｓ，Ｂｅｎｉｔｏ—Ｈｅｍａｎｄｅｚ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒｉｇｅｎ－　ｉｃ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｉｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，２００３；１００（７）：３９８３—３９８８．　［５］Ｓｉｎｇｈ　Ｓ　Ｋ，Ｃｌａｒｋｅ　Ｉ　Ｄ，Ｔｅｒａｓａｋｉ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｉｄｅｎ一　‘ｔｉｆｉｃａｆｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｃａｎｃｅｒ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｂｒａｉｎｔｕ—　ｍｏｒｓ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２００３；６３（１８）：５８２１—　５８２８．　［６］Ｋｏｎｄｏ　Ｔ，Ｓｅｔｏｇｕｃｈｉ　Ｔ，Ｔａｇａ　Ｔ．Ｐｅｍｉｓｔｅｎｃｅ　ｏｆ　ａ　ｓｍａｌｌ　ｓｕｈｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｎｃｅｒ　ｓｔｅｍ　ｌｉｋｅ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃ６ｇｌｉｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｄ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，２００４；１０１（３）：７８１—７８６．　［７］姜晓兵，周风，姚东晓，等．人脑胶质瘤干细　胞的培养及鉴定［Ｊ］．脑与神经疾病杂志，　２ｏ０５，１３（１）：６—８．　［８］Ｓｉｎｇｈ　Ｓ　Ｋ，Ｈａｗｋｉｎｓ　ｃ，Ｃｌａｒｋｅ　Ｉ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｉ—　ｄｅｎｆｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｂｒａｉｎ　ｔｕｍｏｒ　ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ　ｃｅＵｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００４；４３２（７０１５）：３９６—　４０１．　［９］尹昌林，杨辉．脑胶质瘤干细胞的研究进展　及应用前景［Ｊ］．中国微侵袭神经外科杂志，　２００６，１１（８）：３７０—３７３．